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Profa. Dra. Milena Araújo Tonon Turma Farmácia- 4º Termo Em se tratando de medicamentos é imprescindível estabelecer padrões ou níveis de qualidade de cada produto. Os ensaios analíticos avaliam a conformidade do medicamento, bem como de toda matéria prima envolvida em seu preparo, frente às especificações estabelecidas. A absorção atômica e a espectrofotometria ultravioleta e visível são exemplos de técnicas instrumentais que têm sido amplamente utilizadas na área farmacêutica para determinações qualitativas e quantitativas, na caracterização de fármacos, impurezas e metabólitos. A natureza da radiação eletromagnética e sua interação com matéria são amplamente estudadas na química analítica. A espectroscopia avalia essa interação através da quantidade de radiação produzida ou absorvida pelas moléculas. Os métodos são classificados de acordo com a faixa do espectro eletromagnético envolvida na análise A luz visível cobre uma pequena parcela da faixa espectral. O espectro, dependendo do comprimento de onda e da frequência, é dividido em raios gama, raios X, ultravioleta, visível, infravermelho, microondas, ondas de rádio e frequência audível. A luz se comporta como um campo elétrico e magnético alternado, podendo ser descrita tanto em termos de partículas como de ondas. Em ondas, a distância entre uma crista à outra crista adjacente é denominada Comprimento de Onda (λ). A frequência (ν) corresponde ao número de ondas que passam por um determinado espaço de tempo (ondas por segundos ou hertz). A frequência é determinada pela fonte que emite e independe do meio que atravessa. Já a velocidade de propagação (vi) é dependente do meio que a radiação atravessa e da frequência. No vácuo a luz move-se com sua velocidade máxima (velocidade da luz no vácuo c =2, 998 x 108 m/s). Em outros meios a velocidade é menor devido à interação do campo eletromagnético com as moléculas do meio. Comprimento de Onda (λ): distância entre uma crista à outra crista Frequência (ν): número de ondas que passam por um determinado espaço de tempo (ondas por segundos ou hertz) Velocidade de propagação (vi): velocidade menor ou maior dependendo da interação do campo eletromagnético com as moléculas do meio A energia eletromagnética luminosa, como partícula, é caracterizada pela energia dos fótons. Estas partículas transportam quantidades de energia distintas que estão relacionadas com as características de cada radiação. A radiação microondas estimula o movimento rotacional das moléculas, já a radiação infravermelha estimula a vibração das moléculas. A luz visível e a radiação ultravioleta quando absorvidas estimulam a transferência de elétrons para orbitais de maior quantidade de energia. A energia de um fóton é proporcional à frequência. O aumento da frequência é correlacionado ao maior número de ondas que passam por segundo e assim maior energia é transportada. A relação entre o comprimento de onda, a energia e a frequência são descrita de acordo com a equação abaixo. velocidade da luz no vácuo c =2, 998 x 108 m/s A frequência (ν) Essa energia, ao atravessar uma solução contendo átomos e moléculas, pode interagir com os elétrons e ser absorvida. O átomo passa do estado fundamental para um estado de maior energia ou “estado excitado”. No estado excitado o átomo é altamente instável. Após absorver a radiação, o elétron sofre relaxação e a energia em excesso é liberada e assim o átomo retorna ao seu estado fundamental (nível de energia mais estável) Na espectroscopia de absorção é medida a atenuação da radiação em função do comprimento de onda sendo que cada elemento químico tem estrutura eletrônica e níveis de energia diferenciados além de possuir uma energia de ionização característica Desta forma, considerando Po a potência da radiação incidente e P a potência da radiação transmitida, a potência da radiação transmitida decai exponencialmente com o aumento do caminho percorrido na solução e com o aumento da concentração. A transmitância (T) desta amostra corresponde à razão de luz que atravessa a amostra. A lei de Lambert-Beer, também conhecida como Lei de Beer, estabelece a razão quantitativa da relação entre a atenuação da radiação com a concentração da amostra (C) e a extensão do caminho óptico (b). A intensidade da luz emitida diminui exponencialmente com o aumento da espessura do meio absorvente A intensidade de um feixe de luz monocromático diminui exponencialmente com o aumento da concentração da substância absorvente A equação abaixo relaciona todas essas grandezas de acordo com a Lei de Beer. A lei de Lambert-Beer é válida para feixes de luz monocromáticos (luz com um único comprimento de onda) e amostras suficientemente diluídas. Em amostras concentradas a proximidade das moléculas pode interferir em suas propriedades resultando em desvios na relação linear da concentração e absorbância e consequentes erros de análise. Essa lei também pode ser aplicada para soluções contendo mais de uma substância desde que não haja interação entre elas. Absorção Atômica A espectrometria de absorção atômica é empregada em análises qualitativas e quantitativas. Possui alta seletividade, sendo capaz de detectar traços de elementos na amostra a ser analisada (concentrações na ordem de ppm ou ppb). A espectrometria de absorção atômica é uma técnica que teve sua origem nos testes de chama, em experimentos qualitativos na identificação de alguns íons metálicos . Na espectrometria atômica a determinação é feita em meio gasoso. O espectrofotômetro de absorção atômica consta de uma fonte emissora de luz, sistema de nebulização-combustão da amostra e do sistema de detecção. Sistema nebulizador-atomizador A amostra é volatilizada e decomposta a átomos (atomização) por uma chama, por um forno aquecido eletricamente ou em plasma Fonte emissora de luz A fonte emissora de luz deve garantir um espectro de emissão composto por linhas estreitas do elemento de interesse. A absorção da radiação em freqüências bem definidas gera espectros de absorção típico do elemento que está sendo analisado. Sistema de detecção Este é responsável por responder ao sinal elétrico gerado a apartir da energia não absorvida pela amostra gerando um sinal proporcional a intensidade da radiação transmitida. A diferença entre a quantidade de radiação emitida pela fonte e a quantidade de radiação que chega ao detector é proporcional à concentração de átomos no estado gasoso. Existem diversos exemplos de procedimentos analíticos descritos que empregam a espectrometria de absorção atômica no controle de qualidade de amostras como a análise de água, solo, sangue, saneantes, agrotóxicos, alimentos e medicamentos. No site da Anvisa, por exemplo, dispomos do Guia de Procedimentos de Controle de Qualidade de Cosméticos. Neste guia é descrito o método de identificação do zircônio em produtos cosméticos antitranspirantes, exceto aerossóis, sendo que o zircônio, depois de ser extraído em meio fortemente ácido na amostra, é dosado por espectrofotometria de absorção atômica. Espectrofotometria Ultravioleta/Visível A espectrofotometria visível e ultravioleta é um dos métodos analíticos mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas. Quando essa energia atravessa uma solução contendo átomos e moléculas presentes em uma cubeta (recipiente contendo a solução) parte da radiação é absorvida. A quantidade absorvida está relacionada com a concentração da solução. A absorção nessa região dependerá também da estrutura da molécula, ocorrendo principalmente nos sistemas conjugados A região do espectro correspondente a radiação ultravioletaé considerada de 200 a 400 nm, e a região do visível entre 400 a 800 nm. Equipamento: fonte de luz, seletor de comprimento de onda, compartimento para as cubetas, detector e processador e leitor de sinal A absorção da radiação envolve a transição dos elétrons da camada de valência. Os elétrons compartilhados em ligações simples estão fortemente ligados. Desta forma a energia requerida para a transição é muito alta (região do ultravioleta de vácuo). Já os elétrons de ligações duplas e triplas são facilmente excitáveis pela radiação e a presença desses está diretamente relacionada com o comprimento de onda no qual uma molécula absorve. Os elétrons não ligantes presentes em compostos contendo heteroátomos como nitrogênio, oxigênio, enxofre ou halogênio também podem ser excitados. Cromóforo Transições λ (nm) Cromóforo Transições λ (nm) R-OH n→σ* 180 R-C≡C-R π→ π* 170 R-O-R n→σ* 180 R-C≡N n→ π * 160 R-NH2 n→σ * 190 R-N=N-R n→ π* 340 R-SH n→σ* 210 RCOOH n→ π* 205 R2C=CR2 π→ π * 175 RCOOR’ n→ π* 205 R-NO2 n→ π * 271 RCONH2 n→ π * 210 Denominam-se cromóforos os grupos insaturados que absorvem na região do ultravioleta e visível. O comprimento de onda e a intensidade de absorção dos cromóforos de uma molécula são influenciados principalmente pelo solvente e pela estrutura da molécula. Os grupos cromóforos presentes em uma molécula podem ser determinados através da análise de espectrometria por ultravioleta/visível. Em contrapartida a técnica não permite afirmar sem erros a estrutura de um analito visto que diferentes analitos podem possuir os mesmos grupos cromóforos. Para a quantificação segura da concentração de um composto de interesse as condições empregadas devem garantir a relação preferencialmente linear entre a concentração do analito e a absorbância obtida na análise. A seleção do comprimento de onda na faixa de máxima absorção (máximo do pico) garante uma sensibilidade maior e o mínino desvio da lei de Beer. A concentração dos padrões de calibração deve variar dentro da faixa de concentração da amostra a ser analisada. Estes devem ser o mais parecido possível com a amostra. Em casos de matrizes complexas na qual isso não é possível, para eliminar um possível efeito de matriz e garantir a determinação correta da concentração da amostra pode ser utilizado o método de adição de padrão. Este consiste na adição de quantidades conhecidas da substância de interesse que está sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra, antes do seu preparo. A curva analítica relacionando as quantidades da substância adicionada à amostra com as respectivas absorções obtidas permite determinar a concentração da amostra (ponto onde a reta corta o eixo das ordenadas). É possível encontrar várias substâncias cuja identificação, doseamento, ensaio de pureza e/ou perfil dissolução é determinado utilizando a espectrofotometria de ultravioleta/visível. Alguns exemplos, encontrados na farmacopéia Brasileira, são: doseamento do ácido nalidíxico, albendazol, atenolol, benzoato de estradiol e indometacina; ensaio de pureza (substâncias relacionadas) do ácido acetilsalicílico e ácido benzóico. A radiação infravermelha corresponde à parte do espectro situada entre as regiões do visível e das microondas (IV próximo 14.290-4.000cm-1 , IV distante 700- 200cm-1 , maior utilidade análise orgânica 4.000-400cm-1. A frequência ou o comprimento de onde de uma absorção depende das massas relativas dos átomos, das constantes de força das ligações e da geometria dos átomos. A radiação infravermelha quando absorvida, fornece energia suficiente apenas para alterar as vibrações entre os átomos em uma molécula Deformações axiais – movimento rítmico ao longo do eixo de forma que a distância inter atômica aumente e diminua alternativamente Deformações angulares – deformações que variam o ângulo de ligação ( Ex. Deformação angular assimétrica no plano, deformação angular assimétrica fora do plano, vibração torcional) DEFORMAÇÃO AXIAL Simétrica Assimétrica Angular simétrica no plano (tesoura) DEFORMAÇÃO ANGULAR Angular simétrica fora do plano (torção) Angular assimétrica no plano (balanço) Angular assimétrica fora do plano (abano) Não são todas as moléculas que são observadas no infravermelho. Somente as vibrações que resultam em uma alteração do momento de dipolo da molécula é que absorve no IV. Uma vez que cada tipo de ligação covalente apresenta uma diferente frequência de vibração natural, então duas moléculas diferentes não deverão apresentar um idêntico comportamento de absorção no infravermelho, ou Espectro de Infravermelho Tipos de ligações detectáveis por I.V.: C – C, C – H, C – O, C – N, C – S, C – P, C = C, C = O, C = N, C = S, S = O, N = O, C = P, C≡C, C≡N, N≡O entre outras As duas áreas mais importantes para examinar o espectro de IV são as regiões de 4000 a 1300 e de 900 a 65-cm -1 A análise do processo de interação entre radiação eletromagnética e a matéria é o que chamamos de espectroscopia, e o espectro é o registro dessa interação O espectro é a impressão digital de um composto químico, uma vez que cada composto difere de outro em função da composição química, ou seja, de diferentes átomos que o formam, e também da geometria molecular. Etanol: H3CCH2OH C-H (do grupo funcional CH3) C-H (do grupo CH2), C-O, C-C, O-H (função álcool) Cadernos Temáticos de Química Nova na Escola, Espectroscopia molecular, N° 4 – Maio 2001 2800 a 3000 cm-1 (C-H) 1200 cm-1 (C-O) 3400 cm-1 (O-H) Espectrometria de Ressonância Magnética de hidrogênio (RMN) Na região de radioesfera, em uma frequência governada pelas características estruturais da molécula, esta pode absorver energia, a absorção é função de determinados núcleos da molécula. Todos os núcleos possuem carga. Em alguns casos a carga gira em torno do eixo nuclear gerando um dipolo magnético ao longo do eixo. O momento angular de carga em movimento pode ser descrito em termos de número de spin (I). Spin pode ser calculado através da massa atômica e do número atômico. Qualquer núcleo atômico que possua massa impar ou número atômico ímpar possui spin diferente de zero. Esses comportam-se como se estivessem girando e assim experimento o fenômeno do RMN. Esse número de spin mostra o número de orientações diferentes que um núcleo pode assumir. Dentre todos os elementos os mais amplamente utilizados na espectrometria de RMN são os de H e de C. Aplicações Análise estrutural de compostos orgânicos e inorgânicos Industria Farmacêutica – Controle de qualidade Estudos da estrutura (enovelamento) de proteínas e peptídeos em solução Diagnóstico por imagem Biologia molecular -Estudo de interação substrato-receptor, estruturas de membranas lipídicas, estruturas de proteínas Parâmetros importantes para elucidar o RMN de H: • Deslocamento químico • Integral • Multiplicidade do sinal Deslocamento químico Dependendo do ambiente que está o H origina diferentes posições de absorção. EX: Os quatro átomos de hidrogênio do metano, CH3, são quimicamente equivalentes. Portanto absorverão a mesma frequência de radiação. Os seis hidrogênios do etano, CH3CH3, também são quimicamente equivalentes, e absorverão a mesma frequência de radiação. Já CH3CH2CH3, não são quimicamente equivalentes, mas o hidrogênio no carbono metilênico central, está em um ambiente químico diferente que o dos carbonos metílicos. Eles irão experimentar um campo magnético total ligeiramente diferente, e irão absorver radiações com diferentes frequências. Deslocamento químico Acoplamento de Spin (multiplicidade do sinal)O elétron ligante tende a emparelhar seu spin com o spin do hidrogênio mais próximo. Quando todos os vizinhos são equivalentes vale a regra de que a multiplicidade de sinais = número de vizinhos + 1 Para entender porque o pico de metila é dividido em um trio temos: Os prótons de metileno : Há dois deles, e cada um pode ter uma de duas orientações possíveis (alinhado com ou oposição contra o campo aplicado). Integral Quantidade de H presente. Medir as integrais e multiplicar para encontrar números inteiros Ex: (0.5, 1.0 e 1.5) multiplicar por 2 temos: 1H 2H e 3H RMN de C13 Espectrometria de massas A espectrometria de massas é uma importante ferramenta de análise orgânica cujo propósito central é converter uma substância em fragmentos moleculares, mensuráveis que são indicativos da estrutura da molécula original. O conceito de espectrometria de massas é relativamente simples: Um composto é ionizado (método de ionização), os íons são separados na base da razão massa/carga (método da separação dos íons) e o número de íons que correspondem a cada unidade de massa/carga é registrado na forma de um espectro. Na técnica de impacto de elétrons, mais comumente empregada, um espectrômetro de massas bombardeia as moléculas na fase de vapor com um feixe de elétrons de alta energia e registra o resultado do impacto dos elétrons como um espectro de ions separados na base da razão massa/carga (m/z) Métodos de ionização: Ionização por impacto de elétrons : é a técnica mais utilizada na qual as moléculas da amostra são bombardeadas na fase de gás com elétrons de alta energia (70eV), que removem um elétron da molécula de amostra e produzem assim um cátion radical (íon molecular). A quebra das ligações é extensiva. As vezes essa fragmentação é tão intensa que não é possível reconhecer o íon molecular. Ionização química: Um modo de propiciar uma ionização mais branda é através da ionização química. Um gás reagente (metano, isobutano, amônia) é introduzido na fonte e ionizado. As moléculas da amostra colidem com esse gás reagente e sofrem ionização. Métodos de ionização: Ionização por dessorção: são métodos na qual a molécula passa diretamente de uma forma condensada para a fase vapor na forma de íons. (dessorção de campo, bombardeio por átomos rápidos, dessorção com plasma e dessorção com laser) Ionização por evaporação: Os íons ou moléculas neutras em solução perdem as moléculas do solvente com ionização simultânea. Nebulização por elétrons: A amostra entra em um capilar de aço inoxidável na qual é mantido com uma diferença de potencial. Com a evaporação do solvente, as gotículas do aerossol diminuem de volume, concentrando os íons da amostra. Isso gera uma repulsão eletrostática e ocorre a “explosão columbica” que libera os íons para a fase de vapor. Analisadores de Massa: Setores Magnéticos: esses usam um campo magnético para desviar íons em movimento para uma trajetória curva. Os íons mais leves desviam-se mais do que os mais pesados. . Quadrupolo: é formado por quatro tubos cilíndricos paralelos na qual é aplicado uma voltagem. Os íons entram em um túnel formado por esses cilindros e dependendo da voltagem aplicada apenas íons com um certo valor de m/z possuem uma trajetória estável e são capazes de atravessar o quadrupolo até o fim. Analisadores de Massa: Captura de íons: nesse é possível “prender” íons. E assim quebrar esses íons em outros íons filhos. Tempo de voo (TOF): Os íons são acelerados por um potencial e passam por um tubo até o detector. Cada íons tem uma razão m/z diferente e assim chegam em tempos diferentes ao detector. A análise térmica é definida como "grupo de técnicas por meio das quais uma propriedade física de uma substância e/ou de seus produtos de reação é medida em função da temperatura e/ou tempo, enquanto essa substância é submetida a um programa controlado de temperatura e sob uma atmosfera específica" Análise Térmica http://dx.doi.org/10.1590/S1516-93322007000300004 A análise térmica tem sido utilizada na área farmacêutica como ferramenta útil para avaliar rapidamente uma possível interação entre os componentes ativos e os excipientes em estudos de compatibilidade na pré-formulação (Rodante et al., 2002), além de avaliar a existência de polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas, determinação de pureza química, estudos de reações no estado sólido, análise de formas farmacêuticas sólidas e controle de qualidade (Canotilho et al., 1992; Gupchup et al, 1992; Cordella et al., 2002; Lambi et al., 2003; Tomassetti et al., 2005). Determinação de pureza Caracterização de lipídeos e gorduras Tempo de prateleira Umidade Estabilidade termo oxidativa Interação entre compostos ativos Aparência das cápsulas cápsulas Estudos de liofilização Berna et al. 2003 A TGA fornece informações com relação às variações de massa em função do tempo e/ou temperatura sob determinadas condições atmosféricas. A medida das variações é realizada com uma termo balança. Termogavimetria (TGA) I) Não ocorre variação de massa II) Rápida perda inicial (dessorção de gases) III) Decomposição em um estágio IV) Decomposição em vários estágios V) Decomposição em vários estágios VI) Ganho de massa (oxidação de metal) VII) Difícil de ser observada (ganho de massa e posterior decomposição) Variações que podem ocorrer: evaporação, sublimação, decomposição, oxidação, redução, adsorção e desorção de gás Utilizando apenas a TG é possível, por exemplo: decomposição térmica de compostos orgânicos, inorgânicos e de substâncias poliméricas; a corrosão de metais em várias atmosferas em temperaturas elevadas; reações no estado sólido; aquecimento e calcinação de minerais; destilação e evaporação de líquidos; pirólise de carvão, petróleo e madeira; determinação de hidratação, volatilização e conteúdo de cinza; determinar a velocidade de evaporação e sublimação, desidratação e higroscopicidade; degradação térmica oxidativa de polímeros; decomposição de material explosivo; estudos de cinética de reação, descoberta de novos compostos químicos, assim como determinações de pressão de vapor e calor de vaporização (Wendlandt, 1986; Haines, 1995; Matos, Machado, 2004). DTG: derivada em função da curva para que esta possa ser melhor interpretada. Nesta, os "degraus" (variações de massa da curva TG) são substituídos por picos que determinam áreas proporcionais às variações de massa. A curva DTG permite: a partir da altura do pico, à qualquer temperatura, • obter a razão de Dm (variação de massa) naquela temperatura; • obter as temperaturas correspondentes ao início e final da reação com maior exatidão, • calcular a Dm no caso de sobreposição de reações Análise Térmica Diferencial (DTA) Na DTA é registrado a variação de temperatura em uma amostra e em um padrão (amostra referência), a medida que ambos são submetidos ao mesmo ciclo térmico. Evento endotérmico: Ex Fusão A temperatura é medida por termopares (dispositivos elétricos utilizados para determinar a temperatura) conectados aos suportes metálicos das cápsulas de amostra e do material de referência, ambos contidos no mesmo forno. As variações de temperatura na amostra são devidas às transições entálpicas ou reações endotérmicas ou exotérmicas. As curvas DTA representam os registros de D em função da temperatura (T) ou do tempo (t), de modo que os eventos são apresentados na forma de picos. Os picos ascendentes caracterizam os eventos exotérmicos e os descendentes os endotérmicos Na Calorimetria Exploratório diferencial (DSC) ocorreuma compensação térmica na qual é corrigida a temperatura da amostra no momento de um evento térmico. Os eventos térmicos da amostra são então interpretados como os desvios da linha de base (eventos endotérmicos e exotérmicos). Para que isso seja possível o material de referência não pode reagir com os componentes do equipamento (cadinho, termopares, etc), não pode apresentar evento térmico na faixa de temperatura estudada e precisa apresentar condutividade e capacidade térmica semelhante a amostra. Calorimetria Exploratório (varredura) diferencial (DSC) Existem duas configurações possíveis para aparelhos de DSC, DSC com compensação de potência: a amostra e o material de referência são aquecidos em compartimentos separados em condições isotérmicas e submetidos à igual variação de potência de entrada no forno. Neste caso, os eventos são apresentados na curva DSC como picos, os ascendentes correspondem a processos endotérmicos e os descendentes a exotérmicos. DSC com fluxo de calor : a amostra e o material de referência são colocados em cápsulas idênticas, localizadas sobre o disco termoelétrico e aquecidas por uma única fonte de calor. As curvas DSC obtidas nesse sistema mostram picos ascendentes que caracterizam eventos exotérmicos, enquanto os descendentes eventos endotérmicos É importante a associação de dados provenientes dos ensaios de TG/DTG e DSC, para melhor caracterização de materiais, visto que a TG/DTG indica eventos térmicos relacionados a variações de massa, enquanto a DSC detecta eventos associados ou não à perda de massa. Por exemplo, eventos térmicos de origem física, como mudança de estado físico (fusão), podem ser inequivocamente atribuídos a partir da curva DSC, desde que na mesma faixa de temperatura não forem observados, nas curvas TG/DTG, eventos de perda de massa. Para melhor interpretação dos resultados e evitar possíveis equívocos é imprescindível a comparação das curvas TG/DTG e DSC obtidas nas mesmas condições experimentais
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