Genética bacteriana - parte II

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2.3) Recombinação homóloga: troca de material genético homólogo 
entre duas moléculas de DNA 
 
- Diferentes processos de transferência do DNA de uma célula doadora para 
uma célula receptora 
 
 
 
 
 
 
- Importância: transferência de características fenotípicas entre duas células 
 
 Célula doadora Arg+ x Célula receptora Arg- 
 
 
 
 Células receptora Arg+ 
 
 
Proteína Rec – responsável pela recombinação do DNA 
 
A) Conjugação: 
 
 - necessidade de contato físico entre a célula doadora e a célula receptora 
 - transferência principal de plasmídios F 
 
Contato físico entre as células: 
 
 - bactérias Gram negativas: pilus sexual 
- possível transferência de genes do cromossoma pela conjugação: 
 - células Hfr – alta frequência de recombinação 
 - transposons simples no plasmídio e no cromossoma sofrem 
recombinação 
Contato físico entre bactérias Gram positivas: 
 
Bactéria receptora: feromônios sexuais 
Bactéria doadora: substância de agregação (parede celular) 
 
Ocorrência da conjugação: 
 
Alta: - entre espécies do mesmo gênero; 
 - entre espécies de gêneros diferentes. 
 
Grande disseminação de 
genes de resistência a antimicrobianos. 
 
B) Transformação: 
 
- presença de DNA no meio ambiente 
proveniente de bactérias lisadas 
 
- ocorrência: baixa: 
 
 - entre espécies do mesmo gênero; 
 
Gram positivas: Streptococcus, 
 Staphylococcus, 
 Bacillus 
 
Gram negativas: Haemophilus, 
 Neisseria 
 
 - entre gêneros diferentes: 
 
apenas entre Staphylococcus e 
Streptococcus 
C) Transdução: 
 
- transferência de DNA via bacteriófagos 
 
Bacteriófagos: 
 
- material genético envolto por proteínas (capsídeo) com especificidade 
de ligação a componentes da superfície bacteriana que tenham variação 
estrutural (antígeno O, cápsula) 
- controle da própria replicação apenas no citoplasma bacteriano 
- Transdução generalizada: transferência de qualquer segmento de DNA 
- Transdução especializada: 
 
 - transferência de determinados 
segmentos de DNA 
 
 - fagos temperados: DNA contém o 
gene da integrase e se insere no 
cromossoma bacteriano 
 
 - ocorrência - baixa: entre espécies 
do mesmo gênero 
D) Variabilidade: 
 
- Conjugação > Transformação > Transdução 
 
- Rápida disseminação de genes – seleção das células mais adaptadas 
 
- Expansão da resistência a antimicrobianos 
 
- Ausência de pressão seletiva: perda dos caracteres de patogenicidade, 
como plasmídios 
 
 
3) Tecnologia do DNA recombinante: 
 
 
Expressão de proteínas eucarióticas em células procarióticas 
 
 
- Etapa 1 - Obtenção e fragmentação do DNA de interesse: 
 
 - Proteína eucariótica: 
 
 - obter RNAm 
 - transcriptase reversa (RNAm  DNA) para 
 remoção de introns 
 
 - Uso de endonucleases de restrição bacterianas para fragmentar o 
DNA com extremidades complementares (coesivas) 
- Etapa 2 – Ligação dos fragmentos de DNA de interesse com um vetor de 
clonagem 
 
Vetor de clonagem: 
 
- replicação autônoma 
- replicação em grande número de cópias 
- vários sítios únicos para enzimas de restrição 
- promotores adequados para sua expressão 
- incorporação de sequência que codifique a excreção da proteína de interesse 
- marcadores metabólicos (resistência a antibióticos, degradação de 
metabólitos) 
 
- Exemplos: plasmídios, fagos temperados, cosmídios (plasmídio + DNA fago) 
 
- Etapa 3 – Introdução do DNA em uma bactéria hospedeira (clone recombinante) 
 
 
Conjugação, transdução ou transformação (íons Ca2+, eletroporação) 
 
 
- Etapa 4 - Amplificação dos clones recombinantes em meio de cultura 
 
Verificação da presença do vetor de clonagem: 
 
 - detecção da resistência a antimicrobianos 
 - genes repórter (degradação de metabólito do meio) 
- Etapa 5 – Detecção do clone recombinante produtor da proteína eucariótica: 
 
 - Detecção da proteína de interesse (anticorpos) 
 
 - Sondas moleculares - Segmento de DNA com sequência 
complementar ao DNA de interesse, com nucleotídeos radioativos 
 
- Mutação sítio-dirigida: 
 
- Indução da mutação em pontos 
específicos de um gene: 
 
Síntese de pequena sequência de 
nucleotídeos contendo a alteração 
(mutação) desejada 
 
Importância: melhoria da proteína a ser 
produzida