Apostila de aulas práticas - Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIENCIAS HUMANAS SOCIAIS E AGRÁRIAS
COLEGIO AGRICOLA “VIDAL DE NEGREIROS”
CAMPUS III BANANEIRAS PARAÍBA
Técnico responsável: Jeronimo Galdino dos Santos
Professor: Antonio Eustaquio Resende Travassos
AULA PRÁTICA DE MICRBIOLOGIA DE ALIMENTOS
APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO
PLANTA BAIXA ATUAL
MAPA DE RISCO
FONTE: Kívia Gouveia, Thiago Janderlan, Joselito Bastos. Realizado na disciplina de Segurança do Trabalho do 7º período, do curso de Bacharelado em Agroindústria.
Conhecer as instalações e os materiais necessários de um laboratório de microbiologia, fixando normas de biossegurança no laboratório.
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS PARA UM LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Equipamentos indispensáveis em um laboratório de microbiologia como: microscópio, estufas incubadoras, esterilizadoras, autoclaves, balanças, geladeiras, destilador de agua, deionizadores, ultrafiltro, banhos-maria, vidrarias especificas.
Placa de petri: caixas redondas de vidro, com tampa rasas, medindo geralmente 15 mm de altura por 90 mm de diâmetro serve para conter o meio de cultura sólido sendo sua superfície facilita o isolamento de microrganismos em colônias isoladas.
Pipetas graduadas: providas de tampão de algodão na extremidade de aspiração para proteção do operador, sua precisão é relativa para maior rapidez das operações, costuma-se soprar seu conteúdo.
Cabo de kolle: uma haste de alumínio ou aço inoxidável, com cabo de material de isolante térmico, provido de uma agulha de níquel-cromo.
Alça: um fio reto de platina ou liga metálica moldado em circulo na extremidade e adaptado ao cabo de kolle, que serve para semear meio sólido em superfície ou meio liquido a quantidade transportado pela alça, depende é obvio de seu diâmetro.
Laminas: são retângulos de vidros claro e transparente, de espessura média e bordos polidos, que serve para exame de microrganismos ao microscópio.
Lamínulas: pequenos quadrados de vidros, muito finos e transparente, destinados a cobrir a preparação contida na lamina, nos ensaios a fresco evitando aberrações de da imagem e refração dos raios luminosos.
Tubo de Durham: tubos pequenos, cilíndricos medindo 5x20mm mais ou menos que são colocados invertidos no meio liquido contido num tubo de ensaio, durante a esterilização, o tubo de Durham fica cheio de liquido, após inoculação e fermentação o liquido é deslocado total ou parcialmente pelo gás formado em uma fermentação.
Balões e frascos e erlenmeyer: servem para guardar quantidades maiores de meio de cultura e também para o desenvolvimento de microrganismos em meio liquido, com ou sem agitação e aeração. 
Algodão: para servir de tampão de frascos e tubos contendo meio de cultura ou soluções esterilizadas, pois funciona como filtro para microrganismos.
Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de microrganismos.
Cabine de Segurança Biológica (Capela de Fluxo Laminar) - câmara asséptica, dotada de exaustor e lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos. São unidades projetadas para criar áreas de trabalho estéreis para a manipulação, com segurança, de materiais biológicos ou estéreis que não possam sofrer contaminação do meio ambiente e podendo também garantir nos fluxos da classe II que o manipulado não contamine o operador e o meio ambiente. Que apresentam fluxo de ar laminar vertical, oferecendo total proteção ao produto manipulado, similar a uma cabine de proteção biológica, pois, além de oferecer proteção ao produto manipulado, garante proteção ao operador e ao ambiente contra agentes biológicos de risco moderado (material particulado).
 Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na temperatura adequada
Incubação- manutenção do meio semeado em determinadas condições para promover o desenvolvimento dos microrganismos.
Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas.
Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões etc.(ver modo de operação)
Alça de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa, dobrada em ângulo reto e depois em 45C na chama. É utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólidos.
Pipeta Automática-Tem como Vantagem a rapidez de uso. Para medir volumes reduzidos
Desinfecção da bancada:
Antes da realização de um determinado trabalho de microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução detergente seguida de uma solução alcoólica a 70%.
Desinfecção da vidraria:
 Vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida lavada com uma solução detergente ou sabão neutro;
 Vidraria sem contaminação-idem ao anterior, porém sem necessidade de autoclavação.
Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e também por ser de difícil remoção no material.
ATENÇÃO: Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca.
Esterilização em autoclave
Operação: ligar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do material dentro da autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão internamente irá aumentar e chegar à pressão de esterilização usada, que é de 15 lb/pol2, ou 1atm, ou 1 kgf/cm2, correspondendo a uma temperatura de 1210C. O tempo de exposição do material no interior deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 litros, podem ser esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol2. Com relação a maiores volumes, será necessária, uma exposição mais prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilização é alcançada, deve-se começar a contar o tempo, usando um relógio de laboratório (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantém-se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos. Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida a tampa da autoclave é levantada.
Técnicas de Semeadura
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inoculo bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.
As técnicas de assepsia incluem: e fazer a desinfecção da área de trabalho e antissepsia das mãos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) é trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) é esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. (3) é flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisadoe garantindo que somente o microrganismo desejado será inoculado. (4)
COLORAÇÃO DE GRAM
Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que se coravam em roxo) e as Gram negativas (que se coravam em vermelho). A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares. A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias em relação à forma, tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial. A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prática bacteriológica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciação dos microrganismos princípio da técnica de Gram é o seguinte: inicialmente faz-se atuar um corante básico - violeta de Genciana; aplica-se em seguida um mordente - soluto de Lugol (solução iodo-iodada). A fase seguinte é uma descoloração pelo álcool, aplicando-se por fim outro corante - fucsina diluída ou safranina. 
Umas bactérias apresentar-se-ão coradas pelo violeta de Genciana enquanto outras se apresentarão coradas pela fucsina.
	Soluções em ordem de aplicação
	Gram positivas
	Gram negativas
	1- Cristal violeta - CV
	Células coradas em violeta
	Células coradas em violeta
	 2- Soluções de iodo (lugol) - I
	Formação do complexo CV-I no interior das células, que permanecem violetas.
	Formação do complexo CV-I no interior das células, que permanecem violetas.
	
	Desidratação das paredes
	Extração dos lipídios da parede
	3- Álcool
	 Celulares, diminuição da porosidade e da permeabilidade: o complexo CV-I não pode sair das células que permanecem violetas.
	 Celular, aumentando a porosidade: O complexo CV-I é removido das células.
	4- Safranina
	As células não são afetadas, permanecendo violetas.
	As células tomam o corante, tornando-se vermelhas.
QUANTO AOS TIPOS DE COLORAÇÃO TEMOS:
1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.
2) Coloração diferencial - nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.
3) Coloração especial - são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.
A COLÔNIA É DESSECADA SOBRE UMA LÂMINA E TRATADA COMO SEGUE:
Quais as modificações já ocorreram no método de Gram ao longo dos anos
O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contraindicada. O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (99,5º Gay Lussac). Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. 
Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica. Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina. A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro.
Veja no esquema abaixo os passos da coloração e o que acontece a nível microscópico.
MICROSCÓPIO
O microscópio óptico, o tipo mais comum de microscópio, contém várias partes com funções específicas. Observe a figura e descubra suas funções.
Oculares: contêm as lentes oculares, as quais fornecem um poder de aumento de 10x a 15x, geralmente. É por aqui que você olha através.
Revólver: segura as lentes objetivas e pode ser girada facilmente para mudar o aumento.
Lentes objetivas: geralmente, há três ou quatro lentes objetivas em um microscópio, consistindo de poderes de aumento de 4x, 10x, 40x e 100x. A fim de obter o aumento total de uma imagem, você precisa multiplicar o aumento das lentes oculares pelo aumento das lentes objetivas. Portanto, se você utilizar em conjunto uma lente ocular de 10x com uma lente objetiva de 40x, o aumento total é de 10 x 40 = 400 vezes.
Presilhas: seguram a lâmina no lugar.
Platina: é uma plataforma plana que suporta a lâmina sendo analisada.
Diafragma: controla a intensidade e o tamanho do cone de luz projetado sobre o espécime. Como uma regra geral, quanto mais transparente o espécime, menos luz é requerida.
Fonte de luz: projeta luz para cima através do diafragma, lâmina e lentes.
Base: suporta o microscópio.
Condensador: ajuda a focar a luz sobre a amostra analisada. É particularmente útil quando utilizado em conjunto com as lentes objetivas mais poderosas.
Braço: suporta o microscópio quando carregado.
Botão macrométrico: quando o botão é girado, a platina é movida para cima ou para baixo, a fim de promover um ajuste grosso de foco.
Botão micrométrico: utilizado para um ajuste fino de foco.
PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Transferir uma alçada da cultura ou uma colonizada placa para uma lâmina de microscópio limpa. Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se tiver sido colhida colônia da placa, adicionar salina estéril para facilitar o espalhamento.
Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama do Bico de Bunsen, até que este esteja completamente seco.
Cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta por cerca de 1 minuto. A seguir, lavar em água corrente com o pissete.
Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco por cerca de 1 minuto.
Novamente lavar com água, e então lavar com álcool absoluto até que não saia mais corante da lâmina (10 – 15 segundos).
Lavar com água corrente em abundância para que não reste álcool sobre a lâmina. Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 30 segundos.
Lavar com água e secar suavemente com papel.
Após secar suavemente a lâmina, observar ao microscópio na objetiva de imersão (100x), com óleo de cedro/mineral e identificar a célula corada.
Para decorar!
Vi Lulu Ali A Fumar
(Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina)
REPRESENTAÇÃO DA DILUIÇÃO SUCESSIVA
1ml
1ml
ml
1ml
1ml
 ml
1
 ml
1ml
10
-
5
AMOSTRAA
10
-6
10
-4
10
-3
10
-1
10
-2
1/1000000
1/100000
1/10000
 
1/1000
1/100
1/10
11
ANÁLISE DE ÁGUA
Referencia: Brasil, Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água. 2ª ed. rev. - Brasília: Fundação Nacional de Saúde, 2006.
Material necessário:
a) tubo de ensaio;
b) estante para tubo de ensaio;
c) tubo de Durham;
d) pipeta graduada de 10 ml;
e) pipeta graduada de 1 ml;
f) bico de Bunsen ou lamparina a álcool;
g) caldo Lactosado de concentração dupla;
h) caldo Lactosado de concentração simples;
i) caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%;
j) água de diluição;
l)caldo E.coli;
k) alça de platina com cabo de Kolle;
l) estufa bacteriológica.
TESTE PRESUNTIVO
 	Tomar uma bateria contendo 5 tubos de ensaio, (os que contêm caldo lactosado ou lauril de concentração dupla) inocular com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de água a ser examinada, em cada tubo. (Diluição 1:1); incubar a 35 ± 0,5º C durante 24/48 horas. Se houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan, significa que o teste Presuntivo foi Positivo se não houver a formação de gás durante o período de incubação significaque o teste e negativo.
 Os resultados são expressos em N.M. P (Número Mais Provável) /100 ml de amostra. 
TESTE CONFIRMATIVO
 	Tomar o número de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação de gás) nos 5 tubos positivos tomar igual número de tubos contendo o meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 2% e caldo E.coli com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante. Este procedimento chama-se repicagem, identificar os tubos incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC para o caldo VB e 44,5°C por 24h para o caldo EC.
Se no final do período de 24/48 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durham o teste é considerado Positivo. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado negativo.
Expressão dos resultados
Tabela – do NMP com limite de confiança de 95% para os resultados positivos quando 5 porções de 10 ml são examinadas
	Número de tubos positivos
	NMP/100 ml
	Limites
Inferior
	Superior
	0
	< 2,2
	0
	6,0
	1
	2,2
	0,1
	12,6
	2
	5,1
	0,5
	19,2
	3
	9,2
	1,6
	29,4
	4
	16,0
	3,3
	52,9
	5
	>16,0
	8,0
	Infinito
Fonte: APHA, 1985
CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS
Referencia: SILVA, Neusely et.al; Manual de métodos de análise microbiológica da agua.
Bactérias heterotróficas
Material necessário
a) placa de Petri;
b) pipeta graduada;
c) bico de Bunsen ou lamparina a álcool;
d) plate Count Agar;
e) estufa bacteriológica;
f) contador de colônia.
EXECUÇÃO DO ENSAIO
a) transferir, com pipeta estéril, 1 ml da amostra para uma placa de Petri previamente esterilizada;
b) entreabrir a placa e adicionar o meio de cultura, previamente fundido e estabilizado em banho-maria a 44-46ºC, contido no tubo de ensaio;
c) homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares moderados em forma de (∞), em torno de 10 vezes consecutivas;
d) quando o meio de cultura se solidificar, incubar a placa em posição invertida a 35 +0,5º C durante 48 +3 horas;
e) no final do período de incubação, fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias.
Expressão dos resultados
Os resultados são expressos como nº de Colônias de bactérias/ml ou Unidades Formadoras de Colônias (UFC) /ml.
UFC/ml= N° colônias
 Diluição
a) antes de iniciar os exames desinfetar a bancada do laboratório, usando uma solução de álcool etílico a 70% ou outro desinfetante que não deixe resíduo;
b) todas as amostras a serem examinadas devem ser homogeneizadas pelo menos 25 vezes;
c) não se esquecer de flambar a boca dos tubos de ensaio contendo meios de cultura, antes de usá-los;
d) o Tiossulfato de Sódio a 10% colocado nos frascos de coleta é para neutralizar a ação do cloro;
e) as placas de Petri devem ser colocadas na posição invertida para evitar a condensação de água na superfície do ágar;
f) fazer a Contagem Padrão de Bactérias, sempre em duplicata.
TTTTT
M
EEEEEEE
PTESTE PRESENÇA E AUSÊNCIA
Referencia: SILVA, Neusely et.al; Manual de métodos de análise microbiológica da agua.
TESTE PRESUNTIVO
 	Adicionar os 100 ml da amostra em 50 ml de um dos meios de cultura, em concentração tripla (LST-BCP) Lauril sulfato triptose com púrpura bromocresol. Incubar os frascos a 35°+ 0,5°/24 a 48 h e observar se há crescimento com produção de ácido, evidenciando pela viragem do indicador de purpura para amarelo.
Em caso positivo crescimento e ou produção de ácido. A não ocorrência de ácido após 24 às 48h de incubação indica ausência de coliformes totais, fecais ou E.coli nos 100 ml da amostra.
 TESTES CONFIRMATIVOS TOTAIS E FECAIS
Coliformes totais
A partir dos frascos de caldo LST-BCP, transferir uma alça da cultura para tubo de caldo verde brilhante com tubo de durhan. Incubar a 35°C por 24 a 48h observar crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes totais. 
Coliformes fecais (Termotolerantes)
A partir dos frascos de caldo LST-BCP, transferir uma alça da cultura para tubo de caldo E.coli (EC) com tubo de durhan. Incubar a 44,5°C por 24h observar crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes fecais.
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L
TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS OU “NÚMERO MAIS PROVÁVEL” (NMP)
Referencia: SILVA, Neusely et.al; Manual de métodos de análise microbiológica da agua.
A presente técnica compreende três etapas, a saber: (1) ensaio presuntivo, ensaio confirmatório identificação de E. coli. Nesta aula iremos realizar apenas primeira etapa.
 Ensaio presuntivo
O objetivo do ensaio presuntivo é detectar a presença das coliformes totais (gêneros Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella) nas amostras, através da formação de gás nos tubos. 
As amostras de agua foram coletadas em recipientes estéreis e foram mantidas a 4o C. Nesta pratica utilizaremos uma série de três tubos por diluição ou invés de uma série de cinco tubos, a qual é recomendada pelos padrões internacionais.
 	Homogeneizar a amostra agitando‐a suavemente. Retire uma pipeta graduada de 10 ml do cilindro de esterilização e inserir o pipetador, Inocular um volume de 10 mL em cada um dos três tubos contendo 10 ml de Caldo Lauril Triptose duplamente concentrado (2x). Cada tubo contem um tubo menor invertido (tubo de Durhan).
 	Com auxílio de uma pipeta de 1 ml inocular tal volume da amostra em cada um dos três tubos contendo 9 mL de Caldo Lauril Triptose com concentração dupla.
 Com auxílio de uma pipeta de 1 ml inocular 0,1 ml da amostra em cada um dos três tubos contendo 9,9mL de Caldo Lauril Triptose com concentração dupla.
 Incubar os tubos à 35º C por 24 horas. Caso o resultado seja negativo, incubar por mais 48 horas. Após o período de incubação, a leitura será realizada pela contagem dos tubos com presença de gás (tubos positivos) em cada uma das diluições. Com a sequencia de tubos positivos será possível comparar com os valores presentes na tabela de NMP (tabela de McCrady) e determinar o número de coliformes.
TESTE CONFIRMATIVO
 	Tomar o número de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação de gás) nos 5 tubos positivos tomar igual número de tubos contendo o meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 2% e caldo E.coli com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante. Este procedimento chama-se repicagem, identificar os tubos incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC para o caldo VB e 44,5°C por 24h para o caldo EC.
Se no final do período de 24/48 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durham o teste é considerado Positivo. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado negativo.
FORMULA PARA O CALCULO
NMP/100ml = N° DE TUBOS POSITIVOS X 100
 
DETERMINAÇÃO DE BACTERIAS DO GRUPO COLIFORMES TECNICA DO NÚMERO MAIS PROVAVEL (NMP), EM ALIMENTOS.
REFERENCIA: Ito, Keith; Downes, Frances Pouch; Compendium of methods for the microbiological examination of foods, APHA - American Public Health Association- 4 Edition – 2001.
MATERIAL
Frasco erlenmeyer de 500 ml, ou frasco de 90 ml;
Pipetas sorológicas;
Banho-maria 44,5°c;
Estufa bacteriológica 35°+2°C;
Alça de platina;
Tubos de ensaio;
Tubos de durhan;
Caldo lauril triptose;
Caldo lactose bile verde brilhante, E.coli
Método
Preparo da amostra
Pesar 10g da amostra da forma asséptica, transferir para um frasco contendo 90 ml de agua peptonada tamponada diluição 10-1, homogeneizar por 25 vezes.
Preparo da diluição seriadas 10-2, 10-3 adicionando da solução anterior em 9 ml de agua peptonada tamponada, agitar os frascos antes da retirada da amostra.
Teste presuntivo para coliformes
Inocular três tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo lauril triptose, com 1 ml da primeira diluição repetindo a mesma diluições subsequentes; Incubar os tubos por 24 a 48h a 35°C;após as 24h verificar os tubos positivos com produção de gás.
Testeconfirmativo coliforme
Transferir com alça de platina de cada tubo positivo do teste presuntivo para o tubo contendo 10 ml de caldo lactose bile verde brilhante, incubar por 24 às 48h 35°C, anotar o numero de tubos positivo com produção de gás no período de 48h, expressando em NMP/ml ou g.
Teste para coliformes termotolerantes
Transferir com uma alça de platina a cada tubo positivo do teste presuntivo para cada tubo contendo caldo EC, incubar a 44,5°c por 24 às 48h. Verificar o numero de tubos positivos com produção de gás. Expressar o resultado em NMP/ml ou g.
Teste para verificar a presença de Escherichia coli
Selecionar os tubos positivos de caldo EC e semear por estrias em ágar EMB, verificar a presença de colônias típicas de E.coli, colônias negras com brilho verde metálico e transferir com auxílio da alça de platina os tubos positivos de caldo ec para o caldo triptona incubando a 35° por 24h com auxilio do reativo de kovac’s verificar um anel vermelho que se forma no meio cacteristica de e.coli. 
	TABELA 1. For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per gram and 95 percent confidence intervals. PARA TRÊS TUBOS CADA EM 0,1, 0,01, E 0,001 G INOCULO OS MPN POR GRAMA OU ML E INTERVALOS DE CONFIANÇA DE 95 %. 
	Pos. Pos. tubes Tubos 
	MPN/g NMP / g 
	Conf. Conf. lim. lim. 
	Pos. Pos. tubes Tubos 
	MPN/g NMP / g 
	Conf. Conf. lim. lim. 
	0.10 0,1 
	0.010.01 
	0.0010.001 
	
	LowBaixo 
	HighAlto 
	0.100,1 
	0.010.01 
	0.001 0.001 
	
	LowBaixo 
	High Alto 
	0 0 
	0 0 
	0 0 
	<3.0 <3,0 
	– - 
	9.5 9,5 
	2 2 
	2 2 
	0 0 
	21 21 
	4.5 4,5 
	42 42 
	0 0 
	0 0 
	1 1 
	3.0 3.0 
	0.15 0,15 
	9.6 9,6 
	2 2 
	2 2 
	1 1 
	28 28 
	8.7 8,7 
	94 94 
	0 0 
	1 1 
	0 0 
	3.0 3.0 
	0.15 0,15 
	11 11 
	2 2 
	2 2 
	2 2 
	35 35 
	8.7 8,7 
	94 94 
	0 0 
	1 1 
	1 1 
	6.1 6.1 
	1.2 1.2 
	18 18 
	2 2 
	3 3 
	0 0 
	29 29 
	8.7 8,7 
	94 94 
	0 0 
	2 2 
	0 0 
	6.2 6.2 
	1.2 1.2 
	18 18 
	2 2 
	3 3 
	1 1 
	36 36 
	8.7 8,7 
	94 94 
	0 0 
	3 3 
	0 0 
	9.4 9.4 
	3.6 3.6 
	38 38 
	3 3 
	0 0 
	0 0 
	23 23 
	4.6 4.6 
	94 94 
	1 1 
	0 0 
	0 0 
	3.6 3.6 
	0.17 0.17 
	18 18 
	3 3 
	0 0 
	1 1 
	38 38 
	8.7 8,7 
	110 110 
	1 1 
	0 0 
	1 1 
	7.2 7.2 
	1.3 1.3 
	18 18 
	3 3 
	0 0 
	2 2 
	64 64 
	17 17 
	180 180 
	1 1 
	0 0 
	2 2 
	11 11 
	3.6 3.6 
	38 38 
	3 3 
	1 1 
	0 0 
	43 43 
	9 9 
	180 180 
	1 1 
	1 1 
	0 0 
	7.4 7.4 
	1.3 1.3 
	20 20 
	3 3 
	1 1 
	1 1 
	75 75 
	17 17 
	200 200 
	1 1 
	1 1 
	1 1 
	11 11 
	3.6 3.6 
	38 38 
	3 3 
	1 1 
	2 2 
	120 120 
	37 37 
	420 420 
	1 1 
	2 2 
	0 0 
	11 11 
	3.6 3.6 
	42 42 
	3 3 
	1 1 
	3 3 
	160 160 
	40 40 
	420 420 
	1 1 
	2 2 
	1 1 
	15 15 
	4.5 4,5 
	42 42 
	3 3 
	2 2 
	0 0 
	93 93 
	18 18 
	420 420 
	1 1 
	3 3 
	0 0 
	16 16 
	4.5 4,5 
	42 42 
	3 3 
	2 2 
	1 1 
	150 150 
	37 37 
	420 420 
	2 2 
	0 0 
	0 0 
	9.2 9.2 
	1.4 1.4 
	38 38 
	3 3 
	2 2 
	2 2 
	210 210 
	40 40 
	430 430 
	2 2 
	0 0 
	1 1 
	14 14 
	3.6 3.6 
	42 42 
	3 3 
	2 2 
	3 3 
	290 290 
	90 90 
	1,000 1000 
	2 2 
	0 0 
	2 2 
	20 20 
	4.5 4,5 
	42 42 
	3 3 
	3 3 
	0 0 
	240 240 
	42 42 
	1,000 1000 
	2 2 
	1 1 
	0 0 
	15 15 
	3.7 3,7 
	42 42 
	3 3 
	3 3 
	1 1 
	460 460 
	90 90 
	2,000 2000 
	2 2 
	1 1 
	1 1 
	20 20 
	4.5 4,5 
	42 42 
	3 3 
	3 3 
	2 2 
	1100 1100 
	180 180 
	4,100 4100 
	2 2 
	1 1 
	2 2 
	27 27 
	8.7 8,7 
	94 94 
	3 3 
	3 3 
	3 3 
	>1100 >1100 
	420 420 
	– 
FONTE: BAM ONLINE, 2013. 
DETERMINAÇÃO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS EM ALIMENTOS; CONTAGEM PADRÃO.
REFERENCIA: Ito, Keith; Downes, Frances Pouch; Compendium of methods for the microbiological examination of foods, APHA - American Public Health Association- 4 Edition – 2001.
	A técnica de contagem em placas apresenta como vantagens o fato de ser de fácil realização; além disso, mede populações de qualquer grandeza em virtude das várias diluições realizadas e apresenta sensibilidade para a detecção de populações muito pequenas. Essa técnica é utilizada rotineiramente na contagem de microrganismos presentes na água, leite e alimentos em geral.
	Estufa bacteriológica regulada a 37°C; - Placas de Petri estéreis; - Pipetas bacteriológicas- Ágar padrão para contagem estéril; - Tubos contendo 9 ml de solução salina peptonada ou água peptonada tamponada.
Procedimento 
 	Preparar diluições de 10-1 ate 10-3 da amostra (No caso da amostra líquida começar com a amostra direta 100). Inocular 1,0mL de cada diluição em placas de Petri estéreis. (realizar este procedimento em duplicatas) Verter nas placas inoculadas ± 20 ml do Agar Padrão para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45º C. Homogeneizar. Esperar solidificar Contagem total de aeróbios mesófilos. Incubar as placas invertidas a 35º C/48h. Contar todas as colônias contagem total de aeróbios psicrotófilos, incubar as placas invertidas a 7º C/10 dias. Contar todas as colônias contagem total de aeróbios termófilos, incubar as placas invertidas a 55º C/24 h . Contar todas as colônias contagem das colônias: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colônias. Calcular o número de unidades formadora de colônia (UFC) por ml ou grama, multiplicar pelo inverso da diluição inoculada.
	Ex (1): 100 colônias na diluição 10-2 = 100 x 100 = 10 000 = 1,0 x 104 UFC/g ou ml
	Ex (2): UFC/g ou ml = N° de colônias
 Diluição
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
REFERENCIA: Ito, Keith; Downes, Frances Pouch; Compendium of methods for the microbiological examination of foods, APHA - American Public Health Association- 4 Edition – 2001.
A utilização de meios acidificados a pH 3,5 ± 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactérias presentes no alimento.
 PROCEDIMENTOS
 Inocular 0,1 ml das diluições selecionadas sobre a superfície seca de ágar batata glicose 2% acidificado com ácido tartárico a pH 3,5.Com o auxílio de alça de Drigalski , espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. Nos casos em que a legislação exigir valores menores que 100 UFC/g ou ml, distribuir em duplicata 1 ml da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de produtos líquidos poderão ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra (10º), o que corresponderá à diluição 10-1. Incubação: Incubar as placas, sem inverter, a 25º C por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
Contagem de bolores e levedura
 Preparar diluições de 10-1 ate 10-3 da amostra (No caso da amostra líquida começar com a amostra direta 100) Inocular 1 ml de cada diluição nas placas método de plaqueamento em profundidade contendo o meio solidificado Agar batata dextrosado (PDA).Incubar as placas não invertidas a 25º C ou temperatura ambiente por 5 dias,(contar primeiro com 3 dias). Contagem das colônias: Selecionar as placas que tenha entre 15 a 150 colônias. Calcular o número de unidades formadora de colônia (UFC) por ml ou grama, multiplicar pelo inverso da diluição inoculada e depois por 10 (já que foram inoculados 0,1 ml e não 1 ml)
	Ex: 100 colônias na diluição 10-2 = 100 x 100 = 10 000 x 10 = 1,0 x 105 UFC/g ou ml
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
REFERENCIA: Ito, Keith; Downes, Frances Pouch; Compendium of methods for the microbiological examination of foods, APHA - American Public Health Association- 4 Edition – 2001.
A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos, um relacionado com a saúde pública, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicação alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção de alimentos, condição em que S. aureus serve como indicador de contaminação pós-processo ou das condições de santificação dassuperfícies destinadas ao contato com alimentos.
Método: Contagem direta em placa
Procedimento:
 Inocular 0,1 ml de cada diluição na superfície de placas de ágar Baird-Parker (BP) ou ágar vogel Johnson (VJ). Espalhar o inoculo com uma alça de Drigalski, até que todo o excesso de líquido seja absorvido. Se as contagens estimadas de S. aureus na amostra forem menores do que 100/g ou ml, inocular 1,0mL da primeira diluição, distribuindo o volume por quatro placas, 3 com 0,3 e uma com 0,1 ml. Incubar invertidas a 37º C por 48h. Contar as colônias típicas de S. aureus selecionando as placas que tenha entre 25 a 250 colônias. Colônias típicas: colônias circulares, pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca.
Colônias atípicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos típicos. Confirmação das colônias. Selecionar no mínimo cinco colônias típicas, para teste de coagulase, e havendo menos do que cinco tomar todas. Se a placa apresentar colônias suspeitas de mais de um tipo, típicas e atípicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo. Transferir cada colônia para um tubo de caldo infusão cérebro coração (BHI), emulsionar bem a massa de células com o caldo, transferir uma alçada para um tubo com ágar tripticase de soja (TSA) inclinado e incubar ambos os tubos 35º C/24h.
Teste da coagulase:
Transferir 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 ml de plasma de coelho. Incubar a 36 ± 1ºC por 6 horas. Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:
Reação negativa: não formação de coágulo;
Reação 1+: coágulo pequeno e desorganizado;
Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado;
Reação 3+ : coágulo grande e organizado;
Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprenderá quando o tubo for invertido;
Quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; quando a reação de coagulação fornegativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando areação for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas, para a realização dos testes complementares:
Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou ágar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:
Coloração de Gram: Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram.
A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares.
Pesquisa de termonucleares: Fazer orifícios equidistantes com cerca de 2 mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifícios, de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de clarificação no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus é termonuclease positiva.
Prova da catalase: Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estéreis, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus é catalase positiva.
RESULTADOS
Quando o número de colônias confirmadas for igual ao número de colônias
selecionadas e repicadas, o resultado será igual.
Ex: 1diluição 10-2,30 colônias típicas, cinco submetidas à confirmação, três confirmadas (60%), UFC/g ou ml =30x102x10x0, 6=1,8x104.
Ex: 2 diluição 10-2,30 colônias suspeitas 20 de um tipo e 10 de outro tipo,10 submetidas a confirmação cinco do primeiro tipo e cinco do segundo tipo, sete confirmadas cinco do primeiro tipo= 100% e 2 do segundo tipo =40%.UFC/g ou ml
(2x102x10x1)+(10x102x10x0,4)=2,4x104. 
UFC/g ou ml = N° de colônias
 Diluição
PESQUISA de Salmonella sp
REFERENCIA: Ito, Keith; Downes, Frances Pouch; Compendium of methods for the microbiological examination of foods, APHA - American Public Health Association- 4 Edition – 2001.
Todas as salmonelas são consideradas potencialmente patogênicas para o homem. A única via de entrada destes microrganismos no corpo humano é a oral, por isso é de suma importância a análise dos alimentos para detectar sua presença. A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimentos.
Pré- enriquecimento em caldo não seletivo 
Objetiva a recuperação de células injuriadas. Adicionar 25g ou ml da amostra em 225 ml do caldo de pré- enriquecimento (diluição 10-1). Homogeneizar no liquidificador por 60 seg. Verter todo material em erlenmyer estéril e incubar a.
35º C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou água peptonada 0,1% tamponada e para produtos lácteos água destilada verde brilhante.
Enriquecimento Seletivo 
Estimula a multiplicação de salmonelas e reduz ou inibe o crescimento dos organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas. Transferir 1,0 ml para 10 ml de caldo Tetrationato (TT) e 1 ml para 10ml de caldo Selenito Cistina. Incubar a 42º C/24h.
Plaqueamento seletivo diferencial 
Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella, com características típicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica. Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alçada do caldo tetrationato em placas de Agar entérico de Hectoen (HE) e Ágar xilose lisina descarboxilado (XLD) ou ágar verde brilhante e ágar salmonela diferencial (SD) ou ágar salmonela shigela (SS). Incubar as placas invertidas a 35º C/24h. Verificar se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella de acordo com atlas de microbiologia de alimentos. Conforme figura abaixo tipos de estrias.
Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos: 
• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. 
• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.
Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.
Confirmação Preliminar das colônias típicas de Salmonella
Com o auxílio de uma agulha de inoculação, remover uma porção da massa de células, do centro da colônia típica (no mínimo 2 colônia) e semear em tubos inclinados de Agar Lisina Ferro (LIA) e Ágar Tríplice Açúcar.. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa. Incubar os tubos a 35º C/24h. Observar reação típica SI- rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S(escurecimentodo ágar). Reação atípica que não deve ser descartada se a demais reação em LIA se apresentar típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S. LIA – fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S. Reação atípica, que não devem ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.
Teste bioquímico
 Meio SIM – Transferir com uma agulha através de picada a cultura de colônia típica do TSI para o meio. Incubar 35º C/24h.
	 Produção de H2S: escurecimento do ágar. Salmonela pode produzir ou não H2S
 Motilidade: crescimento na região da picada – imóvel crescimento em todo ágar ou ao redor da região da picada: móvel. Salmonela é móvel. Após a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou Kovacs no tubo.
Aparecimento de cor rósea: indol positivo, aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela é indol negativo.
Teste do vermelho de metila (VM) 3 Voges-Proskauer (VP): Transferir uma alçada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo 3mL VM-VP e incubar a 35º C/48h para VP e 96h VM. Após o período de incubação, no tubo VP adicionar 1,8 mL de solução de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de solução KOH 40%, agitar. Observar até 1 hora. Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea – teste positivo. Permanência do meio na cor do reagente(amarelado ou ligeiramente esverdeado) – teste negativo. A maioria das Salmonelas são VP negativas. No tubo VM – adicionar 5 gotas de solução vermelho metila e observar imediatamente se o meio adquire uma coloração vermelha – teste positivo ou amarela _ teste negativo. A maioria dascepas de Salmonela são VM positivas.
Teste do citrato:
Com uma agulha de inoculação, transferir um inoculo da cultura para um tubo de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35º C/ 96h. Observar o crescimento: Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas são citrato positivo. Cor do meio inalterado: citrato negativo.
Teste de urease:
Transferir uma alçada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uréia de Chistensen. Incubar 35º C/24h. Observar crescimento. Cor do meio original (pêssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas são uréases negativa Cor do meio rosa escuro: teste positivo.
Teste da descarboxilação da lisina em caldo
Transferir uma alçada da cultura em TSI para um tubo com caldo lisina (previamente desaerado). Cobrir a superfície do caldo com 2 a 3 ml de parafina ou óleo mineral estéril.Incubar a 35º C /48h h. Observar: Alteração do meio de esverdeado para púrpura azulado : teste positivo- As cepas de Salmonelas são lisinas positivas. Alteração do meio par cor amarela (ácida): teste negativo. Reação sorológica frente ao anti-soro polivalente “O” Ressuspender o cultivo obtido em ágar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 ml de solução salina 0,85%.Em lâmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de solução salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspensão em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos.
Classificar a reação do seguinte modo:
Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro;
Negativa: ausência de aglutinação em ambas às misturas; Não específica: presença de aglutinação em ambas.