Relatorio Microscopia FINAL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Fellipe Carvalho
Nayara Louise 
Microscopia
Relatório acadêmico apresentado como requisito parcial de avaliação da disciplina de Laboratório de Microbiologia de Alimentos I, ministrada pela Prof.ª Dr.ª Janeeyre Ferreira, no 2º semestre de 2014. 
Fevereiro de 2015
Microscopia
Introdução
Para estudar a célula dependemos de técnicas e instrumentos que foram e vem sendo desenvolvidos juntamente com as descobertas e o progresso da biologia celular. Desde a antiguidade já havia tentativas de reforçar a visão com o auxílio de dispositivos ópticos. A partir do século XIV, as lentes começaram a ser usadas comumente para corrigir defeitos de visão e como dispositivos de aumento.
Isso porque grande parte dos microrganismos presente em nosso cotidiano, e os estudados em laboratórios são quase sempre invisíveis. Por isso há necessidade do uso do microscópio óptico e principalmente dos métodos de coloração específicos.
As lâminas podem ser examinadas no microscópio de duas formas, o exame a fresco, onde células microbianas podem ser examinadas vivas sobre lâminas com auxilio ou não de corantes, vitais, ou podem ser fixadas pelo calor sobre a lâmina e coradas com corantes químicos específicos. 
É difícil a visualização microscópica a fresco devido ao tamanho reduzido e ao índice de refração dos microrganismos que se aproximam ao da água, deixando-os incolores, quando suspensos em um meio aquoso. Apesar desta dificuldade de visualização, as preparações a fresco são úteis para observar a viabilidade e atividades celulares (mortalidade, fissão binária), e também observar a forma e tamanho natural das células.  
Para se estudar as propriedades da célula e observá-la com maior precisão é necessária a utilização de corantes e técnicas de coloração. Coloração significa corar os microrganismos com um corante que enfatiza certas estruturas. Essas técnicas servem para mostrar as várias estruturas dos microrganismos, identificar suas estruturas internas e externas (como flagelos, membranas, cápsulas, entre outros) e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes. Para colorar um microrganismo é necessário que esteja fixado à lâmina para visualização no microscópio.
O método de coloração simples serve para destacar todo o microrganismo, assim ficando nítida a forma celular e sua estrutura básica. No nosso caso, consistiu em uma solução aquosa e um único corante básico. O corante usado na coloração simples é o cristal violeta. 
Uma das vantagens desse método é devido ao seu baixo custo, sua facilidade, além de permitir preservar as preparações. Porém, não é possível observar estruturas internas da célula, devido ao contraste inexistente do corante Cristal Violeta.
Coloração de Gram é uma técnica de coloração para diferenciação de microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas.
Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta-de-metila (cristal violeta), todas se coram em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo iodo-pararosanilina, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante safranina colore novamente as estruturas que foram descoradas.
São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com relação à espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.
Metodologia
Preparação de lâminas à fresco - Meio líquido
Foi preparada uma solução feita com fermento biológico. A partir desta solução, extraímos uma gota com auxílio da alça de platina, e colocamos na lâmina, Com cuidado, colocamos por cima dessa amostra, uma lamínula. Visualizamos a lâmina na objetiva de 40 vezes. 
Preparação de lâminas à fresco - Meio sólido
Foi flambada a alça de platina em forma de “L”. Em seguida recortamos um pedaço do meio AGAR SABOURAUD, em forma retangular. Colocou-se no centro da lâmina. Em seguida a alça foi flambada novamente. Coletou-se um pouco do bolor do pão, que foi colocado em cima do meio cortado. Com cuidado, por cima do fungo, foi colocada uma lamínula. Observamos ao microscópio com a objetiva de 10 vezes e 40 vezes.
Preparação de lâminas fixadas e corada
Escolhemos o meio do qual vamos extrair as leveduras, nesse caso, cultivadas previamente na placa de Petri, e já com muitas culturas visíveis naquele meio sólido. 
Para isso, flambamos uma alça, e usamos uma solução de água peptonada para colocar nossa cultura. Colocamos uma gota da solução, com auxílio da alça, na lâmina, já previamente higienizada, flambamos a alça mais uma vez, espera-se esfriar um pouco, e com ela, escolhemos uma colônia de células naquele meio para fazer a visualização.
Após pegar a colônia através da alça, a colocamos na lâmina, e é feita a técnica do esfregaço, que consiste em espalhar a cultura com movimentos estriados, ainda com auxílio da alça. Esse método permite a visualização separadamente das células, podendo em alguns casos haver contagem, mas no nosso caso, apenas para facilitar a visualização da estrutura morfológica. 
Aguardamos a secagem da lâmina, para fazer a fixação da mesma, através do calor. Depois de fixada, é colocada algumas gotas do corante cristal violeta na lâmina, e aguardamos em média 1 minuto para o corante agir bem sobre o material. Após esse tempo, lavamos a lâmina com água corrente, a secamos com auxílio de papel absorvente, e para facilitar a visualização, coloca-se uma gota de óleo de cedro na lâmina, que consiste em um óleo que pode encostar nas objetivas. 
Após esse processo, é feita a visualização das células no microscópio na objetiva de 100x.
De maneira semelhante, também extrairmos material para visualização de meio aquoso. 
Utilizamos a levedura Sacharomyces cerevisae no caldo Ym em um tubo de ensaio. Flambamos o tubo no bico de Bunsen, com a auxílio de uma alça de platina, já flambada, introduzimos a alça no tubo e retiramos uma gota da suspensão da solução líquida da levedura, colocamos na e, de maneira semelhante ao meio sólido exercemos a técnica do esfregaço, deixamos secar e depois fixamos na chama. Em seguida, o processo é semelhante ao feito no meio sólido.
Coloração diferencial: Coloração de Gram
Utilizou duas placas de Petri contendo bactérias (não identificadas), supostamente uma Gram Positiva e uma Gram Negativa no meio PCA. Para cada placa, uma lâmina foi preparada com o seguinte processo: com a alça de platina flambada no bico de Bunsen, introduzimos a alça num tubo com água peptonada, retiramos uma gota e depositando na lâmina identificada e procedeu com a mesma técnica de coloração simples tendo apenas uma diferença na coloração que ocorreu da seguinte forma: Colore as duas lâminas ao mesmo tempo, o primeiro corante usado é o cristal violeta, por 1 minuto, lavamos na água corrente depois usamos o iodo (que é um fixador) por mais 1 minuto, lavamos com álcool e em seguida na água corrente, seguimos com Fucsina por 30 segundos e por último lavamos mais uma vez em água corrente. 
Resultados e discussões
Na lâmina da preparação à fresco,podemos observar que a partir do experimento realizado, observamos a morfologia e a mobilidade da Saccharomyces cerevisiae, onde verificamos a presença de colônias (pseudo-hifas) e alguns brotos soltos.
A observação da lamina de bolor no microscópio nos permitiu observar algumas estruturas do fungo filamentoso como hifas, micélio e esporos.
A lâmina preparada do meio sólido, ficou corada em tom roxo claro. Observou-se muitas células do tipo bacilos, já a que preparamos do meio líquido, observamos uma quantidade bem menor dessas células. 
O uso do corante cristal violeta nesse caso, auxiliou na visualização, e foi de extrema importância para o estudo. Como foi feito o experimento mais de uma vez, observamos que ao utilizar a técnica do esfregaço com mais eficiência, as células ficam mais dispersas umas das outras, o que facilita a identificação.
Na coloração de Gram, após o esfregaço ter sido fixado pelo calor e corado com o cristal violeta, a lâmina ficou corada em tom levemente roxo, já que o corante penetrou para no citoplasma das bactérias. A função do iodo é intensificar a coloração na lâmina. A função do álcool nas bactérias Gram positivas é de ressecar a parede de peptideoglicano. Com isso há formação de uma parede mais firme, impedindo a saída do cristal violeta. Nas bactérias Gram negativas o álcool tem pouco efeito na parede de peptideoglicano já que esta é bem fina. Na última etapa a lâmina foi corada com fucsina, que penetrou no citoplasma somente das Gram negativas, deixando-as em tom aparentemente rosa, já que o citoplasma das Gram positivas estava completamente preenchido pelo cristal violeta.
Conclusão
A partir dos resultados apresentados, observou-se a eficiência dos métodos utilizados: preparação a fresco; coloração simples e coloração de Gram.
Portanto, as técnicas de coloração se tornam mais eficientes em relação as colorações à fresco, pois se tem uma melhor visualização microscópica das amostras analisadas, assim como uma melhor identificação da mesma. Porém a coloração de Gram possibilita a diferenciação das bactérias do tipo Gram positivas das do tipo Gram negativas, através de diversidades de coloração entre as mesmas.