Métodos baixa resolução

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Métodos	
  de	
  baixa	
  resolução	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
Métodos de purificação de baixa resolução 
            
•  	
  Precipitação	
  fracionada	
  (solventes,	
  alterando	
  pH	
  e	
  [sais])	
  
•  	
  Separação	
  por	
  membranas	
  
•  	
  Extração	
  em	
  sistemas	
  de	
  duas	
  fases	
  líquidas	
  	
  
Separação por membranas 
            
•  Definição:	
   membrana	
   como	
   barreia	
   que	
   separa	
   2	
   fases	
   com	
   o	
  
transporte	
  parcial/total	
  das	
  moléculas	
  de	
  interesse	
  
•  UNlizada	
   tanto	
   para	
   separação	
   (clarificação	
   da	
   amostra)	
   quanto	
   para	
  
concentração	
  de	
  soluções!	
  
•  Íons,	
  macromoléculas,	
  vírus,	
  bactérias,	
  material	
  parNculado.	
  
ü  Economia	
  de	
  energia	
  =	
  mudança	
  de	
  fases	
  
ü  	
  Especificidade	
  =	
  SeleNvidade	
  
ü  	
  Separação	
  de	
  moléculas	
  termosensíveis	
  
ü  	
  Simplicidade	
  de	
  operação	
  e	
  ampliação	
  (scale	
  up)	
  
VANTAGENS	
  
Separação por membranas 
            
Filtração	
  convencional	
  	
  
(dead	
  end	
  point)	
  
Filtração	
  tangencial	
  
(cross	
  flow	
  filtraNon)	
  
•  Polarização	
  de	
  concentração	
  
•  Auxiliares	
  de	
  filtração	
  
•  Polarização	
  de	
  concentração	
  reduzida	
  
Separação por membranas 
            
Filtração	
  convencional	
  	
  
(dead	
  end	
  point)	
  
Filtração	
  tangencial	
  
(cross	
  flow	
  filtraNon)	
  
Separação por membranas 
            
Força	
  
motriz	
  
Aplicação	
  de	
  	
  uma	
  pressão	
  trasmembranar	
  
Separação por membranas 
            
Características das membranas 
            
•  Morfologia	
  	
  
•  Capacidade	
  seleNva	
  
	
  
Densas	
  ou	
  porosas	
  	
  
Isotrópicas	
  ou	
  anisotrópicas	
  
ü  CaracterísiNca	
  se	
  mantém	
  por	
  toda	
  a	
  estrutura	
  
ü  Caracterísitca	
  alterada	
  ao	
  longo	
  da	
  membrana	
  
Separação por membranas 
            
Osmose	
  reversa	
  ou	
  
hiperfiltração	
  
.	
  Esterilização	
  	
  	
  	
  	
  	
  
liquídos	
  e	
  gases	
  
Separação por membranas 
            
Separação por membranas 
            
(0,5-­‐2	
  bar)	
  
P	
   Diâmetros	
  do	
  
poro	
  
(5-­‐	
  0,5	
  µm)	
  
(1-­‐7	
  bar)	
   (500-­‐	
  1nm)	
  
(5-­‐25	
  bar)	
  
(15-­‐18	
  bar)	
  
(50-­‐10	
  Ao)	
  
(1-­‐10	
  Ao)	
  
Tamanho	
  do	
  poro	
   Pressão	
  aplicada	
  
Íons	
  bivalentes	
  
Vírus	
  
Bactérias	
  
300-­‐2000	
  Da	
  
Iso	
  ou	
  
anisotrópicas	
  
Anisotrópicas	
  
Morfologia	
  da	
  
membrana	
  
Anisotrópicas	
  
Anisotrópicas	
  
densas	
  
Separação por membranas 
            
Osmose	
  Inversa	
  
•  Membranas	
  anisotrópicas	
  densas	
  
•  	
  Alta	
  pressão	
  faz	
  com	
  a	
  água	
  atravessar	
  a	
  membrana	
  no	
  senNdo	
  da	
  solução	
  
+	
  concentrada	
  para	
  a	
  -­‐	
  concentrada.	
  
Separação por membranas 
            
Parâmetros	
  avaliados:	
  
•  	
  Fluxo	
  permeado:	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Volume	
  da	
  espécie	
  que	
  permeia	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Tempo	
  x	
  área	
  da	
  membrana	
  
•  Capacidade	
  seleNva:	
  coeficiente	
  de	
  rejeição	
  	
  
Princípio da partição líquido-líquido 
            Partição entre 2 fases: água e um solvente orgânico ou 
entre 2 fases aquosas 
            
•  	
  Extração	
  por	
  solvente	
  	
  
•  Extração	
  em	
  sistemas	
  de	
  duas	
  fases	
  aquosas	
  
	
   ü  Soluto	
  termosensível	
  e	
  em	
  baixa	
  [	
  ]	
  
ü  	
  Duas	
  soluções	
  aquosas	
  e	
  imiscíveis	
  	
  
Combinação	
   de	
   determinados	
   polímeros	
   e	
   polieletrólitos	
   ou	
  
polímeros	
  e	
  solutos	
  de	
  baixa	
  massa	
  molar!	
  
Sistemas de duas fases liquídas 
            Combinação	
  de	
  determinados	
  polímeros	
  e	
  polieletrólitos	
  ou	
  polímeros	
  e	
  
solutos	
  de	
  baixa	
  massa	
  molar!	
  
PEG	
  =	
  polímero	
  sintéNco	
  comercializado	
  em	
  diferentes	
  massas	
  molares	
  	
  
Dextranas	
  =	
  massas	
  molares	
  de	
  10	
  mil-­‐	
  2	
  milhões	
  Da	
  
Polímeros	
  
não-­‐iônicos	
  
Polieletrólitos	
  
Sulfato	
  dextrana	
  de	
  sódio	
  =	
  carga	
  residual	
  negaNva	
  
Sais	
  
MgSO4	
  
K2PO4	
  
Sistemas de duas fases liquídas 
            
Mistura	
  das	
  2	
  soluções	
  	
  
Separação	
  das	
  fases	
  	
  
Coleta	
  das	
  fases	
  	
  
1	
  
2	
  
3	
  
1).	
  Estoque	
  das	
  soluções	
  concentradas,	
  
misturas	
  as	
  2	
  soluções!	
  
	
  
2).	
  Agitação	
  por	
  vortex	
  ou	
  por	
  inversão	
  	
  
	
  
	
  
	
  
3).	
  Separação	
  das	
  fases	
  em	
  repouso	
  	
  
ou	
  separação	
  acelerada	
  pela	
  
centrifugação.	
  
	
  
4).	
  RepeNção	
  
	
  
5).	
  Coleta	
  das	
  fases	
  em	
  separado	
  
	
  
	
  
Sistemas de duas fases liquídas 
            
Diagrama de equilíbrio 
            
Reta	
  TMB:	
  linha	
  de	
  amarração	
  (“)e-­‐line”)	
  
	
  
Curva	
  de	
  equilíbrio	
  de	
  um	
  sistema	
  PEG/fosfato	
  	
  
Avaliação da extração 
            
Coeficiente	
  de	
  parPção,	
  K	
  =	
  grandeza	
  adimensional	
  expressando	
  a	
  relação	
  entre	
  
as	
  concentrações	
  da	
  molécula	
  nas	
  2	
  fases.	
  Avalia	
  a	
  extensão	
  da	
  separação	
  
K	
  	
  =	
   Ct	
  
CF	
  
Ct	
  	
  [	
  	
  ]	
  da	
  molécula	
  na	
  fase	
  de	
  topo	
  (g/L)	
  
Cf	
  	
  [	
  	
  ]	
  da	
  molécula	
  na	
  fase	
  de	
  fundo	
  (g/L)	
  
	
  
K	
  	
  	
   Molécula-­‐alvo	
  	
  contaminante	
   Purificação	
  
Eficiência	
  da	
  separação	
  de	
  2	
  moléculas	
  (alvo	
  e	
  contaminante):	
  Relação	
  entre	
  as	
  
constantes	
  K	
  
	
  	
   Ka	
  
Kc