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Exercício II DNA Recombinante (1)

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CURSO:
	FARMÁCIA
	Nota
	
	Disciplina
	BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA
	Professor
	Augusto Bücker
	Aluno(a)
	
	Data
	
EXERCÍCIO II
1) Suponha que um gene que você deseja clonar está localizado entre 2 sítios de reconhecimento da enzima HindIII. Você deseja clonar este fragmento contendo o gene de interesse no sítio de clonagem de EcoRI no vetor pUC19. Como o DNA e o vetor foram hidrolisados com endonucleases diferentes, que alternativa você sugere para a clonagem do gene?
Para clonar um fragmento em um vetor plasmidial, é necessário clivar o sitio de clonagem do vetor com uma endonuclease presente na região de multiclonagem e o gene de interesse com a mesma enzima de restrição em ambos, ou seja, as enzimas de restrição servem para auxiliar a inserção de um gene de interesse em um vetor através do corte promovido por elas, por isso as mesmas enzimas usadas parra cortar o DNA deve ser do vetor para haver o encaixe perfeito.
Sugere-se hidrolisar o vetor pUC19 com a mesma endonuclease utilizada no DNA, a enzima de restrição HindIII; já que o vetor também possui a região de corte desta enzima.
2) Considere o fragmento de DNA:
5´-AAGAATTGCG│AATTCGACTTAAGGG│CCGCGCCGAAGCTTTAAAGGTTATATTTCC-3’
Quantos fragmentos resultarão da clivagem com as seguintes enzimas e indique o número de pb de cada
fragmento:
EcoRI: ( G¯ AATTC): 1- 10pb; 2-45pb; 
HaeIII: ( GG¯ CC): 1-25pb;2-30pb;
NotI: (GC¯ CCGG): 0
Com as três enzimas juntas: 1-10pb; 2-15pb; 3-30pb 
4) Considerando que mutações podem dar origem a células cancerosas, comente como as seguintes alterações poderiam ser danosas para um organismo:
a) Remoção de três nucleotídeos consecutivos no meio da sequência codificadora;
Mutação deleção de códon pode haver tradução de menos um aminoácido, consequentemente alteração na formação final da proteína.
b) Remoção de um único nucleotídeo no início da sequência codificadora;
Mutação por deslocamento, alteração na matriz de leitura dos códons.
c) Substituição de um nucleotídeo por outro no meio da sequência codificadora.
Uma substituição é uma mutação que troca uma base por outra (por exemplo, a troca de uma única “letra química” como trocar um A por um G).
Mudar um códon para um que codifica o mesmo aminoácido e não causa mudanças na proteína produzida. Essas são chamadas de mutações silenciosas.  Mudar o códon que codifica um aminoácido diferente e causa pequenas mudanças na proteína produzida. Ou ainda Alterar um códon codificador de aminoácido para um códon “finalizador” e causar uma proteína incompleta. 
5) Um fragmento de DNA foi analisado pela determinação de sua seqüência de nucleotídeos. O resultado está demonstrado no gel abaixo. Informe a seqüência de DNA usada como molde para este seqüenciamento. Indique, na seqüência redigida, as extremidades 5´ e 3´ do DNA.
	5
	T
	C
	A
	G
	T
	A
	T
	T
	G
	A
	T
	G
	T
	T
	G
	C
	A
	G
	A
	G
	A
	C
	A
	A
	A
	G
	T
	3
	3
	A
	G
	T
	C
	A
	T
	A
	A
	C
	T
	A
	C
	A
	A
	C
	G
	T
	C
	T
	C
	T
	G
	T
	T
	T
	C
	A
	5
7) Baseado no resultado da análise:
Há um nítido caso de culpa de um dos suspeitos?
Sim, o suspeito 1.
b) Algum dos suspeitos pode ser absolvido da culpa? Qual(is)?
Os suspeitos 2 e 3.
c) Explique suas respostas.
O suspeito 1 é o único que possui semelhança ao gene de prova, os outros dois não possuem semelhança com o DNA pesquisado, por isso serão absolvidos.
8) Indique a resposta para cada um dos passos que você deverá seguir para clonar um fragmento de 200 pb no vetor plasmidial pUC18:
Passo I
( ) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem;
(x) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem e o DNA de interesse com a mesma enzima;
( ) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem e o DNA de interesse com outra enzima;
Passo II
(x) preparar a ligação do inserto ao vetor utilizando DNA-ligase;
( ) permitir que o vetor se circularize usando a DNA-ligase;
( ) hidrolisar novamente o DNA de interesse para ligá-lo ao vetor.
Passo III
( ) replicar o DNA de interesse;
( ) transformar bactérias com o DNA circular;
(x ) transformar bactérias com o DNA recombinante;
9) O esquema abaixo indica uma mistura de compostos presente em um tubo de ensaio e o produto da reação:
AUUAACGUAA + primer + nucleotídeos + enzima
			A U U A A C G U A A
T A A T T G C - primer
A enzima que catalisa essa reação é a:
( ) RNase
( ) Enzima de restrição
( ) DNA-ligase
( x ) Transcritase reversa
( ) DNA-polimerase I
10) Um pesquisador pretende isolar o gene que codifica certa proteína neurotransmissora de cérebro de camundongo. Sabendo que a sequência de aminoácidos da proteína já é conhecida, o passo inicial para isolar este gene consistirá em fazer uma:
( x ) biblioteca de cDNA a partir de RNAm de cérebro de camundongo;
( ) biblioteca de cDNA a partir de RNAr de cérebro de camundongo;
( ) biblioteca genômica a partir do genoma de um organismo aparentado;
( ) preparação de cérebro de camundongo para análise dos genes em microscopia eletrônica.
13) Considere a seqüência 5’ 3’ do gene eucariótico hipotético abaixo representada cuja região promotora está representada em letras itálicas/negritadas e a seqüência intrônica está representada por letras minúsculas:
GTGTAGCTAA AGTATAGCCT GTCCTTGATA GAAGCTTCGA TATATTTAGT
- 50
+ 1 		AGACTACCGT CACCTTGAAG AATGTGCTGT CTTACTCTGT ACGAACGGAA
+ 51 	ACGAgtctag taaagcctgt ccttgataga agcttcgact gactagtact
+ 101 	ggacttagCA CTTGAAGGAC CTGTGGACCT AGTCTAATCG TGAACGTAAG
+ 151 	AATAAAGCTA TCCCGCCTGT
Complete com as respostas corretas:
a. quantos pb apresenta o gene?
116 pb
b. quantos pb apresenta o promotor?
50 pb
c. qual o primeiro nucleotídeo a ser transcrito?
AGACTACCGT
d. indique a seqüência TATA-box.
TATATTTAGT
e. em qual nucleotídeo inicia o íntron?
ACGAgtctag
f. em qual nucleotídeo inicia o éxon 2?
ggacttagCA
g. escreva abaixo a seqüência 5’® 3’ do hnRNA (transcrito primário) resultante da transcrição deste gene:
AGACT ACCGT CACCTTGAAG AATGTGCTGT CTTACTCTGT ACGAACGGAA ACGAgtctag 
TCTGATGGCA GTGGAACTTC TTACACGACA GAATGAGACA TGCTTGCCTT TGCTcagatc
AGACUACCGU CACCUUGAAG AAUGUGCUGU CUUACUCUGU ACGAACGGAA ACGAgucuag
 taaagcctgt ccttgataga agcttcgact gactagtact ggacttagCA CTTGAAGGAC CTGTGGACCT 
 atttcggaca ggaactatct tcgaagctga ctgatcatga ccugaaucGU GAACTTCCTG GACACCTGGA
uaaagccugu ccuugauaga agcuucgacu gacuaguacu ggacuuagCA CUUGAAGGAC CUGUGGACCU
AGTCTAATCG TGAACGTAAG AATAAAGCTA TCCCGCCTGT
TCAGATTAGC ACTTGCATTC TTATTTCGAT AGGGCGGACA
AGUCUAAUCG UGAACGUAAG AAUAAAGCUA UCCCGCCUGU
h. escreva abaixo a seqüência 5’® 3’ do mRNA resultante do processamento do hnRNA deste gene. Indique as regiões 5’UTR e 3’UTR:
mRNA-AUGUGCUGUCUUACUCUGUACGAACGGAAACGACACUUGAAGGACCUGUGGACCUAG
5’UTR- AGACUACCGUCACCUUGAAGA
3’UTR- UCUAAUCGUGAACGUAAGAAUAAAGCUAUCCCGCCUGU
i. qual o primeiro códon de iniciação da tradução?
AUG
j. quantos nucleotídeos apresenta a região 5’UTR?
21 N
k. escreva abaixo a seqüência de aminoácidos da proteína traduzida a partir deste mRNA:
Met-Cys-Cys-Leu-Thy-Leu-Tyr-Glu-Lys-Arg-His-Leu-Lys-Asp-Leu-Trp-Thy-STOPCODON
l. considerando que UAA, UGA e UAG são os códons de terminação, quantos aminoácidos serão traduzidos a partir do mRNA?
18 aminoacidos
14) Complete o seguinte quadro:
	C
	C
	A
	A
	T
	A
	A
	C
	T
	C
	G
	A
	Dupla hélice de DNA
	G
	G
	T
	T
	A
	T
	T
	G
	A
	G
	C
	T
	
	C
	C
	A
	A
	U
	A
	A
	C
	U
	C
	G
	U
	RNAm (transcrito)
	G
	G
	U
	U
	A
	U
	U
	G
	A
	G
	C
	A
	Anticódon do RNAt
	Ala 
	Tyr 
	Thy
	Arg 
	Aminoácidosincorporados à proteína
15) Considere a seqüência 5’ 3’ de DNA:
		 1 ACGTAGCTAG TAAAGTCTGT CCTTGATAGA AGCTTCGACT GACTAGTACT
		51 GGACTATCAC CTTGAAGGAC CTGTGGACTT AGTCTGATCG TGACCGTAAG
Este fragmento de DNA foi colocado em uma solução com a endonuclease de restrição HindIII que reconhece a sequência 5’-AAGCTT-3’ e hidrolisa o DNA entre os dois resíduos de ácido adenílico. Responda:
quantos pb apresenta o fragmento de DNA?
50 pb
quantos fragmentos de DNA resultarão da digestão com HindIII?
2 fragmentos
quantos pb apresentam cada um dos fragmentos?
1-30 pb e 2- 70 pb
16) Na representação do gel de agarose abaixo, indique qual das amostras (A, B ou C) apresenta o padrão de bandas de DNA esperado após a digestão do fragmento de DNA indicado na questão anterior:
A
B
C
10pb
25pb
50pb
350pb
500pb
100pb
200pb
M – marcador de tamanho molecular (pb) 
( ) amostra A
( x ) amostra B
( ) amostra C
17) A enzima de restrição EcoRI corta o DNA na seqüência 5’-GTTAAC-3’ e a enzima HaeIII na seqüência 5’-GGCC-3’. Em média, com que frequência cada enzima corta a dupla hélice do DNA?
Se o fragmento de DNA a ser clivado contiver 15 kb, quantos fragmentos resultarão da clivagem com cada enzima?
Enzimas com 6 nucleotideos cortam com frequência de 4092 pb, então temos 4 fragmentos.
Enzimas com 4 nucleotideos cortam com frequência de 256 pb, então tem-se 59 fragmentos.

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