Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

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Profa. Dra. Milena Araújo Tonon

Turma Farmácia- 4º Termo

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

High Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

A CLAE utiliza equipamentos que podem ser totalmente automatizados.

É um tipo de cromatografia líquida que emprega colunas recheadas com materiais

especialmente preparados e uma fase móvel

A CLAE é a evolução da Coluna Clássica

A CLAE permite menor tempo de análise, maior quantificação, maior

detectabilidade, versatilidade e automatização

CCC – FM arrastada pela gravidade

CLAE – A FE possui partículas menores, assim, se faz necessário o uso de uma

bomba de alta pressão para a eluição da FM

A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta

reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.

Bomba

Fase Móvel

Pura, livre de partículas e gases,

Solubilizar a amostra

FM: Não degradar nem dissolver a FE

Baixa viscosidade

Compatível com o detector usado

Injetor

Loop 50uL, 25uL

• Manual
• Automático

Coluna

A coluna é constituida por um pedaço de tubo de material inerte (aço inoxidável,

plástico duro, vidro)

O tamanho da partícula é muito importante em CLAE porque controla o processo

de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partícula.

Parâmetros importantes na avaliação da separação

•Tempo de retenção do composto não retido (tm) ou (to ): eluiu sem interagir com nada

•Fator de retenção (k) = (tr1 – to ) / to

•Fator de separação (α )= razão entre os fatores de retenção de dois picos

•Resolução (R) = mede a eficiência da separação

•Número de pratos : Eficiência da separação

•Fator de assimetria : simetria do pico

Análise Qualitativa e Quantitativa

t0 = tempo do composto não retido

Fator de retenção (k)

K(A) = (3,3-0,6)/0,6

K(B) = (7,3-0,6)/0,6

Fator de separação (α )

α = K(B) / K(A)

Análise Qualitativa e Quantitativa

Resolução (R)

R = 2 (( tr2 – tr1 )/ (w1 + w2))

tr2

tr1

Para medir a largura traçar antes a

melhor reta!!!!!!!!

ERRADO

CERTO!!!!!

Análise Qualitativa e Quantitativa

Através da construção da curva de calibração é possível determinar as

concentrações dos analitos estudados.

A curva correlaciona a resposta que é observada frente a diferentes

concentrações. Desta forma, depois de determinada a curva, é possível

calcular a concentração de uma amostra através dessa proporção.

Cromatografia Gasosa (CG)

FM: gás de arraste. Vazão reprodutível. Inerte, puro e de baixo custo. Ex.

Nitrogênio, hélio, hidrogênio

Injetor: aquecido para que a amostra seja prontamente volatilizada

Coluna : recheada ou capilar

As colunas capilares possuem maior eficiência por terem maior

comprimento, análises mais rápidas

A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás

adequado denominado de fase móvel ( FM) ou gás de arraste

Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa pela coluna

contendo a fase estacionária FE (coluna cromatográfica), onde

ocorre a separação da mistura

As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas no gás de arraste e

passam por um detector

Estrutura do composto

Fase estacionária

Temperatura da coluna

Separação

A cromatografia gasosa é utilizada em análise de álcool

em sangue, em essências e fragrâncias, análise de

pesticidas, solventes, fármacos.

A separação ocorre devido a interação diferencial do

soluto com a fase estacionária e sua volatilidade

A fase móvel é inerte e não interage com a amostra

CG permite apenas a análise de amostras cujos

constituintes sejam voláteis e termicamente estáveis

porque a análise é realizada em temperaturas altas

Uma alternativa para esse problema é a Derivação. A derivação consiste

em uma reação química utilizada com a finalidade de:

- Aumentar a volatilidade do soluto

- Aumentar a estabilidade térmica do soluto

- Melhorar a resposta do soluto para certos detectores

- Melhorar a separação do soluto de interesse de outros da amostra

- Ex: Derivação por sililação - o derivado formado é menos polar, mais

volátil e mais termicamente estável