Aula 1 DNA-RNA

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DNA e RNA
Replicação – Transcrição – Tradução
Introdução à Biologia Molecular
Alexandre Havt
Estrutura dos Ácidos Nucléicos
� Moléculas com informações para a síntese 
de proteínas
� DNA – armazém ou biblioteca celular
� Contém informações para a construção 
das células e tecidos
� Duplicação dos genes garante a 
perpetuação das espécies
� Transcrição – síntese de RNA
� RNA mensageiro (mRNA)
� RNA transportador (tRNA)
� RNA ribossômico (rRNA)
� Tradução – síntese de proteínas a partir das 
informações dos RNAs
� Descoberta da estrutura do DNA em 1953
Watson e Crick 
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA
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Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA
RNA ribossômico - rRNA
� Ribossomos
� Procariotos
� Citoplasma 
� Mitocôndrias
� Procariotos
� 3 tipos de moléculas de rRNA
• 16S + 21 proteínas – 30S
• 23S
• 5S
� Citoplasma de eucariotos
� 4 tipos de moléculas de rRNA
• 18S + 33 proteínas – 40S
• 5S
• 28S
• 5,8S
� Mitocondriais
� 55S 
• Propriedades similares ao das 
bactérias
Eucariotos
+34 proteínas – 50S
70S
+50 proteínas – 60S
80S
RNA transportador - tRNA
� Função
� Transportar aminoácidos para 
a síntese protéica
� Assegurar a incorporação dos 
mesmos na posição correta
• anticódon 
� Células com pelo menos 20 tRNA
� Pequenas moléculas
� 80 nucleotídeos
� 4S
� Formados por blocos monoméricos 
� RNA e DNA
• 5 Nucleotídeos
� Proteínas 
• 20 aminoácidos
� Monômeros adicionados 1 por vez
� Cadeia de formação tem ponto de partida específico com 
crescimento unidirecional para um terminal fixo
� Direção 5´ - 3´
� Produto primário é frequentemente modificado
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e 
Proteínas
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e 
Proteínas
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Replicação do DNA
Replicação do DNA
� Duplicação do material genético para a divisão celular
� Replicação é semiconservativa
• Uma fita parental e uma nova fita sintetizada
� Forquilha de replicação 
� Helicases - Separação das duplas fitas
� Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação
� Primase – síntese de iniciador
� Topoisomerase
• Desenrolam supertorção
� Ligases – união dos fragmentos de Okasaki
� DNA polimerases
• α - associação com primase para formação do iniciador 
• δ - polimerização das fitas líder e lenta
• γ - polimerização DNA mitocondrial
• β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo
Replicação do DNA Eucariótico
Síntese de RNA
Transcrição 
Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA
� RNA polimerases devem reconhecer 
� O ponto de início da transcrição 
� Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita
� Região promotora do DNA
� Controla a ligação da RNA polimerase
� Identifica o ponto de início da transcrição
� Controla a frequência da transcrição
• Sequências regulatórias no promotor
• Sequências perto do promotor
• Reforçadores 
Interagem com proteínas que estabilizam
a ligação RNA-polimerase ao promotor
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Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico
Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos
Síntese de proteínas
Tradução
Síntese Protéica - Tradução
� Ocorre nos ribossomos – rRNA
� Direcionado pela sequência dos códons 
de mRNA
� Cada tRNA traz um aminoácido 
específico ao seu anticódon
� Aminoacil-tRNA
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Código Genético
GGlyGluAlaVal
AGlyGluAlaVal
CGlyAspAlaVal
UGlyAspAlaValG
GArgLysThrMet
AArgLysThrIle
CSerAsnThrIle
USerAsnThrIleA
GArgGlnProLeu
AArgGlnProLeu
CArgHisProLeu
UArgHisProLeuC
GTrpParadaSerLeu
AParadaParadaSerLeu
CCysTrySerPhe
UCysTyrSerPheU
(3’)GACU(5’) 
Terceira baseSegunda basePrimeira base
Formação do aminoacil-tRNA
� Aminoacil-tRNA
� tRNA ligado covalentemente a um 
aminoácido na terminação 3’
� Cada aminoácido com seu tRNA
• Alanil-tRNAala
• Metionil-tRNAimet
� 20 Aminoacil-tRNA-sintetases
� Processo dependente de ATP
� Ocorre em 2 passos
• Formação do complexo:
� enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato
• Transferência do aminoácido ativo
� Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose
� Nucleotídeo de adenina (CCA)
Processo da Tradução
� Envolvimento de 3 passos
� Iniciação
� Alongamento
� Terminação
Iniciação
Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação
� Códons de parada 
� Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com 
• UAA
• UGA
• UAG
� Fatores de liberação unem-se ao ribossomo
� Hidrólise da ligação peptidiltransferase
• Cadeia peptídica
• tRNA
� Peptídeo sintetizado é liberado
� Dissociação das subunidades do ribossomo
• Liberação do mRNA
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Polissomos
� Ligação de vários ribossomos ao mRNA
� Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA
� Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos
Técnicas de Biologia Molecular
� Reação de Polimerase em Cadeia – PCR
� Função - Multiplicação de trecho específico de DNA
• Problema – análise de ácidos nucleicos
�Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos
� Primers
� Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus)
• Enzima termoestável em temperatura até 117 °C
• Temperatura ótima 72 °C
� Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas
� 1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in 
Enzymology
� 1989 – primeiro termociclador
� 1994 – Nobel em química para Karis Mulis
Karis Mulis
Técnicas de Biologia Molecular
� Fundamentos do PCR
� Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C
� Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer)
� Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C
� Reagentes essenciais
� Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM 
DTT, 50% glicerol
� Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl
� Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima
� Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s 
iguais
� Primers específicos à sequência que se deseja amplificar
Técnicas de Biologia Molecular
� Vídeo da reação de PCR
Técnicas de Biologia Molecular
� Fundamentos da Transcriptase Reversa
� Vírus de RNA tipo VI 
• Enzima transcriptase reversa
• Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA
�AMV - Vírus da Mieloblastose aviária
�M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)
� Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do 
mRNA
� Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA)
� Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
mRNA
cDNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
mRNA
cDNA
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA
cDNA
RNAse I
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA
cDNA
PCR
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Técnicas de Biologia Molecular
� Isolamento de RNA
� Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível –
evitar RNAse
� Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg)
� Método muito utilizado Reagente TRIZOL 
Isolamento de RNA por TRIZOL
� Fenol + Isotiocianato de guanidine
� Membranas celulares e nucleares destruídas
� Manutenção da integridade do RNA
� Maceração da amostra com TRIZOL
� Clorofórmio – separação em 3 fases
� RNA – sobrenadante
� DNA – camada intermediária
� Protéinas – camada inferior
� Precipitação com Isopropanol
� Lavagem com Etanol 75%
� Leitura em espectrofotômetro
� 260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL])
� Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( ≅ 2,00)
Amostra 100 mg
+
1 mL de TRIZOL
Homogeneizar • Centrifugar 12.000 g 10 min. 2- 8 °C• Remover 
sobrenadante p/ novo 
tubo
• Acrescentar 200 uL
de clorofórmio
� Vórtex por 15 sec.
� Incubar RT °C p/ 2-3 
min
� Centrifugar 12.000 g p/
15 min
• Remover sobrenadante
transparente para novo 
tubo
• Acrescentar 500 uL de 
isopropanol
• Incubar RT °C 10 min
• Centrifugar 12.000 g p/
15 min à 2 – 8 °C
• Descartar sobrenadante 
• Acrescentar 3x 1mL de 
etanol 75%
• Centrifugar 3x a 7.500 g 
por 5 minutos à 2 – 8 °C
• Descartar 3° sobrenadante
• Evaporar etanol 
•Solubilizar pellet com 
ddH2O autoclavada
•Leitura espectrofotômetro
Análise por Eletroforese 
� Principio básico
� O DNA tem carga negativa
� Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o 
catodo
� Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-
o por tamanho
• Moléculas menores migram mais rápido
• Moléculas maiores migram mais lento
� A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de 
tamanho conhecido
Análise por Eletroforese 
� Principio básico
� Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão 
eletrolítico
• Tris-Acetato-EDTA – TAE
• Tris- Borato-EDTA
• Solubilização do gel por esfriamento
� Aumento da viscosidade da amostra com glicerol
� Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue
� Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo
Cuba de Eletroforese Horizontal
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