Roteiro de aula 8 Técnicas de imunodiagnóstico

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Técnicas de Imunodiagnóstico
Profa. Juliana Normando Pinheiro
Universidade de Cuiabá
Como utilizar a Resposta Imune (RI) para diagnosticar uma doença?
Direta
Busca por antígenos
Anticorpos são utilizados para detectar/identificar antígenos
Indireta
Busca por anticorpos específicos no soro de um animal
Determina que ele foi previamente exposto a um agente infeccioso
Reagentes utilizados em testes sorológicos
Soro:
Fonte mais comum de anticorpos
Produto de sangue coagulado
Pode ser armazenado congelado e testado quando for conveniente
Antiglobulinas:
São anticorpos específicos contra as imunoglobulinas
Capaz de detectar as imunoglobulinas
Disponíveis comercialmente 
Anti IgG cão
Anti IgG felino
Anti IgG caprino...
Anticorpos monoclonais:
São anticorpos produzidos por um único clone de linfócito B gerados por camundongos, cujos sistemas imunológicos foram estimulados pelos antígenos de interesse.
São puros e específicos
Podem ser utilizados como reagentes químicos padrão e em quantidades quase ilimitadas
Principais características dos ensaios de imunodiagnóstico
Reprodutibilidade:
Refere-se à obtenção de resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra, por pessoas diferentes em locais diferentes
Remete à confiabilidade, precisão do teste
Validade 
Grau em que o exame é apropriado para medir o verdadeiro valor daquilo que é medido, observado ou interpretado.
Capacidade de produzir valore muito próximos aos obtidos num ensaio de referência (padrão ouro)
Remete à Acuidade, acurácia ou exatidão
Sensibilidade:
É a capacidade de detectar amostras verdadeiramente positivas
Probabilidade do teste dar positivo em pacientes sabidamente doentes
É a proporção de resultados positivos verdadeiros.
Teste com alta sensibilidade pode dar elevado nº de Falsos Positivos (Reações positivas em indivíduos sabidamente sadios)
Quanto maior a sensibilidade, menor a ocorrência de Falsos Negativos
Especificidade:
É a capacidade de detectar amostras verdadeiramente negativas
Probabilidade do testes dar negativo em pacientes sabidamente sadios
É a proporção de resultados negativos verdadeiros.
Teste com alta especificidade pode dar elevado nº de Falsos Negativos (teste negativo em pacientes sabidamente doentes)
Quanto maior a especificidade, menor a ocorrência de Falsos positivos
Ponto de corte (“cut –off”)
É o valor que define o limite entre um teste negativo e positivo
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=y7Puf75vK0w
Objetivos dos Testes Sorológicos
Para Diagnóstico
É necessário a utilização de testes mais específicos, sendo importante evitar os testes falso positivos.
Doenças de Notificações obrigatórias
Para Triagem
São utilizados com fins preventivos
Busca-se evitar os testes falso-negativos – testes mais sensíveis
Permite a detecção precoce de doenças, melhorando o prognóstico
Testes Sorológicos
Qualitativos: resultados informam se houve ou não reação ( + ou -)
Quantitativos: há determinação de um valor dentro de uma determinada escala
 
Semi-quantitativo: amostra testada é diluída (a maior diluição a apresentar reação é o seu título) 
Ex: detecção por imunofluorencência de anticorpos IgG contra o T. Cruzi Resultado: positivo até a diluição de 1:320
 Quantitativo: informa a quantidade absoluta do material detectado: 
Ex: detecção de ELISA de anticorpos IgM contra T.gondii Resultado: 63 UI/ml
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Reação baseada na reação antígeno-anticorpo
Conjugado: Anticorpo é marcado com pigmentos/corantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína - FITC)
Anticorpos marcados com FITC são utilizados nos testes de fluorescência direta e indireta.
Corante fluorescente:
Utilizado como marcador de ligação primária (Ag-Ac)
É um componente amarelo que pode se ligar ao Ac sem alterar sua reatividade
Quando submetido à luz UV ou azul o FITC emite uma luz verde fluorescente (microscópio de epifluorescência)
Imunofluorescência Direta
Pesquisa a presença de antígenos em células ou tecidos através de um Ac fluorescente 
Detecções diretas de microrganismos em secreções, urina, fezes e em cortes de tecidos
Anticorpo contra um antígeno específico é acoplado ao FITC.
O tecido é fixado a uma lâmina de vidro e incubado com o anticorpo marcado. 
Quando examinados em um microscópio com luz ultravioleta, os anticorpos que reconheceram e se ligaram aos antígenos irão exibir intensa fluorescência.
Vantagens:
Alta especificidade e sensibilidade
Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização
Desvantagens:
Alto custo com o microscópio de epifluorescência
Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja localizar ou identificar
Subjetividade na leitura 
Utilização: Erliquiose, Raiva
Imunofluorescência Indireta (RIFI)
Pesquisa a presença de anticorpos no soro 
Utiliza Ac (Antiglobulina) fluorescente (conjugado) 
Necessário a preparação da lâmina com Ag
Imunofluorescência Indireta (RIFI)
O antígeno é utilizado como um esfregaço, um corte de tecido ou cultura celular em uma lâmina ou lamínula. 
Incubação com soro suspeito de conter anticorpos contra o tal antígeno. 
O soro é lavado, deixando apenas os anticorpos específicos ligados ao antígeno 
Estes anticorpos ligados podem, então, ser detectados incubando o esfregaço com antiglobulina marcada com FITC. 
A presença de fluorescência indica que o anticorpo estava presente no soro testado.
Vantagens:
Sensibilidade
Especificidade
Reprodutibilidade
Simples padronização e execução
O mesmo conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes
Desvantagens:
Alto custo com o microscópio de epifluorescência
Subjetividade na leitura - Na detecção de anticorpos não detecta baixos títulos
Utilização: Doença de Chagas, AIDS, Hepatites, FMB - febre maculosa brasileira, Toxoplasmose, Neosporose, Erliquiose 
ELISA – ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Base: reação antígeno anticorpo
Detectar a presença de Ag ou Ac em fluidos corporais ou sobrenadantes de culturas
Complexo Ag/Ac e a sensibilidade de uma reação enzimática: enzima e substrato
Utiliza um conjugado (anticorpos marcados com enzima) e substrato cromogênico (leva à mudança de cor)
Vantagens: 
Rápido 2-3 horas;
Automatizável
Alta sensibilidade (detecta quantidades mínimas de Ag ou Ac) 
Alta especificidade (detecta somente o Ag ou Ac pesquisado)
Pode-se testar várias amostras de uma só vez
Desvantagens: 
Alguns kits comercias podem ser caros
Equipamentos de leitura com alto custo 
Alguns reagentes podem degradar
Direto ou sanduiche
Detecta o Antígeno
Aplicações: Dosagem de hormônios, marcadores tumorais, proteínas séricas, detecção de antígenos virais e outros patógenos nas fezes, urina e em secreções; Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenos e contaminantes nos alimentos)
Indireto
Detecta o anticorpo
Aplicações: Diagnósticos sorológicos de doenças infecciosas para a detecção de Igs, como Doença de Chagas, Leishmaniose, Toxoplasmose, Erliquiose...
Microplaca de poliestireno com 96 poços. Cada poço é uma amostra.
ELISA direto ou sanduiche
ELISA indireto
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=lUWpWKVcmc4
IMUNOCROMATOGRAFIA
Teste rápido qualitativo (5 -15 min)
Triagem feita no próprio ambulatório
Fácil interpretação e alta sensibilidade e especificidade
Utilizado para detecção de anticorpos ou antígeno
Aplicações: detecção de doenças infecciosas e parasitárias, como dengue, málaria, leishmaniose visceral, FIV, FELV, cinomose, parvovirose canina.
Amostra passa por uma tira porosa;
Direta: Amostra passa pela zona de detecção, que possui anticorpos contra o antígeno ligados a ouro coloidal (rosa) ou selênio coloidal (cor azul);
Indireta: Amostra passa pela zona de detecção, que possui antígenos ligados a ouro coloidal (rosa) ouselênio coloidal (cor azul);
Forma imunocomplexos Ag + Ac
Sempre tem que ter uma banda de controle 
Resultado positivo: linha rosa ou azul surge na zona de detecção
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=_VnPIlJclEc
TESTE DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA
Rápido, Barato; Fácil; 
Prova pode ser realizada a campo
É o agrupamento de antígenos após a interação com anticorpos específicos, levando a uma alteração do estado físico.
Os anticorpos, uma vez ligados, levam as partículas a se agruparem de modo visível num fenômeno conhecido como aglutinação/coagulação.
Teste de Aglutinação rápida
Teste do Antígeno acidificado tamponado (AAT):
Destinado à triagem sorológica para Brucelose
Soro do animal é misturado ao antígeno (suspensão de Brucella abortus corada com Rosa Bengala). 
No caso da amostra possuir anticorpos contra a bactéria, desenvolve-se uma reação de aglutinação visível a olho nu
Teste do Antígeno acidificado tamponado
Tipagem sanguínea
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=LAx8ghaNtss
IMUNODIFUSÃO EM GEL DE ÁGAR (IDGA)
Técnica simples, Barata, e qualitativa.
Sensibilidade e especificidade razoável
Princípio: precipitação de complexos Ag-Ac
Utilizada principalmente para detectar anticorpos, contudo pode ser usada para detectar antígenos
Muito utilizada como técnica de triagem
Desvantagens: 
Pode não detectar níveis baixos de anticorpos 
Reações inespecíficas
Tempo de obtenção dos resultados (incubação até 72 horas) 
Aplicações: Anemia Infecciosa Equina, Leucemia Viral Bovina, Leucemia Viral Felina, Artrite Encefalite Caprina...
Um poço é preenchido com antígeno e outro com amostra (soro).
Positivo: Ag e soro se difundem e se encontram formando uma linha de precipitação no gel observada a olho nu.
Negativo: não forma a linha de precipitação
 
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=Fnx5CkGRBEM
HEMAGLUTINAÇÃO
Capacidade hemaglutinante de alguns vírus
Alguns vírus podem se ligar e aglutinar eritrócitos de mamíferos e aves
Rápida, fácil, de boa sensibilidade e especificidade
Pesquisa de antígeno (fluidos corporais, suspensões de tecidos, fezes) 
Aplicação: diagnóstico da parvovirose canina
A proteína do capsídeo viral confere ao vírus a capacidade de aglutinar hemácias de suíno in vitro
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Presença de anticorpos leva a ativação do complemento e lise da célula (eritrócito)
Boa sensibilidade e especificidade;
Contudo: demorado, trabalhoso, não automatizável;
Utilizado para exames de Mormo
Um soro teste é titulado em diluição seriada e uma quantidade fixa de antígeno é adicionada a cada poço.
Etapa 1- No soro teste coloca-se antígenos específicos. Se o anticorpo estiver presente no soro, formam-se complexos imunes.
Etapa 2- O complemento é então adicionado à solução e se junta ao complexo imune formado, sendo fixado e consumido. 
Etapa 3- As células indicadoras (eritrócitos), juntamente com anticorpos antieritrócito) são adicionados à mistura.
Se houver qualquer complemento remanescente, estas células serão lisadas. 
Se o complemento tiver sido consumido na etapa dois pelos complexos imunes (Ag- Ac), as células não serão lisadas. 
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=q3K_rH652Yk
IMUNOHISTOQUÍMICA
Combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas objetivando identificar antígenos tissulares através de Ac específicos
Possibilita visualizar a distribuição e localização do antígeno
Enzimas conjugadas às imunoglobulinas são utilizadas para localizar antígenos em cortes de tecidos
Peroxidase: marcador mais utilizado
Vantagens 
Baixo custo a moderado
Alta sensibilidade e especificidade 
Análise de um antígeno em vários tecidos em uma mesma lâmina
Desvantagens 
Mão-de-obra
Longo tempo
Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada pelo observador
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=mpK5ojrXQs0