EXTRAÇÃO DO DNA DE BANANA 2

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EXTRAÇÃO DO DNA DE BANANA
INTRODUÇÃO
O Ácido Desoxirribonucléico (DNA) é uma macro molécula orgânica que contém as informações genéticas e está presente em todos os seres vivos, com exceção apenas de alguns RNA-vírus. É formado por uma base nitrogenada, uma pentose e um grupo fosfato. Essa importante molécula contém as informações básicas para a formação de um ser vivo e para que ele possa se reproduzir e age orientando a célula na produção de proteínas com diversas funções.
Em células eucarióticas, o DNA se encontra no núcleo celular. O processo de extração dos ácidos nucléicos do núcleo requer o rompimento da membrana plasmática e do envoltório nuclear. Esse procedimento ocorre com o uso de detergentes que afetam as interações entre lipídios e proteínas. Após o rompimento das membranas, o conteúdo celular extravasa, ficando em suspensão, sendo extraídas as moléculas de DNA por meio da centrifugação do composto, em presença de solventes orgânicos (ex.: álcool) e íons (ex.: NaCl).
Hoje em dia, a extração e o estudo da molécula de DNA abrangem muitas áreas. Um dos ramos que tem investido nestes estudos é o da agricultura, pois as alterações genéticas em legumes, frutas e verduras, buscando o melhoramento das mesmas contra pragas ou para torna-las mais saborosas e resistentes tem despertado grande interesse. Isso ocorre não apenas em plantas, o estudo e conhecimento desta molécula ajudam a desenvolver técnicas utilizadas na criação de animais para consumo humano ou para criação em residências.
Outra grande aplicação do DNA se encontra na investigação de paternidades e descoberta de crimes, através da decodificação do mesmo. Além de serem aplicados na área medica, na procura por tratamento, prevenção e a cura de doenças. Utilizando procedimentos e instrumentos muito simples é possível extrair o DNA e visualiza-lo sob forma de filamentos brancos.
OBJETIVO
Esta atividade teve como objetivo, extrair o DNA de células de banana, para visualização do material genético, promovendo assim a descoberta da localização do mesmo. Além da aplicação de conhecimentos sobre estrutura da membrana celular.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização do experimento, foram cortadas 10 gramas de banana madura e inseridas em um saco plástico transparente. A fruta foi macerada com as mãos e, após a maceração, 30 ml de solução salina-EDTA (composta por NaCl 15M e EDTA 0,1 m pH=8) e 6ml de SDS 2% foram adicionadas ao saco plástico. Após homogeneizar a mistura, a mesma foi filtrada por uma gaze e o líquido filtrado obtido foi distribuído em dois tubos de ensaio, sendo que cada tubo recebeu 4ml do líquido e mais um tubo extra feito de polipropileno. Logo em seguida, com o auxílio de uma pipeta com capacidade para 5 ml, 4ml de álcool etílico 95% foram adicionados aos tubos de ensaio, lentamente para não ocorrer a mistura dos dois líquidos. Após alguns minutos, um material insolúvel filamentoso forma-se na interface entre os dois líquidos, este material é o DNA. Com a ajuda de um bastão e realizando movimentos circulares, o material filamentoso irá aderir no mesmo. Este precipitado será dissolvido em 2 ml de Tris-EDTA.
Imagem 1: Adição da solução salina-EDTA e SDS 
ao macerado de banana.
No último tubo, de polipropileno, adicionou-se 4ml de uma mistura de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e em seguida foi lacrado. O tubo foi agitado vigorosamente por 10 minutos e depois, seguiu para a centrifugação a 3000 rpm por mais 10 minutos. O resultado é a separação da amostra em três camadas, uma camada superior aquosa contendo tanto DNA quanto RNA, uma fase intermediária contendo proteínas desnaturadas e uma fase inferior orgânica. A camada superior foi coletada e 4 ml de álcool etílico 95% foram adicionados de modo que os dois líquidos não se misturaram. Novamente, formou-se um material insolúvel filamentoso, o DNA. 
Imagem 2: Filtragem da solucão pela gase.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Primeiramente, quando maceramos a banana, tinhamos como objetivo o rompimento componentes celulares como as proteínas, as paredes celulares e a membrana plasmática. Após esse procedimento, filtramos o conteúdo para então separar as paredes celulares e as membranas do conteúdo celular. 
O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) tem a propriedade de ligar cátions divalentes, que são íons que ajudam a manter a integridade da membrana celular e inibe a ação de enzimas DNAses presentes nos lisossomos, portanto quando adicionamos o EDTA as células são desistabilizadas. Além disso esse composto atua nos lipopolissacarídeos e auxilia no equilíbro do Ph durante o experimento, já que o DNA é muito sensível.
Posteriormente, adicionamos o SDS, que é um detergente aniônico que tem a finalidade de lisar as membranas, dissolvendo os fosfolipídeos encontrados na bicamada lipídica, já que os mesmos são hidrofóbicos. Com essa dissolução também obtemos a desintegração os núcleos e os cromossomos das células da banana, e com essa ruptura o DNA e as proteínas se soltam e são dispersadas na solução. 
No primeiro tubo foi realizada a técnica do salting out, que consiste em excluir soluções solúveis em água da fase aquosa por meio de sais. Adicionamos o NaCL e após a sua agitação podemos observar a solução se tornar turva e, algum tempo depois, ocorreu uma leve precipitação, formando duas fases: uma mais densa composta por proteínas, e outra com aparência mais aquosa.
No segundo tubo, onde foi adicionado álcool, observamos a ação da substância nos componentes celulares. Formou- se então uma precipitação de aparencia um pouco diferenciada do tubo com a técnica do salting out. Nesse tubo após a adição do etanol cuidadosamente para não se misturar a solução primária, podemos notar uma precipitação mais límpida que a anterior, porém ainda um pouco turva e com a presença de uma nuvem de DNA na divisão dos dois compostos.
No último tubo, foi realizada a adição do clorofórmio, no qual observamos imediatamente uma precipitação em duas fases, sendo uma densa e turva. Após a centrifugação, podemos observar a precipitação mais límpida que as das outras técnicas, na qual se formou três fases: uma superior de água e DNA, uma intermediária composta por proteínas e a última apenas com o clorofórmio.
Precipitação após a centrifugação dos tubos.
A partir da experimentação dos três tipos de técnicas de extração do DNA, podemos afirmar que a mais eficiente seria a com a adição do clorofórmio. E ele é mais eficiente devido a sua fácil desproteinização, pois as proteínas apresentam uma propriedade hidrófoba que as tornam mais afins de solventes orgânicos.
BIBLIOGRAFIA
DHALIAWAL, A. 2013. Extração e purificação de DNA. Disponível em <http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html> Acesso realizado em: 03/04/2015. 
ROCHA, A. Aula Experimental – Extração do DNA de: Morango, Banana e Uva. Disponível em < http://blog.educacional.com.br/cienciabolacha/2011/10/07/aula-experimental-extracao-do-dna-de-morango-banana-e-uva/> Acesso realizado em 08/04/2015.
OLIVEIRA, M. 2007. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de dna por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. Disponível em < http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf> Acesso realizado em: 03/04/2015. 
PERGUNTAS:
1 – O SDS é um agente detergente que solubiliza lipídeos. Na prática, é utilizado para 
romper as membranas da célula, incluindo a membrana nuclear. 
2- O fenol-clorofórmio permite a extração das proteínas da solução por meio de um solvente orgânico, onde, por diferença de solubilização, os ácidos nucleicos ficam numa fase aquosa na parte superior da solução.
3- O EDTA adicionado logo no início da prática é um agente quelante, que sequestra cátions divalentes, como cálcio e magnésio, cofatores normalmente utilizados pela DNAses e impedindo a ação dessas enzimas e a degradação do DNA.