Relatório Aula Prática de Bioquímica- Aminoácidos

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BQI 202 - LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA ESTRUTURAL 
 
 
 
 
 
 
TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE UM AMINOÁCIDO; SEPARAÇÃO E 
IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
 
 
 
 
 
 
 
Profª JULIANA LOPES RANGEL FIETTO 
JHENIFER CAROLINE – 92471 
PAULO EDUARDO – 90768 
LARISSA NEVES – 89357 
 
 
 
 
 
 
 
05/10/2018 
VIÇOSA MG 
1 INTRODUÇÃO 
A análise cromatográfica em papel se baseia na diferença de solubilidade 
entre a fase polar e apolar, sendo a fase estacionária polar, água ligada á 
celulose; e a fase móvel, solvente orgânico apolar. A fase móvel irá se deslocar 
,arrastando parte das substâncias contidas na amostra a depender de sua 
polaridade. A identificação das substâncias de uma mistura é feita a partir da 
divisão entre a distância percorrida pela substância e distância percorrida pela 
fase móvel, interação entre os componentes da amostra e a fase apolar; o 
quociente é denominado fator de retenção. A análise cromatográfica em papel é 
uma técnica qualitativa e fornece apenas a natureza, obtida pela comparação 
entre o fator de retenção experimental e tabelado, das substâncias contidas na 
amostra. 
Aminoácidos são constituídos por dois grupos funcionais, o amínico (-
NH2) e o carboxílico (COOH), podendo agir como ácidos (doador de prótons), 
ou base (receptor de prótons) e possui a capacidade de agir como tampões, o 
tamponamento ocorre quando doador e aceptor se apresentam em quantidades 
iguais. Através da titulação é possível observar os intervalos de atuação do 
tampão, ou seja, valores em que o pH da solução é mantido sem grandes 
variações; a observação das curvas de titulação permite o cálculo do pKa ou 
constante de dissociação ácida. Para os ácidos fracos, parcialmente ionizado 
para liberar o próton, o valore de pKa é obtido no ponto central da curva de 
titulação onde as formas protonadas e desprotonadas apresentam valores 
iguais, portanto o pH se iguala numericamente ao pka. A prática objetiva a 
determinação de uma amostra de aminoácido desconhecida com base na 
analise comparativa entre os valores de pH e pKa obtidos experimentalmente, 
com os valores tabelados fornecidos, uma vez que os ácidos apresentam valores 
diferentes de pKa. 
 
2 OBJETIVO 
1. Identificar o aminoácido correspondente à amostra X por meio da 
cromatografia de papel. 
Objetivo específico: 
• Preparar um sistema adequado para a execução experimental de 
cromatografia dos aminoácidos ácido aspártico, isoleucina, alanina e amostra X 
• Executar as operações necessárias à cromatografia ascendente 
• Revelar o cromatograma 
• Identificar o aminoácido da amostra X por meio do fator de retenção 
2. Titulação e identificação de aminoácido desconhecido. 
Objetivo específico: 
• Titulação de aminoácido desconhecido 
• Determinar o Pka experimental da amostra 
• Identificar, por comparação com os valores tabelados, o 
aminoácido correspondente à amostra. 
 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Vidrarias e Utensílios 
 
• Papel Whatman nº 1 (15 x 20 
cm) 
• Forro de papel 
• Cuba cromatográfica com 
tampa 
• Tubos capilares 
• Pulverizador 
• Estufa ajustada a 100°C 
• Lápis 
• Régua 
o Béqueres 
o Funil 
o Bureta 
o Pipeta 
 
 
 
 
o Agitador 
o Barra magnética 
o Potenciômetro e eletrodo 
combinado 
 
REAGENTES 
• Solução de aminoácido 0,1 mol 
L-1 (alanina, ácido aspártico, 
isoleucina e mistura X) 
• Solvente misto: n-butanol: ácido 
fórmico: água (100: 30: 25) 
• Revelador: Solução de ninidrina 
0,1% em acetona 
o Solução de glicina 0,1 mol L-1 
o Solução de NaOH 0,5 mol L-1 
o HCl concentrado 
 
Métodos 
Primeiramente, referente a prática sobre identificação de aminoácidos por 
cromatografia em papel, para identificar os aminoácidos por cromatográfia em 
papel um dos integrantes foi convidado a realizar a primeira parte do 
experimento, sendo necessário a utilização de luva para se manusear o papel 
pois caso contrário os aminoácidos presentes em nossas mãos poderiam 
interferir no teste, dando prosseguimento, foi nos fornecido um papel retangular 
(de material semelhante aos utilizados para se coar café) e no mesmo traçado 
com um lápis (pois a tinta da caneta pode interferir) uma linha horizontal com 
2,5cm de espessura na borda cujo lado é maior e depois dividido em 4 partes 
com 2cm entre si, então em cada parte foi identificado o composto a ser plicado 
no mesmo (ácido aspártico, isoleucina, prolina e mistura X respectivamente), 
assim utilizando um capilar foi posto em cada divisão um pouco de cada 
composto exatamente para quando for identificar não ocorrer de sobrepor uns 
aos outros. Após terminado a aplicação, foi dobrado a folha em formato cilíndrico 
e posto a mesma na cuba cromatográfica de forma que não encostasse na 
parede do recipiente contendo o solvente previamente saturado no qual por fim 
foi vedado e deixado por volta de uma hora até que pudesse retirar o papel e o 
por na estufa até secar completamente, então, utilizando o pulverizador foi 
aplicado o revelador em toda superfície do papel e levado a estufa novamente, 
por fim, foi observado os resultados (anexo 1). 
Assim, durante a uma hora de espera para finalização da cromatografia 
foi dado início a outra prática relacionada a titulação potenciométrica de um 
aminoácido onde após separado o material a ser utilizado foram medidos 50 mL 
de glicina em um béquer grande e montou-se o equipamento da melhor forma 
possível (anexo 2), então, adicionado ácido clorídrico concentrado até o pH ser 
igual a um. Após preparado o sistema, foi titulado uma solução de glicina com 
hidróxido de sódio de 1 em 1 mL e por fim anotado os valores de pH obtidos. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
O aminoácido titulado foi a histidina um aminoácido básico (em relação ao 
pH) devido à sua cadeia lateral aromática de nitrogênio heterocíclico. O radical 
da histidina consiste em um carbono e um núcleo imidazol. A literatura define o 
pk de α-COOH = 1,82, o grupo amino com pk de α-NH3+ = 9,17 e o grupo R com 
pk de R = 6,0. Com o resultado da titulação é possível criar uma curva de 
titulação fomentando uma discussão. Essa curva será a relação entre a carga 
líquida e o pH do aminoácido possibilitando estudo sobre ele. Na curva haverá 
um ponto de inflexão entre duas etapas, nesse há a ausência de carga líquida 
sendo assim, denominasse um ponto isoelétrico da Histidina em termos teóricos 
terá o valor de 7,59 considerando a média aritmética entre o pk do grupo amina 
e o pk do grupo imidazol. Analisando a curva, torna-se evidente que a Histidina 
possui carga líquida negativa a qualquer pH acima do seu PI e carga líquida 
positiva abaixo do seu PI. Além disso, é notório a presença de três faixas 
tamponantes com o pH próximo ao pk de α-COOH, pk de α-NH3+ e o pk de R. 
É possível observar também que no pH 1,82 a Histidina apresenta em 50% o 
grupo carbonila na forma protonada e 50% na forma desprotonada; em pH= 6,0 
apresenta 50% do Nitrogênio do grupo R na forma protonada e 50% na forma 
desprotonada, semelhantemente ocorre com o grupo amina em pH=9,17. 
 
Figura 1- Espécies Iônicas da Histidina 
 
Fonte: Princípios de bioquímica de Lehninger 
 
Gráfico 1- Curva de Titulação da Histidina 
 
 
Tabela 1- Comparações valores teóricos e práticos 
pKa TEÓRICO OBSERVADO 
1 1,82 1,87 
2 6,0 5,97 
3 9,17 9,01 
 
Na cromatografia os aminoácidos foram identificados através do cálculo 
da distância de locomoção devido à reação de polaridade entre os aminoácidos 
e os solventes. O solvente é composto por n-butanol: ácido fórmico: água. O 
pk1 = 1,87
pkr = 5,97
pk 2= 9,010
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35 40
p
H
ml de NaOH
soluto (com aminoácido) moveu- se na direção do fluxo do solvente. Após a 
revelação cromatográfica, medimos a distância percorrida por cada aminoácido 
e os Rfs obtidos encontram-se na tabela: 
 
Tabela 2- Relação Rf aminoácidos-padrão e desconhecido. 
Aminoácidos-padrão Rf Aminoácido desconhecido Rf 
Aspastato 0,07 X 0,12 e 0,57 
Isoleucina 0,59 
Prolina 0,11 
 
Figura 2 -Aminoácidos envolvidos na cromatografia 
 
 
O aspartato possui um grupo R carregado com carga negativa, portanto 
polar. A alanina é apolar (hidrofóbica e sem carga), ambos tiveram um 
deslocamento menor que a isoleucina que também possui um grupo R apolar. 
Como o ácido fórmico protona os aminoácidos, após o papel de filtro com as 
amostras entrar em contato com a solução da fase móvel, através da 
avaliação dos resultados obtidos na cromatografia, foi possível observar que a 
carga assumida pelos aminoácidos aspartato e a alanina (maior carga liquida 
positiva) permite que eles interajam mais com a água contida no papel de filtro, 
fase estacionária o que explica o menor deslocamento em relação a isoleucina 
No experimento foi proposto uma amostra desconhecida para que 
possamos descobrir qual o aminoácido em questão através do cálculo de seu 
Rf: 
 
 
 Desse modo, foi possível concluir que a amostra desconhecida se tratava de 
uma mistura de aminoácidos que participaram da cromatografia, a isoleucina e 
a prolina. 
 
CONCLUSÃO 
Referente à prática Separação e identificação de aminoácidos por 
cromatografia em papel, conclui-se que o método utilizado apresentou resultado 
satisfatório que permitiu a correta identificação da amostra X como uma mistura 
de isoleucina e alanina. A prática de Titulação potenciométrica de um 
aminoácido, demostrou a eficiência do método utilizado na identificação correta 
da Histidina, com base nos valores de Pka obtidos experimentalmente quando 
comparados aos valores tabelados. 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
 
LEHNINGER, A.L.; NELSON D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 
6. Ed. São Paulo: Sarvier, 2014. 
DE QUEIROZ, José Humberto (Org.). Práticas de bioquímica. 6. ed. 
Viçosa: UFV, 2014. 120 p. 
 
ANEXOS 
 
Anexo 1
 
 
Anexo 2