Apostila 2012 completa - imunologia clínica

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Professores: Dennis Armando Bertolini 
Maria Valdrinez Campana Lonardoni 
 Sandra Mara Alessi Aristides 
 Thaís Gomes Verzignassi Silveira 
 
 
 
Fevereiro – 2011 
Aulas práticas 
Manual deManual deManual deManual de 
ImunoImunoImunoImunologia logia logia logia 
ClínicaClínicaClínicaClínica 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E BIOMEDICINA 
 
 
MANUAL DE IMUNOLOGIA CLÍNICA 
 
 
ÍNDICE 
 
PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE REAGENTES................................ 1 
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA GRAVIDEZ.......................................... 9 
IMUNOHEMATOLOGIA................................................................................. 16 
PROVAS REUMÁTICAS................................................................................ 23 
IMUNODIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS BACTERIANAS 
- BRUCELOSE........................................................................................ 
- LEPTOSPIROSE.................................................................................. 
- INFECÇÕES POR ESTREPTOCOCOS.............................................. 
- SÍFILIS.................................................................................................. 
 
36 
39 
43 
48 
IMUNODIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS PARASITÁRIAS 
- DOENÇA DE CHAGAS......................................................................... 
- TOXOPLASMOSE................................................................................ 
- LEISHMANIOSES................................................................................. 
- ESQUISTOSSOMOSE......................................................................... 
- MALÁRIA.............................................................................................. 
- CISTICERCOSE................................................................................... 
 
55 
60 
67 
70 
72 
73 
IMUNODIAGNÓSTICO DAS VIROSES 
- MONONUCLEOSE INFECCIOSA......................................................... 
- HEPATITES VIRAIS.............................................................................. 
- RUBÉOLA............................................................................................. 
- SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA............................ 
- CITOMEGALOVÍRUS........................................................................... 
 
75 
82 
95 
105 
119 
NORMAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE PATOLOGIA 
CLÍNICA.......................................................................................................... 
 
122 
 
 
 
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Aristides SMA, Bertolini DA, Lonardoni MVC, Silveira TGV 
 
1 
PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE REAGENTES 
 
1) COLHEITA DE SANGUE DE CARNEIRO 
Colher o sangue de carneiro esterilmente em solução Alsever, volume a volume. Distribuir em tubos 
estéreis com tampão de algodão hidrófobo. Armazenar em geladeira até o uso. Estável até 3 meses em 
geladeira. 
 
2) PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS DE CARNEIRO A 2% 
a) Filtrar as hemácias em algodão para um tubo de centrífuga. 
b) Lavar as hemácias 3 vezes por centrifugação (1.500 rpm - 10 min.), com solução fisiológica. Após a 
última lavagem o sobrenadante deve estar límpido. 
c) Preparar a suspensão a 2% em solução fisiológica, p.ex., para 10 ml da suspensão: 0,2 ml da papa de 
hemácias + 9,8 ml de solução fisiológica. 
d) Conferir a concentração através de leitura no espectrofotômetro: 
- tomar 0,3 ml da suspensão a 2% e acrescentar 2,7 ml de água destilada. 
- em 545 nm, a absorbância deve ser de 0,44 ± 0,02. 
e) Para corrigir a suspensão a 2%, caso a D.O. não esteja nesta faixa, proceder assim: 
 
Se a D.O. for superior, acrescentar solução fisiológica.- Se, for inferior, acrescentar hemácias. 
 
- em qualquer dos dois casos, repetir o ítem "d" para conferir. 
f) Pode-se usar a seguinte fórmula para a correção: 
 
D.O.1 x V1 = D.O.2 x V2 D.O.2 x V2 
 
 
V1= D.O.1 
 
D.O.1: 0,44 D.O.2:obtida V2: vol. final da suspensão (10,0 - 0,3 = 9,7) 
 
 
Exemplos de aplicação da fórmula: 
 
Ex. 1: D.O.2 = 0,40 Ex. 2: D.O.2 = 0,50 
 
0,40 x 9,7 0,50 x 9,7 V1 = 0,44 V1 = 8,8 ml V1 = 0,44 V1 = 11,02 ml 
 
Ambos resultados referem-se ao volume de suspensão para a quantidade de hemácias usada 
 
Portanto: 
 
V1 = 9,7 - 8,8 V1 = 11,02 - 9,7 
 
V1 = 0,9 ml V1 = 1,32 ml 
 
 
Acrescentar hemácias p/ este 
volume ficar a 2% 18µl) 
 Volume de solução fisiológica a 
ser acrescentado 
 
 
 
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2 
3) TITULAÇÃO DA HEMOLISINA 
 
a) Materiais e reagentes: 
- suspensão de hemácias de carneiro padronizada a 2% 
- hemolisina pura (Tubos de 1 a 5: é o soro de coelho anti-hemácia de carneiro) 
- soro fresco de cobaia (fonte de complemento) diluído a 1/50 
- solução fisiológica 
- duas estantes com 15 tubos de ensaio e uma estante com 15 tubos de ensaio, em banho de gelo 
- banho maria a 37°C 
b) Diluir a hemolisina pura a 1/100 em solução fisiológica. 
c) Prepare sua estante com os tubos arranjados da seguinte forma: 
 
1 
 
 
2 3 4 5 
 6 7 8 
 9 10 11 
 
 
 
 12 13 14 
 
 
 
 15 
 
d) Agora distribua solução fisiológica, como indicado no esquema abaixo (observe que cada tubo recebe um 
volume diferente de solução fisiológica): 
1 
 
 
2 
 
 1 ml 
3 
 
 2 ml 
4 
 
 3 ml 
5 
 
 4 ml 
 
 
 
 6 
 
 1 ml 
7 
 
 1 ml 
8 
 
 1 ml 
 9 
 
 1 ml 
10 
 
 1 ml 
11 
 
 1 ml 
 
 
 
 12 
 
 1 ml 
13 
 
 1 ml 
14 
 
 1 ml 
 
 
 
 15 
 
 1 ml 
 
 
 
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3 
 
e) Agora você vai distribuir 1,0 ml da solução de hemolisina diluída 1/100 (ver item b) nos tubos de no. 1 a no. 
5 
 
f) Observe o próximo esquema e transfira 1,0 ml de cada tubo, conforme a direção da flecha. 
 
1 
 
 
(1/100) 
2 
 
 
 1,0 ml 
(1/200) 
3 
 
 
 2,0 ml 
 
(1/300) 
4 
 
 
 3,0 ml 
 
(1/400) 
5 
 
 
 4,0 ml 
 
(1/500) 
 
 
 
 
 6 
 
 
 1 ml 
 
(1/600) 
7 
 
 
 1,0 ml 
 
(1/800) 
8 
 
 
 1,0ml 
 
(1/1000) 
 
 
 
 
 9 
 
 
 1,0ml 
 
(1/1200) 
10 
 
 
 1,0ml 
 
(1/1600) 
11 
 
 
 1,0ml 
 
(1/2000) 
 
 
 
 
 12 
 
 
 1,0ml 
 
(1/2400) 
13 
 
 
 1,0ml 
 
(1/3200) 
14 
 
 
 1,0ml 
 
(1/4000) 
 
 
 
 
 15 
 
 
 1,0ml 
(1/4800) 
 
 
"Você terminou de fazer a diluição da hemolisina. Se colocar os tubos em ordem crescente poderá 
observar que embora o volume de cada tubo varie, cada um deles tem uma diluição diferente: 1/100, 
1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/800, 1/1000, 1/1200, 1/1600, 1/2000, 1/2400, 1/3200, 1/4000e 
1/4800." 
 
g) Terminada esta etapa, pegue outra estante com 15 tubos de ensaio numerados e transfira 0,5ml de cada 
diluição para o novo tubo com o mesmo número, iniciando pelo tubo no. 15 e usando a mesma pipeta. Ao 
final você terá as diluições em ordem crescente, de 1/100 até1/4800, e volumes iguais em todos os tubos. 
h) Na próxima etapa você deve acrescentar 0,5ml de uma suspensão de hemácias de carneiro padronizada 
a 2% a cada tubo. 
 
"Nesta etapa você está sensibilizando as hemácias com doses cada vez menores de anticorpos. Qual 
será o tubo que contém a concentração ideal de hemolisina (anticorpos)?" 
 
i) Para descobrir isso você vai incubar os tubos em banho-maria a 37o.C por 30 minutos. 
j) Use este tempo para preparar outra estante com 15 tubos numerados, em uma bandeja com gelo. 
 
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4 
⇒ Distribua em cada tubo 0,5ml de uma solução contendo o soro fresco de cobaia (é a fonte do 
complemento) diluído 1/50 
 
ATENÇÃO!!! 
 
l) Quando terminar o tempo de incubação retire a estante do banho-maria agite bem e transfira 0,2ml de 
cada tubo contendo a suspensão de hemácias para o tubo correspondente contendo o complemento. Inicie 
pelo tubo no. 15. Use a mesma pipeta. 
m) Leve em banho-maria a 37o.C durante 30minutos. 
n) Ao término deste tempo, retire a estante do banho-maria, agite bem e faça a leitura: 
⇒⇒⇒⇒ Observe todos os tubos e verifique qual apresenta hemólise total. 
 
 
 
 
 
 
 
⇒⇒⇒⇒ Exemplo: 
hemólise até o tubo no. 4 ���� diluição: 1/400 
���� Então a diluição de hemolisina capaz de sensibilizar as hemácias de forma adequada, 
fixando o complemento é 1/400. 
 
A diluição 1/400 da hemolisina é considerada 1 unidade. 
Nas reações são usadas 2 unidades de hemolisina. 
 
RESPONDA: Na titulação da hemolisina que você fez, qual diluição de hemolisina contém duas unidades? 
...................................................................................................................................................................... 
 
Veja o cálculo: - exemplo com hemólise até o tubo n° 8 : 
 
1 unidade hemolisina diluída 1000 vezes 
2 unidades hemolisina diluída 500 vezes 
 
Portanto, quando você for fazer uma reação que use o "Sistema Hemolítico" ou "Sistema 
Indicador" (como a reação de Waaler-Rose e a Reação de Fixação do Complemento) você deve 
diluir a hemolisina a 1/500, ou seja, 500 vezes. 
 
4) PREPARO DO SISTEMA HEMOLÍTICO OU INDICADOR: 
 
a) Em primeiro lugar observe a reação que você vai fazer: qual o volume de sistema hemolítico ou 
indicador você vai usar?________________________________________________________________ 
b) Definido o volume, pegue um tubo de ensaio de volume apropriado e misture, aplicando a regra: 
 
 
 
 
 
 
Tubo sem hemólise 
-Hemácias íntegras 
-Conteúdo opaco 
Tubo com hemólise 
-Hemácias não íntegras –
 -Conteúdo transparente. 
 
uma parte de suspensão de 
hemácias de carneiro a 2% 
 
uma parte de hemolisina diluída 
de modo a conter 2 unidades 
Agitar e 
incubar 
a 37°C 
por 30 
minutos 
 
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5 
 
5) TITULAÇÃO DO COMPLEMENTO 
 
a) Materiais e reagentes: 
- soro fresco de cobaia (fonte de complemento) diluído a 1/50 
- solução fisiológica gelada 
- bateria com 10 tubos de ensaio em banho de gelo 
- banho Maria a 37° C 
- sistema hemolítico preparado como no item "4" 
 
"Não se esqueça! O Sistema hemolítico deve ser preparado 30 min antes do uso." 
 
b) Diluir o soro de cobaia a 1/50 em solução fisiológica gelada. 
c) Distribuir conforme o esquema: 
 
Tubo Complemento 1/50 Sol. fisiológica Sistema Hemolítico 
1 0,05 0,45 0,2 
2 0,10 0,40 0,2 
3 0,15 0,35 Incubar 0,2 Incubar 
4 0,20 0,30 60min 
minutos 
0,2 30min 
5 0,25 0,25 a 37°C 0,2 a 37°C 
6 0,30 0,20 0,2 
7 0,35 0,15 0,2 
8 0,40 0,10 0,2 
9 0,45 0,05 0,2 
10 0,50 - 0,2 
 
c) Leitura: o primeiro tubo com hemólise completa contém 1 unidade de complemento 
d) Na reação de Fixação do Complemento são usadas 2 unidades de C’: 
Veja o cálculo: 
Cálculo de 2 unidades: 
 
 
 
- Como o volume de complemento diluído usado na reação de Fixação do Complemento é de 0,2 
ml, deve ser feito o cálculo para este volume: 
0,3 ml de complemento diluído → 50 vezes 
 0,20 ml de complemento diluído → x vezes 
 
X= 33,3 
 
Portanto, o complemento puro (soro de cobaia) deve ser diluído 1/33 
 
6) PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA E FIXAÇÃO DO ANTÍGENO 
Para imunofluorescência são usadas lâminas extra-finas e quadriculadas. Antes da fixação do antígeno, 
as lâminas devem ser mergulhadas em álcool e enxugadas uma a uma. 
1 unidade no tubo 3 .......................contém 0,15 ml de C’ 1/50 
2 unidades .....................................contém 0,3 ml de C’ 1/50 
 
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6 
Uma vez colocado o antígeno (volume e concentração pré-determinadas), a lâmina deve ser mantida 
a temperatura ambiente ou a 37°C para fixação do an tígeno. 
Após a fixação, as lâminas são acondicionadas em papel impermeável, posteriormente em papel 
alumínio e armazenadas em freezer (pacotes com cerca de 5 lâminas). 
 
7) TITULAÇÃO DO CONJUGADO PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA 
A quantidade de conjugado empregada na reação de imunofluorescência indireta deve ser exata, 
dando um máximo de fluorescência, sem apresentar colorações inespecíficas. Para se determinar a 
quantidade, ou seja, a diluição ideal do conjugado, deve-se fazer a sua titulação. 
Normalmente, os conjugados comerciais trazem pré-determinado seu título. É necessário adaptá-lo às 
condições de trabalho do laboratório, re-titulando com cada antígeno e soros controles próprios. 
Antes de ser titulado, o conjugado deve ser diluído com glicerina pa, distribuído em alíquotas que 
devem ser conservadas em freezer (-20°C). 
Para a titulação, fazem-se diluições do soro controle positivo e do soro controle negativo, e diluições 
do conjugado em estudo, próximas ao título pré-determinado pelo fabricante. Executa-se a reação para cada 
antígeno específico. 
 
8) TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA 
Titulação de Conjugado 
1- Materiais e reagentes: 
 - lâminas quadriculadas contendo o antígeno fixado, mantidas a - 20°C; 
 - conjugado anti-gamaglobulina humana; 
 - Azul de Evans, PBS pH 7,2; 
- soros controle negativo e positivo de título conhecido; 
- glicerina alcalina, lamínula, câmara úmida e pipetas. 
 
2- Técnica: 
a- Preparar diluição do soro controle negativo em PBS (esta diluição é sempre igual a primeira diluição do 
soro positivo); 
b- Diluir o soro controle positivo conforme o esquema: 
 
Tubos 1 2 3 4 
PBS (ml) ..... ..... ..... ..... 
Soro (ml) ..... - - - 
Transferir (ml) - ..... ..... ..... 
Diluição 1/..... 1/..... 1/..... 1/..... 
 
c- Transferir cada diluição para um dos quadradinhos da lâmina; 
d- Incubar em câmara úmida a 37°C por 30 minutos; 
e- Lavar 3 vezes em PBS, sendo de 5 minutos cada lavagem; 
f- Enxaguar a lâmina com água destilada; 
g- Secar cuidadosamente a lâmina; 
 
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7 
h- Diluir o conjugado conforme o esquema: 
 
 
Tubos Conjugado 
Volume 
Conjugado 
Dil. Inicial 
Azul de Evans 
Volume 
Diluição Final 
1 .............µl 1/............ .............µl 1/............ 
2 .............µl 1/............ .............µl 1/............ 
3 .............µl 1/............ .............µl 1/............ 
4 .............µl 1/............ .............µl 1/............ 
 
i- Adicionar o conjugado diluído para cada quadradinho da lâmina conforme o esquema abaixo; 
j- Repetir os ítens d, e, f e g; 
k- Colocar uma gota de glicerina alcalina, cobrir com lamínula. 
 
3- Leitura: 
a- A reação será positiva quando, em pelo menos 20 campos, 50% ou mais dos antígenos apresentarem 
fluorescência. O padrão da fluorescência dependerá do antígeno utilizado. Na reação negativa o 
antígeno apresenta-se vermelho. 
b- Anotar os resultados no esquema a seguir: 
 
 Soros 
Conjugado Positivo Negativo 
 1/...... 1/...... 1/...... 1/...... 1/...... 
1/...... ................ ................ ................ ................ ................ 
1/...... 
................ ................ ................ ................ ................ 
1/...... 
................ ................ ................ ................ ................ 
1/...... 
................ ................ ................ ................ ................ 
 
c- Título: 
O título do conjugado será dado pela maior diluição do conjugado na qual o soro positivo apresenta 
seu título correto e o soro negativo apresenta-se negativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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8 
PREPARAÇÃO DE REAGENTES 
a) Salina Fisiológica 
 
Solução Estoque (5 vezes concentrada) 
NaCl ...................................42,50 g 
água destilada q.s.p........... 1000 ml 
 Solução Uso (0,85%) 
Solução Estoque .............. 200 ml 
água destilada q.s.p. ...... 1000 ml 
 
b) Tampão Fosfato pH 7,2 (PBS - Phosphate Buffered Saline) 
 
Solução Estoque (4 vezes concentrada) 
Na2HPO4. 12H2O ..........................11,10 g 
NaH2PO4.H2O ..................................1,56 g 
NaCl ...............................................32,68 g 
água destilada q.s.p. ............................1000 ml 
 
Solução Uso 
Solução Estoque ..............................250 ml 
Água destilada q.s.p. .......................1000 ml 
Ajustar o pH para 7,2. 
 
c) Azul de Evans 
 
Solução Estoque 
Azul de Evans ......................................10 mg 
Tampão Fosfato pH 7,2 q.s.p. .............100 ml 
Conservar em geladeira. 
 Solução Uso 
Solução Estoque........................................ 10 ml 
Tampão Fosfato pH 7,2 q.s.p. ........1000 ml 
Conservar em geladeira. 
 
Azul de Evans com Tween 80 
Tween 80............................................2 ml 
Azul de Evans Uso q.s.p. ...............100 ml 
conservar em geladeira. 
 
d) Glicerina Alcalina 
 
Glicerina....................................................90 ml 
Tampão Carbonato-bicarbonato.................10 ml 
 
Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 8,7 
Solução "A": 
Na2CO3 0,5M 
Na2CO3 ............................5,3 g 
água destilada q.s.p. ... 100 ml 
Solução "B": 
NaHCO3 0,5M 
NaHCO3 ......................... 4,2 g 
água destilada q.s.p. 100 ml 
Solução Uso 
Solução "A" ......... 0,4 ml 
Solução "B" .......... 10 ml 
Acertar pH para 8,7. 
 
e) Solução Alsever 
 
Dextrose ................................. 2,05 g 
Citrato de Sódio .......................0,84 g 
Cloreto de Sódio ..................... 0,42 g 
 Àgua destilada q.s.p. ............... 100 ml 
Ajustar o pH para 6,1 com solução de ácido cítrico a 5%. 
Esterilizar em autoclave 110°C durante 15 minutos no 
frasco para colheita de sangue de carneiro. 
 
 
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9 
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA GRAVIDEZ 
 
O diagnóstico imunológico da gravidez fundamenta-se no achado do hormônio gonadotrofina 
coriônica (hCG) na urina e sangue da mulher. O hCG é um hormônio pré-hipofisário e ovariano, 
quimicamente definido como uma sialoglicoproteína produzida por células de Langhans da vilosidade 
coriônica da placenta e secretada para sangue e urina. Tem peso molecular de aproximadamente 46 kDa, 
cujos níveis se elevam durante a gravidez. É secretada inicialmente pelas células trofoblásticas de 
blastócitos em desenvolvimento logo após a fixação do óvulo fertilizado à parede uterina, e mais tarde pelas 
células sincitiotrofoblásticas da placenta. O hCG humano é constituído por 2 subunidades não idênticas, as 
quais são designadas α e β. Estas duas subunidades diferem tanto estrutural como imunologicamente. 
Devido à similaridade estrutural da subunidade α com outros hormônios (LH, FSH e TSH), muitas vezes os 
testes podem apresentar reações cruzadas, falseando os resultados. Em contraste, a subunidade beta 
determina a especificidade biológica e imunoquímica. 
O hCG desempenha um importante papel na manutenção do corpo lúteo, o qual suporta a gravidez 
pela produção de progesterona e estradiol. Parece também estimular a formação de células de Leidig e 
produção de testosterona no feto masculino. 
Imunizando-se coelhos com hCG altamente purificado ou pela produção de anticorpos monoclonais, 
obtém-se anti-soros específicos, utilizados em testes imunológicos para o diagnóstico da gravidez. 
Os valores de hCG na urina e no soro de homens e de mulheres sã, não grávida são inferiores a 5 
mUI/ml. Os níveis de β-hCG entre 5 e 25 mUI/mL podem ser indicativos de uma gravidez inicial. Títulos mais 
elevados aparecem no sangue e na urina, ao redor da sétima semana de gestação, persistindo até a décima 
segunda semana, e depois decaindo até a negativação, no final da gravidez. Podem aumentar até mais de 
100.000 mUI/mL no primeiro trimestre. 
Durante o primeiro trimestre de gravidez, a análise semiquantitativa e quantitativa de hCG ajuda no 
prognóstico de aborto. Quando se alcançam os níveis mais elevados de hCG, ao redor de 50 a 90 dias após 
o último período menstrual, um achado inferior a 3.000 mUI/mL na urina de 24 horas associa-se com um 
aborto inevitável. Se for empregada a primeira urina da manhã, ao invés da urina de 24 horas, níveis de hCG 
menores que 5.000 mUI/mL sugerem que a gestação é inviável. Um aborto inevitável pode apresentar, a 
princípio, valores normais de hCG, que depois diminuem com o curso dos dias. Portanto, para ter valor 
prognóstico, a análise semiquantitativa deve ser realizada em dias sucessivos. 
A determinação semiquantitativa ou quantitativa de hCG também é útil no diagnóstico de carcinomas 
uterinos como a MOLA HIDATIFORME. Embora alguns pacientes com MOLA HIDATIFORME apresentem 
valores muito elevados de hCG urinário (superiores a 6.000 mUI/mL), a maioria tem taxas semelhantes as 
da gravidez normal e alguns tem mesmo taxas relativamente baixas (5 mUI/mL). Para o diagnóstico 
diferencial dos processos com valores elevados de hCG, ajuda o fato de que durante a gravidez normal, a 
seqüência analítica tende a uma curva uniforme, enquanto que nas enfermidades trofoblásticas, a repetição 
de análises durante várias semanas mostra flutuações irregulares. 
O CORIOCARCINOMA‚ um tumor maligno raro, procedente do tecido trofoblástico, se desenvolve em 
mulheres a partir da mola hidatiforme. No homem, o CORIOCARCINOMA‚ é um tumor testicular raro, porémmuito maligno. Em ambos sexos, a maioria dos CORIOCARCINOMAS dão valores elevados de hCG ou 
valores normais de uma gravidez. Entretanto, não se pode detectar hCG em alguns casos. 
 
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10 
Tem sido comunicado casos de TERATOMAS OVARIANOS e TESTICULARES, SEMINOMAS e 
CARCINOMAS EMBRIONÁRIOS com índices elevados de hCG urinário. Estes se devem, talvez, a 
pequenos focos de coriocarcinomas que tenham passado despercebidos durante o estudo histológico. 
Todos os homens com tumores testiculares deveriam submeter-se a uma prova de sensibilidade para hCG, 
como ajuda para o diagnóstico. 
O hCG também pode ser detectado em várias neoplasias, por exemplo, de mama, pulmão, próstata, 
fígado, estômago e intestino. 
Quando um coriocarcinoma é tratado com êxito, ocorre uma diminuição progressiva do hCG urinário. 
Persistência de excreção associa-se com a persistência do tumor, metástase ou recidivas. Valor muito 
elevado sugere prognóstico desfavorável. 
 
Vários métodos são empregados para se determinar a gravidez: 
- Teste de inibição da hemaglutinação; 
- Teste de inibição da aglutinação de partículas de látex revestidas com hCG; 
- Testes imunoenzimáticos (EIA, MEIA); 
- Radioimunoensaio (RIE). 
- Test Pack (ELISA e Cromatográfico) 
- Strip Test (Cromatográfico) 
 
Existem disponíveis comercialmente reagentes de qualidade, mas a sensibilidade varia de acordo com o método. 
Teste Sensibilidade 
Teste de inibição da 
hemaglutinação 200 - 700 mUI/mL de hCG 
Detecta gravidez após 5 dias de 
atraso menstrual; 
Teste de inibição de partículas 
de látex 1500 - 8000 mUI/mL de hCG 
Detecta gravidez 10 a 12 dias 
após o atraso menstrual; 
Teste imunoenzimático 50 mUI/mL de hCG Detecta gravidez uma semana 
após a concepção; 
RIE 25 mUI/mL de hCG Detecta gravidez 5 a 6 dias após 
a concepção; 
Test Pack 50 mUI/mL de hCG Detecta gravidez uma semana 
após a concepção; 
Strip Test 25 a 50 mUI/mL Pode detectar gravidez uma 
semana após a concepção. 
 
 
COLHEITA E PREPARO DA AMOSTRA (URINA) 
Deve ser colhida uma amostra da primeira urina da manhã em recipiente limpo, sem traços de 
detergente. As amostras devem ser testadas logo que possível. Se a amostra permanecer durante longo 
período (8 horas ou mais) à temperatura ambiente, o hCG pode perder sua atividade, levando a resultados 
falsos negativos. As amostras devem ser refrigeradas entre 2-8°C, por um período que não ultrapasse 72 
horas. O hCG é estável durante muitos meses a -20°C , porém, aconselha-se que sejam descartadas todas 
as amostras após o degelo. As amostras liofilizadas são estáveis indefinidamente. Não se pode utilizar 
conservantes para a urina. Amostras altamente contaminadas por bactérias não devem ser submetidas ao 
teste. Ao se executar o teste semi-quantitativo, deve ser usada urina de 24 horas para maior exatidão na 
medida do hormônio excretado. 
 
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Em testes de inibição da aglutinação, níveis elevados de proteína, hemoglobina, glicose, bilirrubinas e 
glicoproteínas como LH, TSH, FSH ou GH na urina podem reduzir a intensidade de aglutinação, produzindo 
resultados falsos positivos. Recomenda-se, assim, testar amostras que não contenham níveis anormais 
destas substâncias. 
Resultados falsos positivos e falsos negativos, observados em testes menos sensíveis e específicos, 
foram relatados em pacientes sob tratamento com drogas como: fenotiazínicos, prometazina, clorpromazina, 
psicotrópicos, beta-bloqueadores, anticoagulantes, acetaminofen, ácido acetilsalicílico, ácido ascórbico, 
atropina, cafeína e ácido gentísico. 
 
 
REAÇÃO DE INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO 
Princípio: 
O hCG é ligado quimicamente às partículas de látex ou às hemácias, sensibilizando-as. Na presença 
de hCG livre na urina, a aglutinação é inibida, pois os anticorpos anti-hCG adicionados são neutralizados, 
sendo a reação POSITIVA. 
Quando a concentração de hCG na urina for inferior a sensibilidade do método, haverá aglutinação, 
sendo a reação NEGATIVA. 
 
1) urina contendo hCG + anti-hCG = antígeno-anticorpo 
 
 
 
 
 
 
 
2) antígeno-anticorpo + hemácia-hCG ou látex-hCG = não aglutinação = POSITIVO 
 
 
 
 
 
OU 
1) urina sem hCG + anti-hCG = anticorpo livre 
 
 
 
 
2) anticorpo livre + hemácias-hCG ou látex-hCG = aglutinação = NEGATIVO 
 
 
 
 
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INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO 
 
Técnica qualitativa: 
1) Centrifugar a urina a 2000 rpm durante 10 minutos. Utilizar o sobrenadante para o teste ou filtrá-la. 
2) Deixar os reativos à temperatura ambiente. 
3) Homogeneizar bem os reativos. 
4) Colocar 20 µL do soro anti-hCG na área delimitada de uma lâmina de fundo escuro. 
5) Acrescentar 20 µL da urina. 
6) Misturar bem utilizando um bastão. 
7) Oscilar a lâmina levemente, com movimentos circulares, durante 30 segundos. 
8) Acrescentar 20 µL do antígeno (partículas de látex sensibilizadas com hCG). 
9) Misturar bem com um bastão, e oscilar a lâmina, em movimentos circulares e delicados para que a 
mistura anti-soro + urina + antígeno se movimentem na lâmina. 
10) Verificar a ocorrência de aglutinação, que deve acontecer em até 2 minutos após a mistura. 
11) Empregar controles positivos e negativos. Não usar solução salina fisiológica como controle negativo, 
pois não reproduz os constituintes da urina. 
 
12) RESULTADO: 
Se houver aglutinação o teste será NEGATIVO, 
se não houver aglutinação o teste será POSITIVO. 
 
 
DETERMINAÇÃO SEMIQUANTITATIVA DO hCG 
 
1) Colher urina de 24 horas, homogeneizar e retirar uma alíquota. 
2) Preparar diluições seriadas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, ...) em solução salina fisiológica. 
3) Executar o teste pelo método qualitativo para cada diluição. 
4) O resultado final é determinado pela maior diluição da urina que apresentar resultado POSITIVO (não 
aglutinação). 
5) Resultado semi-quantitativo é dado pela seguinte fórmula: 
 
UI/l = S x D 
S = Sensibilidade do teste 
D = Recíproca da diluição positiva 
 
Exemplo: 
S = 2.000 UI/L (sensibilidade média do kit) 
D = 16 (urina positiva até 1/16) 
UI/L = 2.000 x 16 
UI/L = 32.000 
 
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Interpretação: 
Valores abaixo da faixa normal indicam possíveis anormalidades na gravidez. Valores de hCG 
inferiores a 10.000 mUI/mL são prognosticamente desfavoráveis entre a oitava e décima sexta semana de 
gravidez. 
 
Objetivos da determinação semi-quantitativa de hCG: 
- acompanhamento da gravidez em casos de aborto freqüente e ameaça de aborto entre a oitava e 
décima semana de gravidez; 
- suspeita de mola hidatiforme e corioepitelioma; 
- gravidez ectópica; 
- menopausa com aumento de excreção de hMG (Human Menopausal Gonadotropin) de origem 
hipofisária. 
 
Semanas após o último período menstrual Variação aproximada de hCG (mUI/mL) 
3 - 4 semanas 9 - 130 
4 - 5 semanas 75 - 2.600 
5 - 6 semanas 850 - 20.800 
6 - 7 semanas 4.000 - 100.200 
 7 - 12 semanas 11.500 - 289.000 
12 - 16 semanas 18.300 - 137.000 
16 - 29 semanas (2° trimestre)1.400 - 53.000 
29 - 41 semanas (3° trimestre) 940 - 60.000 
Referência: Bula do Kit de β-hCG Total (Microparticle Enzyme Immunoassay MEIA) da ABBOTT 
 
TEST PACK – hCG Card 
 
Princípio: Teste rápido, imunocromatográfico para determinação qualitativa de hCG em soro ou urina – 
fração beta. O ensaio imunocromatográfico é baseado no princípio de enzimaimunoensaio por “sanduíche” 
para a detecção de hCG. O teste consiste em uma membrana pré-sensibilizada com um anticorpo 
monoclonal de camundongo anti-hCG na zona de teste, com anticorpo policlonal IgG de cabra anti-
camundongo na zona de controle e também com um anticorpo monoclonal anti-hCG conjugado com ouro 
coloidal. A amostra é adicionada e se move ao longo da membrana, por capilaridade, junto ao conjugado 
com ouro coloidal até atingir o anticorpo monoclonal na zona de teste. O antígeno, se presente na amostra, 
liga-se ao anticorpo monoclonal da zona de teste e ao anticorpo conjugado com ouro coloidal formando um 
“sanduíche”. Neste ponto há a formação de uma linha de coloração avermelhada, indicando um teste 
positivo. 
Sensibilidade: 20 – 25 mUI/mL 
Procedimento: 
- Deixar as amostras e o kit estabilizarem à temperatura ambiente; 
 
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- Abrir a embalagem e retirar o card e a pipeta descartável; 
- Dispensar 4 gotas (200 µL) de soro ou urina na cavidade para amostras com a pipeta descartável na 
posição vertical; 
- Aguardar o aparecimento de linhas coloridas. Dependendo da concentração de hCG na amostra, poderão 
ser observados resultados positivos dentro de 40 segundos; 
- Ler o resultado em 10 minutos. Desconsiderar resultados lidos após este tempo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cavidade de 
Local de 
visualização do 
resultado 
Local para 
identificação 
do paciente 
C D C D C D 
POSITIVO NEGATIVO INVÁLIDO 
 
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STRIP TEST - hCG 
 
 
Princípio: teste da fita (Tira) – Cromatográfico 
Sensibilidade: concentrações 25 - 50 mUI/mL na urina. 
Procedimento: 
-Pegar uma fita e colocá-la num tubo contendo a urina; 
-Deixar a fita na urina durante 5 minutos; 
-Tirar a fita da urina e proceder a leitura. 
 
 
 
Resultados: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO ββββ-hCG – TOTAL 
 
Método: Enzima Imunoensaio de Micropartículas (MEIA; Abbott – Axsyn β-hCG Total) 
Material: Soro ou plasma humano. 
Procedimento técnico: Vide instruções do fabricante. 
Sensibilidade: Este teste foi calculado para ser ≥ 2,0 mUI/mL 
Princípio: É fundamentado na tecnologia do imunoensaio enzimático de Micropartículas (MEIA). O soro 
contendo ou não β-hCG e o conjugado anti-β-hCG : fosfatase alcalina e anti-β-hCG ligado às micro-
partículas são incubados nas células de reação. O β-hCG liga em ambos anticorpo marcado com enzima e a 
anticorpo ligado à micro-partícula formando um complexo Ac-Ag-Ac. O substrato, 4-methylumbelliferyl 
phosphate, é adicionado na matrix e o produto fluorescente é medido pelo sistema óptico do aparelho. 
Amostra de urina 
Nível máximo de urina 
Zona de reação 
POSITIVO NEGATIVO 
Linha do resultado 
Linha de controle 
 
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IMUNOHEMATOLOGIA 
 
A composição antigênica dos tecidos no homem é muito complexa e variada. A variabilidade 
encontrada é definida por herança genética. As técnicas empregadas na demonstração desta variabilidade 
permitem caracterizar praticamente a individualidade biológica do homem, embora não seja possível a 
demonstração de todos os sistemas. A complexidade antigênica das hemácias humanas é menor que a dos 
tecidos, o que facilita na prática a transfusão sangüínea sem a necessidade do uso de terapia 
imunossupressora. 
O sistema “ABO”, o mais importante, possui padrão de herança do tipo Mendeliana com 
codominância. Sua expressão é representada por 2 genes (paterno e materno) compartilhados com três 
alelos possíveis de combinações. Os alelos “A” e “B” são codominantes. Isto significa que o indivíduo de 
fenótipo “A” pode possuir um genótipo “AA” ou “AO” e o indivíduo “B” pode possuir um genótipo “BB” ou 
“BO”. O alelo “O” é recessivo, isto é, “OO”. A demonstração do fenótipo “ABO” é baseada em testes 
sorológicos, mais especificamente através de uma reação de aglutinação direta entre um antígeno e um 
anticorpo específico. A verdadeira função destes antígenos nas membranas das células é ainda 
desconhecida. 
Os anticorpos pertencentes ao sistema “ABO” (naturais ou imunes), têm a temperatura ótima de ação, 
para aglutinação, a 20°C. 
 
 
DETERMINAÇÃO DA COMPATIBILIDADE SANGUÍNEA 
Tem o objetivo de selecionar doadores para a transfusão de sangue. Pode-se efetuá-la pelas provas 
diretas: determinação dos grupos a que pertencem o doador e o receptor e pelas provas indiretas ou 
cruzadas, que permitem confirmar a primeira. 
 
1) DETERMINAÇÃO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS DO SISTEMA “ABO” 
O procedimento pode ser realizado em lâminas ou em tubos. 
 
a) Técnica para o teste em lâmina 
-Preparar uma suspensão de hemácias a 3 a 5% (50µµµµl de sangue total + 1 ml de solução fisiológica) 
ou em seu próprio soro ou plasma ou empregar o próprio sangue total. 
- Colocar em uma lâmina de microscopia bem limpa, uma gota de soro anti-A, uma gota de soro anti-B 
e uma gota do anti-AB. 
- A cada gota acrescentar uma gota de suspensão de hemácias ou sangue total do paciente. 
- Misturar bem, individualmente, o sangue e o soro de cada tipo com espátulas plásticas. 
- Assegurar-se de ter obtido uma mistura perfeita entre soro e sangue, fazendo oscilar a lâmina com 
movimentos circulares. 
- Os testes que não mostrarem aglutinação devem ser mantidos sob observação por mais dois minutos. 
Não interpretar secagem periférica como aglutinação. 
 
 
 
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b) Técnica para o teste em tubo de ensaio 
- Preparar a suspensão de hemácias de 3 a 5% (50µµµµl de sangue total + 1 ml de solução fisiológica). 
Colocar 50µl da suspensão em três tubos. Ao tubo 1 acrescentar uma gota de soro anti-A. Ao tubo 2 
acrescentar uma gota de soro anti-B e ao tubo 3, uma gota de anti-AB. 
- Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 minuto. 
- Observar a presença ou não de aglutinação. 
- O tubo que apresentar aglutinação com o anti-soro A, ou com anti-soro B indica que o indivíduo possui 
antígeno A ou B na superfície de suas hemácias. Se apresentar aglutinação com os anti-soros A e B, 
o indivíduo possui os antígenos A e B em suas hemácias. Nestas três situações deve ocorrer 
aglutinação com o anti-AB. Se não apresentar aglutinação com estes anti-soros, o indivíduo não 
possui os antígenos A e B em suas hemácias. 
 
 
2) DETERMINAÇÃO DOS ANTÍGENOS Rh (D e D fraco) 
 
- O método em tubo é melhor do que o método em lâmina. 
- Os anticorpos imunes do sistema Rh (salinos ou albuminosos ou incompletos) aglutinam em temperatura 
ótima de 37°C.2.1) Técnica para o antígeno Rh: 
 
a) Técnica para o teste em lâmina: 
- Preparar uma suspensão de hemácias 3-5% em salina fisiológica ou empregar o sangue total. 
- Em lâmina pré-aquecida (40 - 50°C) colocar uma go ta de soro anti-Rh (Anti-D). 
- Acrescentar uma gota de suspensão de hemácias. 
- Misturar bem. Agitar a lâmina com movimentos de rotação. 
- Os testes que não apresentarem aglutinação deverão ser observados por mais 2 min. Não interpretar 
secagem periférica como aglutinação. 
- Se o teste for negativo (não aglutinação), fazer o teste para detecção da Variante Du (Du fraco) 
 
b) Técnica para o teste em tubo de ensaio: 
- Preparar uma suspensão de hemácias 3 a 5% em salina. 
- Colocar 50 µl desta suspensão em dois tubos. 
- Colocar uma gota de soro anti-Rh no tubo 1 e uma gota de controle do Rh no tubo 2. 
- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. 
- Examinar os tubos, fazendo a suspensão oscilar levemente e anotar se ocorreu aglutinação. 
- Se aglutinar o paciente é Rh positivo. 
- Se não aglutinar, incubar a 37°C por 15 min., centrifugar e reexami nar. 
- Se não ocorrer aglutinação, a reação deve prosseguir para a pesquisa de possível presença de D fraco. 
 
 
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2.2) Técnica para o antígeno D fraco: 
- Preparar três tubos com 50 µl da suspensão de hemácias. Acrescentar no tubo 1, uma gota de soro 
anti-Rh, ao tubo 2 uma gota de soro anti-Rh e uma gota de albumina e ao tubo 3 uma gota de 
controle de Rh. 
- Acrescentar uma gota de soro de Coombs em cada tubo, agitar levemente os tubos. 
- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. 
- Realizar a leitura. 
 
Interpretação: 
- Não aglutinação nos dois primeiros tubos: Rh negativo. 
- Aglutinação nos tubos 1 e 2: D fraco (Rh positivo). 
- Aglutinação nos três tubos: a interpretação deve ser feita como na prova de Coombs Direto positivo, o 
qual indica estarem as hemácias em exame previamente sensibilizadas. Essas hemácias não podem ser 
testadas com segurança quanto a presença do antígeno Du. 
 
- Algumas vezes, um indivíduo classificado pela tipagem sangüínea como Rh negativo, possui em 
menor proporção antígenos D na superfície de suas hemácias. Em transfusões sangüíneas estes indivíduos 
reagem como aqueles Rh positivos (eles tem o antígeno D na superfície de suas hemácias), são “D fraco”. 
Isto é, indivíduos “D fraco” positivos podem ser erroneamente classificados como Rh negativos devido às 
dificuldades das ligações dos anticorpos anti-D com o antígeno D. 
 
 
3) DETERMINAÇÃO DAS AGLUTININAS SÉRICAS: PROVA DA TIPAGEM REVERSA 
Seu emprego, simultâneo com a pesquisa de aglutinogênios globulares, proporciona maior segurança 
na determinação dos grupos sangüíneos. 
As aglutininas séricas são pesquisadas com glóbulos conhecidos do grupo A e do grupo B. 
 
TÉCNICA: 
- Obter o sangue do paciente por punção venosa sem anticoagulante, centrifugar para obter o soro e 
inativá-lo a 56°C por 30 min. 
- Obter suspensões de glóbulos dos grupos A e B com anticoagulante. Separar o plasma e com o sangue 
preparar suspensões a 3 a 5% em solução fisiológica. 
 
Reação em lâmina: 
- Misturar 50 µl das suspensões A e B com 50 µl do soro. 
- Homogeneizar com bastonete plástico e observar a aglutinação. 
 
Reação em tubo: 
Misturar 50µl das suspensões A e B (3 a 5%) com 50µl do soro em dois tubos de ensaio para cada 
suspensão. Agitar levemente os tubos e observar a aglutinação. Para melhor visualização, centrifugar a 
1.000 rpm por 1 min. 
 
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Se não ocorrer aglutinação dos glóbulos dos dois grupos, o soro desconhecido não contém as 
aglutininas anti-A e anti-B, pertencendo ao grupo AB. Se forem aglutinados os glóbulos do grupo B, o soro 
desconhecido contém a aglutinina anti-B, pertencendo ao grupo A. Se há aglutinação apenas dos glóbulos 
do grupo A, o soro desconhecido só contém a aglutinina anti-A, pertencendo ao grupo B. Se forem 
aglutinados os glóbulos de ambos os grupos, o soro desconhecido possui ambas as aglutininas, 
pertencendo ao grupo O. 
Os anticorpos anti-A e anti-B identificados são chamados de completos ou naturais (IgM) e requerem 
apenas as células e salina para a reação. Estes anticorpos são também da variedade incompleta ou imune 
(IgG) e requerem albumina ou soro antiglobulina ou ainda enzimas proteolíticas para desenvolver reação. 
 
 
4) PROVAS DE COOMBS 
Existem duas modalidades de prova de Coombs: a direta e a indireta. A prova direta se destina a 
demonstrar anticorpos fixados nas hemácias quando há suspeita de Doença Hemolítica do Recém-Nascido 
(DHRN) ou de qualquer outra forma de anemia de base imunológica (AHAI). 
A prova indireta é usada para demonstrar a existência de anticorpos bloqueadores no soro de uma 
gestante Rh negativa, suspeita de estar sensibilizada pelos antígenos do sistema Rh. 
 
4.1) Reação de Coombs Direto: 
- Colher sangue do paciente, em um tubo simples, com anticoagulante (EDTA) e deixar à temperatura 
ambiente. 
- Preparar uma suspensão de 3 a 5% com o sangue (50 µl de sangue total + 1 ml de salina fisiológica). 
- Colocar 50µl desta suspensão de hemácias em um tubo. 
- Lavar três vezes com salina. 
- Após a última centrifugação decantar completamente o sobrenadante. 
- Acrescentar uma gota de soro de Coombs ao sedimento e homogeneizar. 
- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. 
- Observar presença ou ausência de aglutinação. 
- Se aglutinar, significa que as hemácias estão sensibilizadas. 
 
4.2) Reação de Coombs Indireto: 
- Em dois tubos de ensaio colocar 50µl de soro do paciente. 
- Acrescentar nestes dois tubos 50µl de uma suspensão de hemácias 3 a 5%, tipo "O", Rh positivo. 
- No tubo n° 2 adicionar 1 gota de solução de album ina bovina a 22%. 
- Deixar os tubos incubando a 37°C por 15 minutos. 
- Lavar os tubos três vezes com salina, desprezando completamente o sobrenadante após a última 
centrifugação. 
- Acrescentar uma gota de soro de Coombs sobre o sedimento. 
- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. 
- Observar presença ou ausência de aglutinação. 
 
 
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Interpretação: 
- Aglutinação: indica presença de anticorpos anti-D no soro da paciente. 
 
Observação: Pode-se também determinar o título de anticorpo, fazendo-se diluições do soro (1/2, 1/4, 
1/8.....). 
 
5) DETERMINAÇÃO DA PROVA CRUZADA 
A transfusão de sangue será possível sempre que as hemácias do doador não forem aglutinadas pelo 
soro do receptor. Mesmo que ocorra uma compatibilidade teórica quanto aos sistemas ABO e Rh, entre os 
sangues do doador e do receptor, podem ocorrer reações resultantes de incompatibilidades ocasionais 
relacionadas a outros sistemas (Kell, Duffy, Lewis, M, I, Kidd, etc.), aglutininas atípicas (crioaglutininas), sub-
grupos, e por esta razão, é conveniente a realização da prova de compatibilidade pré-transfusional pela 
prova cruzada. Dois tipos de provas cruzadas: a prova cruzada maior e a prova cruzada menor. A prova 
cruzada maior é fundamental para a transfusão. Ela consiste em reagir hemácias do doador com o soro do 
receptor (na presença ou ausência do soro de Coombs). De menor importância, tem-se a prova cruzada 
menor que consiste na mistura das hemácias do receptor com o soro do doador (com ou sem soro de 
Coombs). 
A prova cruzada maior é realizadapara demonstrar anticorpos capazes de danificar ou destruir os 
glóbulos vermelhos do doador. É de maior importância, porque a introdução de sangue incompatível na 
circulação do receptor é a causa mais comum das reações hemolíticas. Na prova cruzada menor pesquisa-
se anticorpos no soro do doador capazes de agredir as células do receptor. Já que os anticorpos do doador 
serão muito diluídos "in vivo" pelo plasma do receptor, eles são considerados de menor importância. 
 
5.1) Prova Cruzada Maior 
Técnica: 
- Tubo n° 1: 100µl de soro recente do receptor (inativado) 
 100µl de suspensão de 3 a 5% de hemácias do doador (50µl de sangue + 1ml solução 
fisiológica) 
- Tubo n° 2: 100µl de suspensão de 3 a 5% de hemácias do doador 
 2 gotas de albumina bovina 
 100µl de soro recente do receptor 
- Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 minuto. 
 
Observar: 
-Se não apresentar aglutinação ou hemólise: 
- Incubar os tubos a 37°C por 15 min. 
- Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 min. 
- Observar aglutinação ou hemólise. 
- Se não apresentar aglutinação ou hemólise: 
- Lavar três vezes com solução fisiológica o tubo n° 2, a 1500 rpm por cinco minutos. 
- Acrescentar ao sedimento uma gota de soro de Coombs. 
- Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 min. 
 
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Se não houver nenhuma aglutinação a amostra é considerada compatível. 
 
 
A permuta do soro do receptor pelo do doador e das hemácias do doador pela do receptor é 
considerado como prova cruzada menor. 
 
Causas de erros: 
- Presença de crioaglutininas* 
- Agregação espontânea por contaminação bacteriana, anemia hemolítica adquirida, e outros. 
- Formação de Rouleaux (em casos de mieloma múltiplo). 
- Centrifugação demorada e acelerada pode dar falso positivo. 
 
*Crioaglutininas são anticorpos aglutinantes (IgM) que reagem ao frio. Estes ocorrem em várias condições 
patológicas como: pneumonia primária atípica (micoplasma), síndrome de Raynauld, anemia hemolítica 
auto-imune, hemoglobinúria paroxística ao frio, neoplasias, malária, etc. 
 
 
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ESQUEMA PRÁTICO 
 
TIPAGEM ABO Rh E COOMBS 
 Coombs 
 
ABO Reversa ABO Direto Rh 
Indireto Direto 
Tubo A B A B AB Rh C Alb C Rh 1 2 1 
Sangue 3 - 5% 50µl 
 “A” 
50µl 
“B” 
50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 
 “O+” 
50µl 
 “O+” 
50µl 
Soro/anti-
soro 
50µl 50µl 1 gt 
 “A” 
1 gt 
 ”B” 
1 gt 
 ”AB” 
1 gt 
”Rh” 
1 gt 
”Rh” 
1 gt 
C ”Rh” 
50µl 50µl ---- 
Albumina 
bovina 
---- ---- ---- ---- ---- ---- 1 gt ---- ---- 1 gt ---- 
Centrifugar 1 minuto a 1.000 rpm – Proceder a leitura ---- ---- 
 37°C 15 min ---- 
 Lavar 3 x 5 min (1500 rpm) 
com 2 ml de solução fisiológica 
Soro de 
Coombs 
 1 gt 
 
1 gt 
 
1 gt 
 
1 gt 
 
1 gt 
 
1 gt 
 
 Centrifugar 1 min 1000 rpm - Leitura 
 
 
PROVA CRUZADA MAIOR 
Tubo 1 2 
Soro do receptor 100µl 100µl 
Sangue 3 - 5% do doador 100µl 100µl 
Albumina bovina 22% ---- 2 gt 
 Centrifugar 1 min em 1.000 rpm 
 Proceder a leitura 
 Incubar a 37°C durante 15 min 
 Centrifugar 1 min em 1.000 rpm 
 Proceder a leitura 
Lavar 3 vezes de 5 min em 1.500 rpm c/ 2 ml de salina fisiológica 
Soro de Coombs 1 gota 
Centrifugar 1 min em 1.000 rpm 
Proceder a leitura 
 
 
 
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23 
 
PROVAS REUMÁTICAS 
A ARTRITE REUMATÓIDE (AR) 
 
 
TÉCNICAS DE PESQUISA DO FATOR REUMATÓIDE 
 
O QUE É FATOR REUMATÓIDE 
É um auto-anticorpo dirigido contra aminoácidos de regiões constantes das moléculas de IgG. A 
causa pode estar relacionada a uma deficiência adquirida da enzima galactosil-transferase em linfócitos B, 
levando à redução na glicosilação na região Fc da cadeia de IgG; estas moléculas de IgG então se tornariam 
imunogênicas, e seriam formados anticorpos anti-IgG. 
Os Fatores Reumatóides (FR) podem ser anticorpos das classes IgG, IgA e IgM. 
Predominantemente são formados FR da classe IgM. 
O FR é um fator prognóstico para um curso erosivo severo da doença, mas não correlaciona com a 
atividade da doença. Pode aparecer precocemente, até vários anos antes do início da AR (~10 anos). Os 
FRs podem ser pesquisados por diferentes técnicas: látex, nefelometria, eritrócitos de carneiro recobertos 
com IgG, etc. 
 
1. LÁTEX - FR 
É uma reação de aglutinação indireta tendo como suporte, partículas de látex (∅= 810 nm) e como 
antígeno reagente gamaglobulina humana agregada pelo calor e adsorvida às partículas. 
É uma técnica de alta sensibilidade, porém de pouca especificidade para os casos de Artrite 
Reumatóide - AR (82%). Podem ocorrer positivos falsos em 10 a 40% dos casos de macroglobulinemia de 
Waldenström, calazar, sarcoidose, sífilis, doenças hepáticas, hepatites, malária, tripanossomíases, doenças 
infecciosas crônicas (lepra, tuberculose), endocardite bacteriana subaguda e fumantes. Também 
observados em doenças do tecido conectivo, principalmente no lúpus eritematoso sistêmico (LES; 20 a 30% 
dos pacientes com esta doença). É negativo em casos de febre reumática. 
Também pode ser positivo em acima de 15% da população normal; há uma positividade progressiva 
com o aumento da idade, sendo positivo em 25 a 30% das pessoas com mais de 70 anos. 
Títulos significativos são ≥80. 
Na artrite reumatóide pode se encontrar títulos como 640 a 5120 e algumas vezes >320.000. Em 
outras condições que não a artrite reumatóide os títulos usualmente são menores que 80. 
Podem ocorrer resultados negativos em 1/3 dos pacientes com artrite reumatóide. Estes casos 
geralmente tornam-se positivos de 3 a 6 meses após a doença se manifestar. 
O teste em lâmina somente deve ser usado como triagem. Para confirmar um resultado positivo, 
deve ser usada a reação de Waaler-Rose. 
 
TÉCNICA: (Teste de Triagem - qualitativo) 
a. Deixar o Látex reagente e os soros adquirirem a temperatura ambiente; 
 
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b. Diluir cada soro teste a 1:20 em tampão salina-glicina pH 8,2 (20 µl de soro + 0,38 ml de tampão) e 
distribuir 20µl de cada soro diluído em uma área distinta de uma placa de fundo escuro; 
c. Distribuir também 20µµµµl de soro positivo e 20µµµµl de soro negativo. Os soros já vêm previamente diluídos. 
d. Adicionar a cada um deles 20 µµµµl do látex reagente e misturar com espátulas descartáveis, uma para cada 
amostra; 
e. Agitando em movimentos circulares, observar a aglutinação num prazo de até 2 minutos, comparando o 
resultado do soro teste com os soros positivo e negativo. 
Se, positivo (aglutinação) sua concentração (FR) deverá ser titulada por meio de técnica semiquantitativa. 
 
f. Técnica semi-quantitativa 
Reação positiva: prosseguir as diluições, a partir de 1/20, na razão 2, em tampão glicina pH 8,2; 
- Testar cada diluição segundo a técnica descrita acima (no teste de triagem); 
- O título do soro em fator reumatóide, expresso em UI/ml é: 
 
Última diluição positiva x sensibilidade do Kit 
 
Exemplo: Sensibilidade expressa na caixa: 1,25UI/ml e soro positivo até 1/80 
 
Título do soro em UI/ml = 1,25 x 80 ���� 100 UI/ml 
 
 
2. NEFELOMETRIA - FR 
 
Princípio: 
 Partículas de poliestireno (látex) recobertas com um imunocomplexo de γ-globulina humana e anti-γ-
globulina humana de carneiro aglutinam-se quando misturadas com uma amostra que contenha fator 
reumatóide. A intensidade de luz dispersa no nefelômetro depende da concentração de FR na amostra, de 
forma que este pode ser medido por comparação com diluições de um padrão de concentração conhecida. 
 O método nefelométrico permite uma quantificação dos níveis de FR no soro de pacientes suspeitos 
de doença reumática. A presença ou a exclusão de FR tem grande significado diagnóstico, porque permite 
confirmar ou pôr em dúvida um diagnóstico-suspeito, baseado em dados de anamnese ou dados clínicos. 
Uma AR soro-positiva tem um prognóstico geralmente menos favorável do que as soro-negativas. Títulos 
aumentados de FR indicam freqüentemente uma evolução grave ou um quadro clínico generalizado. Um 
resultado de laboratório de “AR soro-negativo” deve entender-se no sentido de que nem o método de 
aglutinação ao látex ou teste de Waaler-Rose acusaram a presença de FRs. Os resultados de uma 
determinação quantitativa de FRs devem ser sempre interpretados em conjunto com os dados clínicos e 
outros resultados biológicos, pois um nível baixo de FR não exclui uma AR, assim como, concentração 
elevada de FR não é exclusiva das doenças reumáticas; outras análises podem ser necessárias para 
confirmar a presença de uma doença. 
 
 
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Metodologia: 
 Seguir as instruções do fabricante. 
 
Limitações e fontes de erro: 
 Turbidez e presença de partículas podem interferir no teste devido à coagulação incompleta ou 
desnaturação de proteínas. É necessário eliminar por centrifugação estas partículas, antes da execução dos 
testes. Amostras lipêmicas devem ser centrifugadas e não sendo clarificadas, devem ser rejeitadas. 
 
Valores de Referência: 
 Análise de soros de doadores europeus determinou o valor de 15UI/ml como normal. Valores mais 
baixos não devem ser avaliados como positivos para FR. 
 
 
3. REAÇÃO DE WAALER-ROSE 
É uma reação de hemaglutinação indireta tendo como suporte hemácias de carneiro e como 
antígeno reagente a hemolisina (anticorpo de coelho anti-hemácias de carneiro). Em relação ao Látex-FR, é 
mais específica, porém de menor sensibilidade (63% positividade). Falso-positivos poderão ocorrer em 
algumas doenças infecciosas crônicas (lepra, tuberculose), endocardite bacteriana subaguda. A reação de 
Waaler Rose pode ser realizada utilizando-se kits comerciais, como também no laboratório de rotina tendo-
se em mãos apenas a hemolisina (Ac de coelho anti-hemácias de carneiro) e o complemento de cobaia, 
como segue: 
 
 
TÉCNICA DE WAALER ROSE 
 
FASE 1: 
Remoção de anticorpos heterófilos (absorção do soro): 
- Anticorpos heterófilos são anticorpos da classe IgM existentes numa espécie e dirigidos contra 
antígenos de outras espécies (Ex: Ac no homem anti-hemácias de carneiro). 
 
 
Em um tubo de ensaio adicionar: 
 
a. Inativar o soro (56°C por 30 minutos); 
b. Diluir 0,2 ml de soro em 1,8 ml de hemácias de carneiro a 2% (1/10); 
c. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente; 
d. Centrifugar 10 minutos a 2.000 rpm. 
e. Retirar o sobrenadante com pipeta tipo Pasteur para outro tubo. 
f. Diluir este soro conforme a fase 3. 
 
FASE 2: 
Sensibilização de hemácias de carneiro: (sistema hemolítico) 
Soro (0,2ml) 
+ 
Hemácias 
(1,8ml) 
 
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a. Misturar iguais volumes (1:1) de hemácias de carneiro a 2% e solução de hemolisina 2 U (conforme 
titulação obtida); 
b. Incubar 15 minutos a 37°C. 
FASE 3: 
Reação de Waaler-Rose: 
a. Realizar DUAS séries de diluições do soro tratado, como o esquema (Séries Controle e Reação): 
 
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
Soro absorvido- (ml; 1/10) 0,4 - - - - - - - - 
Sol. fisiológica (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 
Transferir (ml) 0,4 
Título 20 40 80 160 320 640 1280 2560 - 
 
b. Na primeira bateria (denominada série REAÇÃO) adicionar 0,4 ml de hemácias sensibilizadas; 
c. Na segunda bateria (denominada série CONTROLE) adicionar 0,4 ml de hemácias de carneiro a 2%; 
d. Incubar as baterias 1 hora a 37°C; 
e. Incubar uma noite (14 a 18 horas) a 4°C (geladeir a); 
f. Ler os tubos trinta (30) minutos após terem sido retirados da geladeira, observando em qual tubo ainda 
houve AGLUTINAÇÃO nas duas séries de reação; 
g. Títulos significativos: iguais ou maiores a 80. 
 
 
PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-PROTEÍNAS CITRULINADAS 
 
 Pacientes com artrite reumatóide possuem uma variedade de auto-anticorpos no soro e no líquido 
sinovial (tabela 1). Entre eles, aqueles direcionados a proteínas citrulinadas, que são específicas para a 
doença, aparecem precocemente, até vários anos antes do início da AR (~14 anos) e são úteis para auxiliar 
no diagnóstico. Entre os antígenos citrulinados reconhecidos por auto-anticorpos (IgG) na AR, encontram-se 
a profilagrina, a filagrina e a vimentina. O papel dos antígenos citrulinados na fisiologia da AR é sugerido 
pela forte especificidade desses auto-anticorpos para a doença, pelo achado de proteínas citrulinadas na 
sinóvia inflamada, pela produção intra-articular desses auto-anticorpos e pela extrema afinidade de 
peptídeos citrulinados pro moléculas de HLA-DRB1 que contêm o epitopo compartilhado. Os anticorpos anti-
CCP são produzidos na sinóvia reumatóide. Ademais, demonstrou-se que as células B do fluido sinovial de 
pacientes com AR produzem espontaneamente anti-CCP. Os auto-anticorpos anti-CCP mostraram-se mais 
específicos (tabela 2) do que o FR e, portanto, de maior utilidade para o diagnóstico da AR, principalmente 
na fase inicial. 
 A descoberta de que os epitopos reconhecidos por esses auto-anticorpos eram peptídeos contendo 
citrulina permitiu o desenvolvimento de uma plataforma baseada em ELISA. O formato de ELISA possibilitou 
maior padronização e reprodutibilidade dos ensaios, resultando em ampla aceitação mundial como os auto-
anticorpos mais específicos e precoces para o diagnóstico da AR (Alarcon & Andrade; Rev. Bras. Reumatol., 
 
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v.47, n.3, p.180-187, 2007). Um teste usa vimentina citrulinada mutada (MCV), uma proteína que é 
altamente específica para a AR. A proteína é ubíqua do citoesqueleto, está presente na sinóvia de pacientes 
e pode estar envolvida na patogênese da doença. A presença de anti-MCV está associada com a doença 
mais severa. Várias marcas de kits são fornecidas comercialmente hoje. 
 
 Tabela 1: 
 
 
 Tabela 2: Valores diagnósticos de auto-anticorpos FR, ACPA e anti-RA33 em pacientes com artrite recente. 
 Sensibilidade (%) Especificidade (%) Valor preditivo positivo (%) 
FR (>20UI/mL)* 55 89 84 
FR50 (≥50UI/mL)* 45 96 92 
ACPA (anti-CCP) 41 98 96 
Anti-RA33** 28 90 74 
* Título do FR encontrado no soro dos pacientes. 
* Ac dirigido a ribonucleoproteína nuclear heterogênea (hnRNP) no tecido sinovial inflamado. 
 
 
 
 
TÉCNICAS DE PESQUISA DA PROTEÍNA C REATIVA – PCR (CRP) 
 
1. Definição 
Proteína descrita inicialmente por Tillet e Francis em 1930, é uma proteínaplasmática pentamérica 
cíclica, normalmente encontrada em concentrações inferiores a 1mg/L. É sintetizada nos hepatócitos e 
constituída de 5 subunidades idênticas ligadas não-covalentemente, com uma massa molecular de 
aproximadamente 120 kDa. É membro da família pentraxina de proteínas oligoméricas ligantes de cálcio. A 
PCR liga-se dependentemente de cálcio a diferentes moléculas-alvo dos micróbios e resíduos de membrana 
celular, bem como, a diferentes materiais nucleares. A transcrição do gene da PCR nos hepatócitos é 
regulada positivamente por interleucina-6 (IL-6), IL-8 e fator de necrose tumoral (TNF-α) secretados pelos 
monócitos/macrófagos. "In vitro", precipita na presença de polissacáride C de pneumococo (origem do seu 
nome). É uma proteína termolábil, que perde a atividade a 70°C por 30 minutos e não atravessa a placen ta. 
Em reações inflamatórias ou necróticas, os níveis de PCR elevam-se (centenas de vezes) em 
poucas horas, dobrando a concentração a cada 8,2 horas, atingindo um máximo 1 a 3 dias após a injúria. 
Cessando a agressão, os níveis decaem, atingindo a normalidade em 1 a 3 dias. PCR atinge seu nível 
máximo e retorna aos valores de referência muito mais rapidamente que outros marcadores de inflamação. 
Uma diminuição rápida (aproximadamente 50% em 72 h) é também observada uma vez que cesse o 
estímulo, por exemplo, durante tratamento efetivo de uma infecção bacteriana por antibióticos. Ocorrendo 
complicações elas se refletem em novos aumentos ou manutenção de valores constantemente elevados. 
 
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2. Função Biológica 
Sua função precisa não é conhecida. Age como uma opsonina e ativa a via clássica do 
complemento, bem como a fagocitose de leucócitos, estimulação das funções de linfócitos e 
monócitos/macrófagos. Também tem sido mostrado que a PCR liga-se a lipoproteína de baixa densidade 
(LDL) e com isto tem sido detectado em placas ateroescleróticas. 
 
3) Aplicações clínicas 
Como teste de diagnóstico é extremamente inespecífico, pois quando positiva indicará a existência 
de um processo inflamatório agudo ou necrótico, cuja origem deverá ser pesquisada por testes específicos. 
a) Aparecem em doenças como: Infecções por Gram-negativos e Gram-positivos; peritonites; 
meningites serosas e bacterianas; septicemias bacterianas; indicador de presença de infecção no período 
neonatal; doenças pulmonares: pneumonia bacteriana, tuberculose ativa e pneumonia por Haemophilus 
influenzae; infecções urinárias: pielonefrites; doenças intestinais: fase aguda de infecção por Campilobacter, 
doença de Crohn; apendicite (parâmetro seguro); pacientes queimados e após trauma cirúrgico; infecções 
seguindo à ruptura prematura de membranas (parto); infarto agudo do miocárdio (94%)*; tumores 
malignos, câncer coloretal; esclerose múltipla; hepatite infecciosa aguda; diabetes; doenças reumáticas: 
febre reumática, artrite reumatóide (85%), artrite crônica juvenil, ataques agudos de gota, casos ativos de 
poliarterite nodosa, só em 4% dos pacientes com LES ativo em infecção intercorrente. Tem provado ser 
importante como meio para diferenciar entre as infecções bacterianas e virais. 
*A medição da PCR pode contribuir para o diagnóstico dos pacientes com síndromes coronárias 
agudas. Ficou demonstrado que um valor de PCR >10mg/l no estado prematuro (6 a 24 horas após a 
ocorrência dos sintomas) indica um aumento de risco momentâneo (30 dias a 1 ano) para a repetição de 
ocorrências cardíacas. 
b) Como teste de acompanhamento de evolução ou tratamento de doenças inflamatórias/necróticas 
já diagnosticadas (doenças reumáticas, neoplasias, tuberculose, meningite)... é o mais indicado, pois seus 
níveis correlacionam-se com a intensidade da injúria. 
c) VHS e PCR são testes com praticamente a mesma função. O que os diferencia é a maior 
fidedignidade da PCR, positivando e negativando precocemente e com isto reproduzindo mais fielmente o 
estado do paciente, além disto, o VHS é influenciado por certos estados fisiológicos (menstruação e 
gravidez, por exemplo). 
 
4. Pesquisa de PCR – Técnicas 
 
Pesquisa de PCR pelas técnicas Sensibilidade 
Precipitação em capilar 10,0 - 20,0 µg/ml 
 
10,0 - 20,0 µg/ml 
1,0 µg/ml 
Precipitação em gel: 
 Ouchterlony modificado 
 Mancini 
 Eletroforese 1,0 µg/ml 
Látex aglutinação 5,0 mg/l 
RIE 3,0 ng/ml 
Imuno turbidimetria 5,0 mg/l 
Nefelometria <5,0 mg/l 
 
 
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29 
 
 
AGLUTINAÇÃO DE PARTÍCULAS DE LÁTEX – PCR (CRP) 
 
Utiliza-se soro, devendo-se rejeitar amostras fortemente lipêmicas e não utilizar plasmas, pois o 
fibrinogênio poderá causar aglutinação inespecífica. Deixar os reativos e os soros a testar alcançarem a 
temperatura ambiente, antes da realização do teste. 
 
a) Determinação qualitativa 
- Depositar sucessivamente em 3 subdivisões da lâmina: 
20 µl do soro positivo, 
20 µl do soro negativo, 
20 µl do soro a testar. 
- Ao lado de cada depósito, adicionar 20 µl do reativo látex anti-PCR bem homogeneizado. 
- Misturar com uma espátula (uma para cada subdivisão). 
- Imprimir à lâmina um movimento suave de rotação. Observar o aparecimento de aglutinação entre 3 e 5 
minutos; 
 
Leitura: 
 Reação Negativa: a suspensão permanece homogênea. 
 Reação Positiva: aglutinação nítida entre 3 e 5 minutos. 
Não considerar as aglutinações que podem surgir depois de 5 minutos (aglutinações inespecíficas). 
Os soros, cuja concentração em PCR é elevada, podem apresentar um fenômeno de pró-zona e 
fornecer resultados negativos no procedimento qualitativo. Em caso de suspeita clínica, repetir a reação 
fazendo reagir 10µl de soro com 50µl de látex anti-PCR. 
 
b) Determinação semi-quantitativa 
1. Depositar sucessivamente em 2 subdivisões da lâmina: 
- 10 µl e 50 µl de soro a testar 
- depositar 50 µl de látex anti-PCR cuidadosamente homogeneizado, ao lado de cada gota de soro. 
2. Misturar as gotas de cada subdivisão com espátulas distintas e imprimir à lâmina um movimento suave 
de rotação. 
Observar o aparecimento de aglutinação entre 3 e 5 minutos. 
Leitura: 
Concentração em PCR 10 µµµµl de soro 50 µµµµl de soro 
Inferior a 7 mg/L ± 1 - - 
Entre 7 e 20 mg/L - + 
Entre 20 e 200 mg/L + + 
Superior a 200 mg/L + - 
 
Pode-se fazer outra determinação semiquantitativa usando uma série de diluições do soro a 
examinar em solução salina, determinando a maior diluição que ainda fornece aglutinação. 
 
 
 
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30 
Interpretação 
Teor normal para adulto: ≤5 mg/L. 
Para soros de pacientes que tem um teor elevado em fatores reumatóides, podem-se encontrar 
falso-positivos. Estudos estatísticos demonstram que este fenômeno acontece em aproximadamente 2% 
dos soros positivos em FR. Nesses casos, é necessário dosar a PCR por outro método. 
 
 
NEFELOMETRIA – PCR (Dade Behring) 
 
Princípio Metodológico: 
 Partículas de poliestireno revestidas de um anticorpo monoclonal contra PCR, na mistura com 
amostras de soro ou plasma que contêm PCR, se aglutinam. A intensidade de luz difusa no nefelômetro 
depende da concentração de PCR da amostra, de forma que, por comparação com diluições de um padrão 
de concentração conhecida, é possível determinar a concentração de PCR da amostra. 
 
Valores de Referência:Os valores de referência para indivíduos normais são indicados na literatura como ≤5mg/l. 
 No caso de utilização da PCR para avaliação de risco de doenças vasculares coronárias e 
periféricas, os valores medidos deverão ser comparados com os resultados anteriores. 
 
 
PCR ULTRA-SENSÍVEL (Nefelometria, Turbidimetria): Devido ao melhor conhecimento dos processos 
fisiopatológicos que levam à arteriosclerose, e que esta começa com um processo inflamatório, a PCR vem 
dispertando um grande interesse para os cardiologistas. 
Devido sua ligação com diversas doenças graves, como o infarto agudo do miocárdio, acidente 
vascular cerebral, arteriopatias periféricas (doenças vasculares), a arteriosclerose ocupa um lugar de 
destaque para a saúde e qualidade de vida. 
Portanto, além de ser útil na avaliação dos processos inflamatórios de um modo geral, a PCR-US é 
útil na predição de eventos coronarianos futuros em indivíduos saudáveis. Após nove anos de estudos 
referentes ao desenvolvimento de doenças arteriais periféricas, em 280 pacientes acompanhados, o Center 
for Disease Control (CDC) sugeriu o seguinte critério para avaliação de risco: 
 
 
Risco PCR - US (mg/L) 
Baixo Inferior a 1,0 
Médio De 1,0 a 3,0 
Alto Acima de 3,0 
 É importante salientar que o teste deve ser realizado em indivíduos saudáveis, sem doença 
inflamatória, para que seja interpretado como preditor de eventos cardiovasculares futuros. 
 
 
 
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31 
O LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO E OUTRAS DOENÇAS AUTO-IMUNES 
TÉCNICAS DE PESQUISA DO FATOR ANTI-NÚCLEO (FAN) 
 
 Os anticorpos anti-nucleares (ANA; grupo de anticorpos protéicos que reage contra o material 
nuclear celular), também chamado de fatores anti-nucleares, são utilizados para o diagnóstico de doenças 
auto-imunes, como o LES. Esses anticorpos são utilizados para a triagem destas doenças, sendo que um 
resultado negativo de ANA não exclui um diagnóstico. Quando ANA é positivo devem-se efetuar outros testes 
de anticorpos para confirmar o diagnóstico. 
 
 
1. Técnica de Imunofluorescência Indireta - Substrato: Células HEp-2 (linhagem de célula cancerosa, 
epitelioma de laringe humana). 
Materiais e reagentes: 
• lâminas contendo células HEp-2 cultivadas, são mantidas a 2 - 8°C; 
• conjugado: anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas IgG humano conjugados com 
isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluído em Azul de Evans; 
• PBS pH 7,2 – 7,4; 
• soros controle negativo e controle positivo de padrão de fluorescência conhecido; 
• meio de montagem: glicerol 78%, fosfato de sódio 6mmol/l, fosfato de potássio 1,6mmol/l, 
cloreto de sódio 60mmol/l, azida sódica 0,95 g/l; 
• lamínulas, câmara úmida e pipetas; 
• microscópio de imunofluorescência equipado com filtros de excitação de 495nm e de emissão 
de 525nm para visualização do FITC. 
 
Cuidados com o soro: amostras de soro podem ser estocadas em temperatura ambiente por no máximo 
24 horas. Para tempos maiores de estocagem, deve ser mantido a 2 – 8ºC (no máximo 3 dias), ou 
congelado (-20ºC ou menos). Retirar as amostras do armazenamento e misturar antes do uso. Evitar 
congelar e descongelar por várias vezes. Evitar uso de soros lipêmicos (os lipídeos fixam-se 
inespecificamente às lâminas e são muito difíceis de serem removidos). Alguns soros podem conter 
enzimas proteolíticas que atacam e digerem o substrato (soros contaminados com microorganismos). Estes 
soros devem ser inativados a 56ºC por 30 minutos. 
 
Procedimento técnico: 
a- Inativar as amostras de soro a 56°C por 30 minutos; 
b- Retirar as lâminas e os reagentes do refrigerador e esperar adquirir a temperatura ambiente; 
c- Seguir as instruções do fabricante; 
d- Preparar diluição 1/40 – 1/80, dependendo do indicado pelo fabricante, do soro controle 
positivo e amostras em PBS; 
e- Transferir cada soro diluído para uma das divisões da lâmina (triagem), cobrindo todo poço; 
f- Incubar em câmara úmida a 25°C por 30 minutos; 
 
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32 
g- Lavar 2 vezes em PBS, sendo de 10 minutos cada lavagem; 
h- Adicionar o conjugado, cobrindo todos os poços; 
i- Incubar em câmara úmida em 25°C por 30 minutos; 
j- Lavar 2 vezes em PBS, sendo de 10 minutos cada lavagem; 
k- Secar cuidadosamente a lâmina; 
l- Colocar uma gota de glicerol tamponado, cobrir com lamínula; 
m- Proceder à leitura por no máximo 24 horas, se armazenado em geladeira, em câmara úmida 
e no escuro. 
 
Leitura: 
a- Observar os controles: 
O controle negativo mostra núcleos corados em vermelho. O controle positivo deve mostrar 
fluorescência do padrão esperado e a diluição é considerada quando o padrão ainda é distinguido. Quando 
isso não ocorrer, pode ter havido: erro nas diluições, soro controle deteriorado, conjugado diluído de forma 
errada, kit vencido. Repetir a reação após sanar os problemas. 
 
b- Título: 
Se a diluição inicial da amostra (1/40 – 1/80) der positiva, isto é fluorescente, proceder a partir desta, 
diluições maiores até sua negativação (sem fluorescência). 
São identificados vários padrões de fluorescência que estão associados com as várias doenças auto-
imunes (ver tabela abaixo). Amostras séricas de pacientes, frequentemente contêm anticorpos para muitos 
antígenos nucleares. Cada padrão de ANA exibirá um título independente do outro padrão. Quanto maior o 
título de determinado anticorpo ANA que ocorre em associação a determinada doença auto-imune, maior a 
probabilidade de ocorrência da doença e maior sua atividade. Títulos mais baixos, após a terapia, indicam 
menor atividade da doença e terapia efetiva; um aumento sugere falta de controle ou atividade clínica 
renovada. 
Para a técnica de FAN podem ser usados diferentes antígenos fixados em lâminas de 
imunofluorescência. Ex.: fígado e rins de camundongo, leucócitos humanos, timo de bezerro ou coelho, 
cultura de células tumorais e cultura de fibroblastos humanos. O hemoflagelado Crithidia luciliae é muito 
utilizado para confirmar LES (anti-DNA nativo). Crithidia apresenta um cinetoplasto rico em DNA de dupla fita 
e sem histonas e seu uso confere alta especificidade ao teste para o diagnóstico de LES (70%), sendo 
usada em testes confirmatórios para o diagnóstico de LES. 
Como o FAN é um método de triagem para ANA, faz-se necessário a determinação das especificidades 
dos auto-anticorpos envolvidos nas doenças auto-imunes. Estas especificidades são úteis ao médico para o 
estabelecimento do diagnóstico correto, prognóstico e seguimento clínico e terapêutico do paciente. Podem 
ser utilizadas as técnicas: imunodifusão dupla, contraimunoeletroforese, hemaglutinação passiva, ELISA, 
imunoprecipitação, imunodot e western-blot. 
Em rotina de laboratório o uso de substrato de células HEp-2, em reação de imunofluorescência indireta 
é o mais útil. A utilização de células Hep-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes padrões 
nucleares, nucleolares, da membrana nuclear, do aparelho mitótico e citoplasmático, dados por diferentes 
auto-anticorpos. A grande vantagem do método é a sua sensibilidade, o que permite a triagem de uma gama 
 
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Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM 
Aristides SMA, Bertolini DA, Lonardoni MVC, Silveira TGV 
 
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imensa de anticorpos. Com ele é possível se determinar principalmente seis padrões diferentes de 
fluorescência, como indicativos da presença dos diferentes anticorpos: