Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)


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Profa. Dra. Milena Araújo Tonon
Turma Farmácia- 4º Termo
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
A CLAE utiliza equipamentos que podem ser totalmente automatizados.
É um tipo de cromatografia líquida que emprega colunas recheadas com materiais
especialmente preparados e uma fase móvel
A CLAE é a evolução da Coluna Clássica
A CLAE permite menor tempo de análise, maior quantificação, maior
detectabilidade, versatilidade e automatização
CCC \u2013 FM arrastada pela gravidade
CLAE \u2013 A FE possui partículas menores, assim, se faz necessário o uso de uma
bomba de alta pressão para a eluição da FM
A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta
reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.
Bomba
Fase Móvel
Pura, livre de partículas e gases,
Solubilizar a amostra
FM: Não degradar nem dissolver a FE
Baixa viscosidade
Compatível com o detector usado
Injetor
Loop 50uL, 25uL
\u2022 Manual
\u2022 Automático
Coluna
A coluna é constituida por um pedaço de tubo de material inerte (aço inoxidável,
plástico duro, vidro)
O tamanho da partícula é muito importante em CLAE porque controla o processo
de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partícula.
Parâmetros importantes na avaliação da separação
\u2022Tempo de retenção do composto não retido (tm) ou (to ): eluiu sem interagir com nada
\u2022Fator de retenção (k) = (tr1 \u2013 to ) / to
\u2022Fator de separação (\u3b1 )= razão entre os fatores de retenção de dois picos
\u2022Resolução (R) = mede a eficiência da separação
\u2022Número de pratos : Eficiência da separação
\u2022Fator de assimetria : simetria do pico
Análise Qualitativa e Quantitativa
t0 = tempo do composto não retido 
Fator de retenção (k)
K(A) = (3,3-0,6)/0,6
K(B) = (7,3-0,6)/0,6
Fator de separação (\u3b1 )
\u3b1 = K(B) / K(A)
Análise Qualitativa e Quantitativa
Resolução (R)
R = 2 (( tr2 \u2013 tr1 )/ (w1 + w2))
tr2
tr1
Para medir a largura traçar antes a 
melhor reta!!!!!!!!
ERRADO
CERTO!!!!!
Análise Qualitativa e Quantitativa
Através da construção da curva de calibração é possível determinar as
concentrações dos analitos estudados.
A curva correlaciona a resposta que é observada frente a diferentes
concentrações. Desta forma, depois de determinada a curva, é possível
calcular a concentração de uma amostra através dessa proporção.
Cromatografia Gasosa (CG)
FM: gás de arraste. Vazão reprodutível. Inerte, puro e de baixo custo. Ex. 
Nitrogênio, hélio, hidrogênio
Injetor: aquecido para que a amostra seja prontamente volatilizada
Coluna : recheada ou capilar
As colunas capilares possuem maior eficiência por terem maior 
comprimento, análises mais rápidas
A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás 
adequado denominado de fase móvel ( FM) ou gás de arraste
Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa pela coluna 
contendo a fase estacionária FE (coluna cromatográfica), onde 
ocorre a separação da mistura
As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas no gás de arraste e 
passam por um detector
Estrutura do composto
Fase estacionária
Temperatura da coluna
Separação
A cromatografia gasosa é utilizada em análise de álcool
em sangue, em essências e fragrâncias, análise de
pesticidas, solventes, fármacos.
A separação ocorre devido a interação diferencial do 
soluto com a fase estacionária e sua volatilidade
A fase móvel é inerte e não interage com a amostra
CG permite apenas a análise de amostras cujos 
constituintes sejam voláteis e termicamente estáveis 
porque a análise é realizada em temperaturas altas
Uma alternativa para esse problema é a Derivação. A derivação consiste
em uma reação química utilizada com a finalidade de:
- Aumentar a volatilidade do soluto
- Aumentar a estabilidade térmica do soluto
- Melhorar a resposta do soluto para certos detectores
- Melhorar a separação do soluto de interesse de outros da amostra
- Ex: Derivação por sililação - o derivado formado é menos polar, mais
volátil e mais termicamente estável