Aula 01 - Revisão Coloração de Gram

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COLORAÇÃO DE GRAM
- Princípios e Métodos
Prof. Mateus Batista Fucks
Microbiologia
Clínica
A divisão principal
O método de coloração que 
revolucionou
a microbiologia
Hans Christian Joachim Gram
Médico bacteriologista dinamarquês
professor em Copenhagen, pioneiro
no estudo sobre a coloração de
Gram, reação em que se submetem
bactérias, inicialmente, à coloração
por violeta-de-genciana e, em
seguida, à solução de lugol. São
classificadas de gram-positivas as
que retêm, a despeito de tratamento
pelo álcool , a coloração adquirida, e
de gram-negativas as que não
conservam.
Introdução
� Descoberto em 1884 pelo Dr. Hans Gram.
� Principal método utilizado em bacteriologia.
� Permite diagnóstico presuntivo e em alguns casos 
confirmatório.
� Técnica simples, rápida e de baixo custo.
Gram-Positivas: 
Gram-Negativas: vermelhas
roxas
Principais Modificações
� Violeta de genciana pelo violeta de metila.
� Álcool-acetona pelo álcool etílico 99,5º.
� Fucsina fenicada pela safranina.
Técnicas
� O kit para coloração de Gram é composto por:
- Violeta de Genciana ou Violeta de Metila
- Lugol Fraco
- Álcool Acetona ou Álcool 99,5º
- Fucsina Fenicada ou Safranina
Obs: Corantes devem ser armazenados em frascos de cor âmbar-escuro.
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Técnica Tradicional
Cristal Violeta 1 min.
Lugol fraco 1 min.
Álcool acetona 10s
Fucsina fenicada 30s
Lâmina pronta
G + G - Imersão
(100x)
H2O
H2O
H2O
H2O
Técnica Modificada
Violeta de metila 15s + H2O 45s
Lugol fraco 1 min.
Álcool etílico 99,5º
Safranina 30s
Lâmina pronta
G + G - Imersão
(100x)
H2O
H2O
H2O
H2O
Princípio da Coloração
� Gram-positivo
Retém a coloração 
adquirida após 
tratamento com álcool.
� Gram-negativo
Perde a coloração 
adquirida após 
tratamento com álcool.
Princípio da Coloração
� Conceitos:
1. A existência de um substrato Gram-positivo e específico.
2. As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam 
diferentes afinidades com o corante primário cristal violeta.
3. A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede 
dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.
GRAM-NEGATIVOGRAM-NEGATIVO
Membrana interna (citoplasmática)
Membrana externa
Fosfolipídios
GRAM POSITIVOGRAM POSITIVO
Citoplasma
Peptidoglicano
Membrana citoplasmática Fosfolipídios
Citoplasma
V CV-I
I
1 2
V CV-I
I
1 2
Peptidoglicano
PAREDE CELULAR BACTERIANA
Lipolissacarídeos - LPS GRAM-NEGATIVOGRAM-NEGATIVO
GRAM POSITIVOGRAM POSITIVO
Citoplasma
Peptidoglicano
Citoplasma
CV-I S
Peptidoglicano
CV-I
CV-I
CV-I
CV-I
CV-I
CV-I
CV-I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
CV-I S
3 4
3 43
Álcool
acetona
Álcool
acetona
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Avaliação Microscópica
� Presença de bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas.
� Morfologia (cocos, bacilos, cocobacilos, espiriladas, pleomórficas, etc.).
� Arranjo (agrupadas, em cadeia, isoladas, aos pares).
� Localização (intra, extra-celulares).
Avaliação Microscópica
Avaliação Microscópica
 
 
 
Células - PMNs 
Média em 10 campos 
 (objetiva10 X) 
Bactérias e leveduras 
Interpretação - Gram 
(objetiva 100 X ) 
0 + ++ +++ + ++ +++ ++++ 
neg raro pouco muito raras poucas muitas numerosas 
0 1-9 10-25 >25 <1 1-5 6-30 >30 
 
Isenberg, H.D.Clinical Microbiology Procedures Handbook. Gram Stain, updated 2007.
Avaliação Microscópica
� Cocos Gram-positivos aos 
pares
� Cocos Gram-positivos em 
cadeia
� Cocos Gram-positivos 
agrupados em cachos
� Bacilos Gram-lábeis 
� Bacilos Gram-positivos 
corineformes 
� Bacilos Gram-positivos 
ramificados
� Diplococos Gram-negativos
� Bacilos Gram-positivos
� Bacilos Gram-negativos
� Bacilos Gram- negativos 
fusiformes
� Cocobacilos Gram-negativos 
� Leveduras e/ou pseudo-hifas
(em filamentação)
Avaliação Microscópica
� Presença de fungos leveduriformes e/ou filamentosos.
Avaliação Microscópica
� Presença de protozoários.
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Avaliação Microscópica
� Presença de leucócitos polimorfonucleares.
Fatores que afetam a avaliação
� Descoloração incompleta.
� Descoloração excessiva.
� Precipitação de corantes, restos bacterianos.
� Variações gram-lábeis.
� Morfologia (arranjo).
� Qualidade da amostra.
Fatores que afetam a avaliação
Precipitação
Tempo de exposição do corante Arranjo morfológico
Variações Gram-lábeis
Artefatos
Controle de Qualidade
� Cepas bacterianas padrões ATCC:
- Escherichia coli ATCC 25922
- Streptococcus pyogenes ATCC 19615
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Controle de Qualidade
� Preparo das lâminas:
- Suspensão bacteriana (2 mL de solução salina estéril)
- 30 lâminas (1 gota de suspensão)