2_Biosseg Cont Cresc 2012

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Wagner Luiz Batista
batista@unifesp.br
Biossegurança e controle de crescimento 
microbiano
Organização e biossegurança em 
laboratório 
Adota-se o termo biossegurança como a ciência voltada para o 
controle e a minimização de riscos advindos da prática de diferentes 
tecnologias, seja em laboratório seja no meio ambiente.
O fundamento básico da biossegurança é assegurar o avanço dos 
processos tecnológicos e proteger a saúde humana, animal e o meio 
ambiente.
Manual de Biossegurança, Hirata & Mancini Filho, 2002
Definição e Fundamento
As práticas de biossegurança baseiam-se na necessidade de 
proteção ao operador, seus auxiliares e a comunidade local contra 
riscos que possam prejudicar a saúde.
A BIOSSEGURANÇA LEGAL – Brasil
Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio)
Responsável por normas de:
Análise de risco,
Emissão de certificado de qualidade em biossegurança (CQB),
Define nível de biossegurança
Características físicas estruturais de acordo com o tipo de micro-
organismo a ser manipulado.
Níveis de Biossegurança
Classe de Risco 1
Organismos que não causam doenças em humanos e animais.
Classe de Risco 2
Patógeno que causa doença, mas não consiste em risco sério.
Classe de Risco 3
Patógeno que geralmente causa doenças graves em humanos e animais, e 
pode representar sério risco para o manipular.
Classe de Risco 4
Patógeno que representa grande ameaça para humanos e animais, 
representa grande risco para o manipulador e pode ser transmitido de um 
indivíduo a outro.
Nível 1 de Biossegurança (NB-1) ou
Proteção básica (P1)
Trabalho com microrganismos que não causam infecções
no homem adulto e sadio.
Ex.: S. cerevisiae, Lactobacillus casei
Área física: instalações básicas, pia
Práticas básicas de segurança em microbiologia
Laboratório de escola
 Trabalho com micro-organismos de risco moderado presentes na
comunidade e associados com infecções humanas de gravidade
variável.
Ex.: HVB, Salmonella spp. e Candida albicans.
 Área física: cabines de segurança para manipulação dos materiais
clínicos com risco de formação de aerossóis.
 Acesso ao laboratório é mais controlado. Pessoal treinado.
 descontaminação do lixo
 Laboratório de análises clínicas, pesquisa.
Nível 2 de Biossegurança (NB-2) ou (P2)
Manipulação de tecidos e sangue humano, líquidos corporais 
Laboratórios que trabalham com micro-organismos que
tem um potencial para transmissão por via respiratória e 
que causam infecções graves.
Barreiras 1a e 2a para proteger funcionários do setor, de 
áreas contíguas, o ambiente, a comunidade.
Exemplo: laboratório de trabalha com micobactérias.
Nível 3 de Biossegurança (NB-3) ou (P3)
Laboratórios que trabalham com agentes
extremamente infecciosos e potencialmente fatais. 
Instalações. 
• Todo procedimento é feito na cabine Classe III
• Roupas de proteção
Exemplo: vírus ebola.
Nível 4 de Biossegurança (NB-4) ou (P4)
Classificação do organismo segundo seu potencial patogênico
Equipamentos de Segurança
 Cabines de Segurança Biológica
 Classe I 
 Classe II
 Classe III 
 Copo de segurança da centrífuga
 Equipamento de proteção individual (EPI)
 Luvas, aventais, gorros, proteção para sapatos, botas, 
máscaras, protetor facial,respiradores e óculos. 
Cabines de Segurança Biológica
Classe I Classe II
Cabines de Segurança Biológica
Classe III
Manual de Biossegurança, Hirata & Mancini Filho, 2002
O trabalho laboratorial executado de forma adequada e 
bem planejada previne a exposição indevida a agentes 
considerados de risco à saúde e sem dúvida evita 
acidentes. A esse procedimento denominamos boas 
práticas de laboratório 
Boas Práticas de Laboratório
Atividades que geram aerossol
Manipulação de agulhas e seringas
 Expelir ar
 Tirar agulha
Inoculação
 Flambar alças
 Resfriar a alça no meio de cultura
 Fazer estrias
Manipulação de pipetas
 Homogeinizar suspensões
 Colocar a suspenção no meio de cultura
Manipulação de amostras e culturas
 Centrifugação
 Homogeinização
 Decantação de fluidos
 Remoção de tampas
 Filtração de material 
Ingestão: Atividades relacionadas com transmissão oral
 Pipetar com a boca
 Passar a mão ou material contaminado na boca
 Alimentos e bebidas na área de trabalho
Inoculação: Atividades relacionadas com 
pele e mucosas
Olhos, boca e narina
Lesão de pele
Trabalhar em superfícies contaminadas
e/ou com equipamentos contaminados
Inoculação: Atividades relacionadas com transmissão
direta intravenosa ou subcutânea
Manipulação de agulhas e seringas
Manuseio de lâminas
Medidas de Controle e Proteção
Medidas individuais: 
Emprego de EPIs (equipamentos de proteção individual): 
Luvas, máscara, avental de manga longa, óculos de proteção, sapatos 
fechados, respiradores, toucas ...
Medidas coletivas:
Descarte adequado e remoção de lixo, cabines de seg. química, fluxos 
laminares (cabines de seg. biológica), 
extintores de incêndio, 
lavador de olhos, 
sinalização.
Organização e limpeza
Placas de Risco
Placas de Alerta
Placas de Comando
Placas de Segurança
Medidas coletivas: 
Descarte adequado e remoção de lixo, 
extintores de incêndio, lavador de olhos, 
sinalização adequada
Acesso aos equipamentos de segurança coletiva
Livre Obstruído
Coleta de lixo seletiva
Em caso de acidente com material biológico:
Notificar responsável
Pequeno volume/área de contaminação
Isolar o local, limitar área com papel toalha
Saturar com água sanitária ou
hipoclorito 1% por 30 min.
Descartar o material e
lavar área de trabalho
Lavar as mãos
Tratamento de material biológico para
descarte
Material descartável ou não: 
acondicionar em sacos de autoclave
Autoclave: 121˚C, 15 min. mínimo
(grandes volumes podem precisar de mais tempo)
Lixeiras com saco branco (lixo hospitalar)
Incineração
Não coma,
Não beba em 
laboratórios
Pipetar com a boca é terminantemente proibido
Retirar as luvas antes de usar o telefone, tocar em óculos, 
maçanetas, portas de geladeiras, etc.
X
X
X
X
Não circular nas áreas sociais utilizando equipamentos de proteção
X
X
Não usar avental de bancada do laboratório no refeitório
X
X
Limpe a 
bancada antes e 
após o trabalho
Importante !! 
Como trabalhar com bico de bunsen corretamente ?
No laboratório de microbiologia vamos respeitar as normas de 
biossegurança
Práticas de Microbiologia, Vermelho, Guanabara Koogan
Nem tudo que é perigoso vêm marcado
Fontes de Informações
Centers for Disease Control (CDC)
National Institutes of Health (NIH)
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) 
CONTROLE DO CRESCIMENTO 
MICROBIANO
Alguns conceitos:
• Limpeza: remoção mecânica de matéria orgânica e micro-organismos.
• Descontaminação: limpeza com agentes químicos ou físicos.
• Desinfecção: é a eliminação parcial dos micro-organismos de material 
inanimado usando substâncias químicas, radiação ultravioleta, água fervente ou 
vapor. 
• Anti-sepsia: semelhante à desinfecção, porém relacionada a tecidos vivos, e 
realizada por produtos químicos denominados anti-sépticos.
• Esterilização: é a eliminação total dos micro-organismos e esporos por 
métodos químicos ou físicos.
 Área da saúde: prevenir a transmissão de doenças. 
 Área industrial: evitar a decomposição de alimentos, cosméticos, 
medicamentos
 Área de saneamento: evitar a contaminação da água e do ambiente.
Esse controle de micro-organismos é possível pela ação de agentes 
físicos e químicos, que possuem propriedades de matar a célula 
microbiana,ou de impedir a sua reprodução.
POR QUE CONTROLAR O
CRESCIMENTO MICROBIANO?
Métodos físicos Temperatura
Radiação
Filtração
Dessecação
Remoção de O2
Vibração ultra-sônica
Métodos químicos Desinfetante
Anti-sépticos
Conservantes de alimentos
Métodos físicos e químicos de controle dos 
micro-organismos
Vermelho, Guanabara Koogan
MÉTODO FÍSICO
Temperatura: calor seco ou úmido
(método seguro, de baixo custo e não gera produtos tóxicos)
Acima da temperatura ideal de crescimento ocorre desnaturação de 
proteínas estruturais levando a morte do micro-organismo.
- Tempo de Redução Decimal (TRD ou D): o tempo, em min, em que 90 % de 
uma população microbiana em uma determinada temperatura será morta. 
quanto maior a temperatura menor o D (tempo) 
Fatores que influenciam o tratamento 
microbiano
1. Tamanho da população
Quanto > a população microbiana > o tempo de tratamento
2. Natureza da população
- Presença de endosporos: mais resistentes
- Diferentes estágios de crescimento:
- Presença de micobactérias (mais resistentes)
3. Concentração do agente
4. Tempo de contato
5. Temperatura e pH
6. Presença de matéria orgânica
Curva de morte microbiana
Efeito da temperatura em uma população microbiana
70°C = 3 min
60°C = 12 min
50°C = 42 min
Calor úmido
• Autoclavação
121°C por 15 min (mínimo)
• Pasteurização
(indústria de alimentos)
Aquecimento de produtos para redução do número de micro-organismos. 
Não esteriliza.
Ultra alta temperatura (UHT) 141°C/2-4 s
Alta temperatura e curto tempo (HTST) 72°C/15 s
Baixa temperatura (LTH) 63°C/30 min
Autoclavação
tem menor poder de penetração que o calor úmido e 
usam temperaturas e tempos maiores
recomendado para óleos, pós 
temperatura entre 160°C e 170 °C por 60 a 120 min
Calor seco
• Refrigeração comum (0 a 7ºC)→ efeito bacteriostático
Baixas temperaturas
Causa diminuição na taxa de 
crescimento e atividade 
metabólica.
depende do tipo de micro-
organismo, alguns (psicrófilos) 
crescem lentamente em baixas 
temperaturas
• Congelamento torna os micro-organismos dormentes mas não 
necessariamente os mata.
Tem vários efeitos sobre as células, dependendo do seu comprimento de onda, 
intensidade e duração.
Podem ser classificadas como:
Ionizantes (retiram elétron da molécula formando íons) raios gama, raioX
Não ionizantes (mutagênica) UV
Reduz ou elimina micro-organismos
Radiação
RADIAÇÃO IONIZANTE:
- Destruição do DNA
- Radiações de pequeno comprimento de onda e portanto de alta energia 
e penetrabilidade. 
usada para equipamentos médicos plásticos (cateter, luvas ...)
Raios Gama: emitidos pelo cobalto radioativo.
Raios X: são produzidos por máquinas similares as dos feixes de elétrons e 
são de natureza similar aos raios gama.
RADIAÇÃO NÃO - IONIZANTE:
- Possui um comprimento de onda > que da Radiação Ionizante 
(normalmente acima de 1 nm).
- Luz Ultra Violeta (UV): comprimento de onda de 4 a 400 nm, sendo 
o comprimento de 260 nm o mais eficiente.
utilizada para destruição de micro-organismos no ar e em superfícies
Desvantagem - apresenta baixa penetrabilidade (não atravessa vidros, 
filmes escuros e outros materiais). 
- Microondas: radiação com os maiores comprimentos de ondas. 
Utilizado para esterilizar meios de cultura e soluções.
Filtração
Utilizada para materiais sensíveis ao calor (antibióticos, soluções)
Bactérias retidas na superfície de um filtro do tipo Isopore®
(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)
Dessecação
Envolve a remoção de água das células microbianas para controle de crescimento 
microbiano.
- Liofilização
congelamento rápido e remoção da água por sublimação
bacteriostático, usado na indústria de alimentos e preservação de culturas 
bacteriana
- Defumação
Diminui o teor de água por exposição de alimentos durante horas ou dias à
fumaça de madeira em combustão.
Vibração ultra-sônica
Vibração de alta freqüência que leva ao rompimento das células, quebras 
de DNA. Não esteriliza.
MÉTODO QUÍMICO
Usam substâncias químicas de origem natural ou sintética para eliminar 
ou inibir crescimento de micro-organismos.
- Efeito estático
(bacteriostático, fungistático ou virustático)
inibição de crescimento
- Efeito microbicida 
(bactericida, fungicida, viruscida)
morte do micro-organismo
limitação: ação dos agentes é diferente para cada micro-organismo
Diversas classes:
• Agentes alquilantes (rompem ácidos nucleicos)
glutaraldeído, formaldeído
óxido de etileno (vapores tóxicos)
• Fenol (ácido carbólico) desnaturam proteínas
• Biguanida (lesam membrana citoplasmática)
clorexidina (compostos clorados) usada para controlar micro-
organismos na pele
• Halogênios (iodo, cloro) inibem enzimas e inativam ácidos nucleicos
hipoclorito de sódio
• Álcoois desnaturam proteínas
etanol de 60-90%
...
Metais pesados e seus compostos
 Camisetas de atletas (Ag)
 Bandagem (Ag)
 Desodorantes (Ag)
 Xampus anticaspa (Zn)
 Colírios (cloreto de Prata)
 Piscinas (sulfato de cobre)
Íons metálicos se combinam com 
os grupos sulfidrila nas proteínas 
celulares, ocorre desnaturação
ANTIBIÓTICOS
- Controle microbiano através da ingestão ou aplicação superficial.
Teste de susceptibilidade in vitro pelo método de disco difusão