Aula de enzimas

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Enzimas 
• Conceito 
• Histórico 
• Importância 
• Estrutura (Cofatores, Coenzimas, Grupos prostéticos) 
• Nomenclatura e Classificação 
• Catálise enzimática 
• Efeito da [Substrato] (Conceito de Km e Vmáx) 
• Efeito do pH 
• Efeito da Temperatura 
• Medição da atividade enzimática 
• Expressão da atividade enzimática (Atividade enzimática, Atividade 
específica) 
• Especificidade das enzimas (Absoluta e relativa) 
• Isoenzimas 
• Inibição enzimática (Competitiva, não Competitiva e Acompetitiva) 
• Enzimas alostéricas 
• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Enzimas 
• Conceito 
• Histórico 
• Importância 
• Estrutura (Cofatores, Coenzimas, Grupos prostéticos) 
• Nomenclatura e Classificação 
• Catálise enzimática 
• Efeito da [Substrato] (Conceito de Km e Vmáx) 
• Efeito do pH 
• Efeito da Temperatura 
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• Expressão da atividade enzimática (Atividade enzimática, Atividade 
específica) 
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• Isoenzimas 
• Inibição enzimática (Competitiva, não Competitiva e Acompetitiva) 
• Enzimas alostéricas 
• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Enzimas são proteínas especializadas (com a 
exceção de um pequeno grupo de RNAs) que 
têm como função acelerar reações químicas, 
sem alterar a constante de equilíbrio da reação. 
 
 
 
 
 
aumentam a velocidade da reação atuando como 
um Catalisador 
 
Complementariedade entre a proteína e o ligante é raramente perfeita .A interação envolve alterações na conformação 
de uma ou ambas moléculas em um processo denominado encaixe induzido. Esta falta de complementariedade perfeita 
é importante para a catálise enzimática. 
 
Formas complementares de um substrato pelo seu sítio ligante na enzima 
Dihidrofolato redutase 
NADP+ 
Tetrahidrofolato 
ENZIMA 
SUBSTRATO 
COENZIMA 
Dihidrofolato redutase 
NADP+ 
Tetrahidrofolato 
COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO (ES) 
Enzimas 
• Conceito 
• Histórico 
• Importância 
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• Expressão da atividade enzimática (Atividade enzimática, Atividade 
específica) 
• Especificidade das enzimas (Absoluta e relativa) 
• Isoenzimas 
• Inibição enzimática (Competitiva, não Competitiva e Acompetitiva) 
• Enzimas alostéricas 
• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Final do século XVIII – Foi reconhecida a existência de Catálise biológica, através de estudos 
da digestão da carne por secreções do estômago. 
Histórico 
No século XIX – Conversão do amido em açúcar pela saliva e extrato de plantas 
1897 – Eduard Buchner descobriu que extratos de leveduras fermentavam o açúcar em álcool 
mostrando que este processo continuava a funcionar mesmo após serem removidas 
das células. Frederick W. Kühne denominou estas moléculas de Enzimas. 
1926 – Urease foi isolada e cristalizada por James Sumner. Sumner descobriu que os cristais 
de urease consistiam inteiramente de proteínas e postulou que todas as enzimas eram 
proteínas. 
1930 – Os estudos foram aceitos após John Northrop e Moses Kunitz terem cristalizada a 
pepsina, tripsina e outras enzimas digestivas e concluiu que todas eram proteínas. 
Nesta época J.B.S. Haldane escreveu um tratado intitulado Enzymes. Apesar da 
natureza molecular das enzimas não ter sido completamente analisada, Haldane 
propôs que as interações fracas entre as enzima e o substrato poderiam ser utilizadas 
para catalisar a reação. 
1850s – Louis Pasteur concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pelas leveduras era 
catalisada por “fermentos”. Ele postulou que os “fermentos” eram inseparáveis das 
células de leveduras vivas. Foi denominado vitalismo e permaneceu por décadas. 
Enzimas 
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• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Visão Geral de um Mapa 
Metabólico 
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• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
 
RNA 
Estrutura 
Enzimática 
Ribozimas 
Se covalente 
Apoenzima ou 
Apoproteína 
Holoenzima 
Cofator Proteína 
Pode ser: 
• íon inorgânico 
• molécula orgânica 
 
Coenzima 
 
 
Grupo Prostético 
 
 
Cofator 
 
Enzimas 
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Nomenclatura e Classificação das 
enzimas 
• As enzimas são classificadas com base nas 
reações que catalisam. 
 
 – Nome do substrato + Sufixo ase: 
 Ex: Urease hidrólise da uréia 
 
Enzimas 
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• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Catálise enzimática 
Substrato 
Se a enzima somente ligasse ao 
Substrato, não existiria reação 
Estado de transição Produto 
Enzima não somente reconhece o substrato, 
Mas também induz a formação do estado de transição 
Adaptado de Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252 
X 
A natureza da catálise enzimática 
● Enzima fornece uma superfície catalítica 
● Esta superfície estabiliza o estado de transição 
● Estado de transição transformado em produto 
B 
B A Superfície catalítica 
A 
Juang RH (2004) BCbasics 
Enzima Estabiliza o Estado de Transição 
S 
P 
ES 
ES
T 
EP 
S
T 
Direção de reação 
Alteração de E 
E
n
erg
ia req
u
erida (sem
 catálise) 
E
n
erg
ia d
im
in
u
i (so
b
 catálise) 
T = Estado de transição 
Adaptado de Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166 
Sítio ativo é um bolsão profundo enterrado 
Porque a energia necessária para atingir o 
estado de transição é menor no sítio ativo? 
É um bolsão mágico 
(1) Estabiliza a transição 
(2) Expele água 
(3) Grupos reativos 
(4) Coenzimas auxiliam 
(2) 
(3) 
(4) 
(1) CoE 
+ 
- 
Juang RH (2004) BCbasics 
Sítio Ativo evita a influência da água 
Previne a influência da água na manutenção de formações iônicas estáveis. 
Adaptado de Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.115 
- 
+ 
Asp102 
His57 
Ser195 
Tríade catalítica 
H H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
N 
C 
C 
N 
[HOOC] 
H 
O 
C 
C 
N 
C 
C 
[NH2] 
O 
Checagem da especificidade do substrato 
Asp102 
His57 
Ser195 
H H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
O 
Primeiro estado de transição 
H 
H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
O 
Intermediário Acil-Enzima 
H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
O 
Intermediário Acil-Enzima Água 
H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
O 
Segundo Estado de Transição 
O 
H 
H 
Mecanismo catalítico da Quimiotripsina 
O 
O 
H 
Deacilação 
Enzimas 
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 A
u
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 c
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c
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ç
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2 1 3 4 5 6 7 8 0 
0 2 4 6 8 
Substrato (mmole) 
P
ro
d
u
to
 
80 
 
 
60 
 
 
40 
 
 
20 
 
 
0 
S 
+ 
E 
↓ 
P 
(em
 um
 período de tem
po fixo) 
Juang RH (2004) BCbasics 
Essencial de Cinética Enzimática 
E S + P + 
Teoria do Steady State 
Em Steady State, a produção e o consumo do 
estado de transição ocorre na mesma proporção, de 
forma que permanece constante. 
S E E 
Juang RH (2004) BCbasics 
Concentração constante de ES no Steady State 
S 
P 
E 
ES 
Tempo de reação 
C
o
n
c
e
n
tra
ç
ã
o
 
Juang RH (2004) BCbasics 
Um exemplo de cinética enzimática (Invertase) 
Vmax 
Km S 
vo 
1/S 
1 
vo 
Duplos recíprocos Plot direto 
 1) Usar quantidade pré-definida de Enzima → E 
 2) Adicionar substrato em várias concentrações→ S 
 3) Medir o Produto em tempos fixos(P/t) → vo 
 4) (x, y) plotar curva hiperbólica, estimar → Vmax 
 5) Quando y = 1/2 Vmax calcular x ([S]) → Km 
1 
Vmax 
- 1 
Km 
1/2 
J
u
a
n
g
 R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
s
ic
s
 
Um exemplo real de cinética enzimática 
D
a
d
o
s
 
no 
1 
2 
3 
4 
0.25 
0.50 
1.0 
2.0 
0.42 
0.72 
0.80 
0.92 
Absorbância v (mmole/min) [S] 
0.21 
0.36 
0.40 
0.46 
(1) O produto foi lido a 600 nm em espectrofotômetro (0.05 per mmole) 
(2) Tempo de reação foi 10 min 
 Velocidade Substrato Produto Duplos recíprocos 
1/S 1/v 
4 
2 
1 
0.5 
2.08 
1.56 
1.35 
1.16 
→ 
→ 
→ 
→ 
1.0 
 
 
0.5 
 
 
0 
v 
P
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2.0 
 
 
1.0 
 
 
0 
1/v 
-4 -2 0 2 4 
1/[S] 
0 1 2 
[S] 
1.0 
-3.8 
J
u
a
n
g
 R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
s
ic
s
 
Enzimas 
• Conceito 
• Importância 
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• Nomenclatura e Classificação 
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• Efeito da [Substrato] (Conceito de Km e Vmáx) 
• Efeito do pH 
• Efeito da Temperatura 
• Medição da atividade enzimática 
• Expressão da atividade enzimática (Atividade enzimática, Atividade 
específica) 
• Especificidade das enzimas (Absoluta e relativa) 
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• Inibição enzimática (Competitiva, não Competitiva e Acompetitiva) 
• Enzimas alostéricas 
• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
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• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Medição da atividade enzimática 
• Saber equação geral da reação 
• Se a enzima requer cofatores 
• pH ótimo 
• Temperatura 
• Km 
• Uma técnica para medir o desaparecimento 
de substrato ou o aparecimento de produto. 
 
 
Lactato + NAD+ ↔ Piruvato + NADH 
 
Enzimas 
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• Enzimas moduladas por modificação covalente 
 
 
Unidades de Atividade Enzimática 
Tempo de reação (min) 
P
ro
d
u
to
 [
P
] 
0 10 20 30 40 
Inclin 
tan 
 S → P mmole 
 vo = [P] / min 
Unid.= 
Unid. Atividade 
Proteína (mg) 
 t 
mmole /min 
y 
x 
y 
x 
= tan 
J
u
a
n
g
 R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
s
ic
s
 
Atividade 
Específica = 
Enzimas 
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específica) 
• Especificidade das enzimas (Absoluta e relativa)• Isoenzimas 
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Especifidade das enzimas 
• Absoluta: somente atua sobre um substrato 
 
• Relativa: atua em mais de um substrato e 
geralmente com Km diferentes. 
Enzimas 
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Princípios de Bioquímica de Lehninger – David L. Nelson & Michael M. Cox 
Fígado 
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Inibição enzimática (Mecanismo) 
I
I
S
S
S
I
I
I
I
I
S
Competitiva Não-competitiva Imcompetitiva 
E 
E 
Sítio diferente 
Compete pelo 
sítio ativo Inibidor 
Substrato 
E
s
q
u
e
m
a
 
E
qu
aç
ão
 e
 D
es
cr
iç
ão
 
[I] Liga somente a [E] livre, 
e compete com [S]; 
aumentando [S] desloca o 
inibidor [I]. 
[I] Liga a forma livre [E] ou 
O complexo [ES]; Aumentando 
a [S] não melhora a inibição [I] 
[I] Liga somente ao 
complexo [ES], aumentando 
[S] favorece a inibição por [I]. 
E + S → ES → E + P 
 + 
 I 
↓ 
EI 
 ← 
 ↑ 
E + S → ES → E + P 
 + + 
 I I 
↓ ↓ 
EI + S →EIS 
 ← 
 ↑ ↑ 
E + S → ES → E + P 
 + 
 I 
 ↓ 
 EIS 
 ← 
 ↑ 
E
I
S
Juang RH (2004) BCbasics 
Km 
Inibição enzimática (Plots) 
I
I
I
Competitiva Não-competitiva Imcompetitiva 
 
P
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D
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D
u
p
lo
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Vmax Vmax 
Km Km’ [S], mM 
vo 
[S], mM 
vo 
I I 
Km [S], mM 
Vmax 
I 
Km’ 
Vmax’ Vmax’ 
Vmax não alterada 
Km aumentado 
Vmax diminuído 
Km não alterado 
Vmax & Km diminuído 
I 
1/[S] 1/Km 
1/vo 
1/ Vmax 
I 
Duas linhas 
paralelas 
I 
 
 
Intersecto 
no eixo X 
1/vo 
1/ Vmax 
1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 
1/ Vmax 
1/vo 
 Intersecto 
 no eixo Y 
= Km’ 
Juang RH (2004) BCbasics 
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V
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Figure 18-2a X-Ray structure of rabbit muscle glycogen 
phosphorylase. (a) Ribbon diagram of a phosphorylase b 
subunit. 
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 6
2
8
 
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Figure 18-2a X-Ray structure of rabbit muscle glycogen 
phosphorylase. (a) Ribbon diagram of a phosphorylase b 
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