O Arroz na Era da Genômica

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Dissertação de mestrado 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
1.1 – O Arroz (Oryza sativa L.) 
 
1.1.1 – Origem e importância do arroz 
 
Diversos historiadores e cientistas apontam o sudeste da Ásia como o 
local de origem do arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). Os dados que 
culminaram em tal conclusão foram, inicialmente, publicados por NAKAGAHRA e 
HAYASHI, em 1977. Neste trabalho, análises sobre variações nos genótipos de 
isoenzimas em variedades nativas de arroz 
mostraram que o centro da diversidade 
genética encontrava-se na área de Assam, na 
Índia, e Yunnan, na China (NAKAGAHRA e 
HAYASHI, 1977). A figura ao lado ilustra a 
origem e a possível rota de difusão dos 
diferentes tipos de arroz presentes na Ásia, 
baseado na Teoria Centro do Gene. Porém, 
bem antes de qualquer evidência histórica, o 
arroz foi, provavelmente, o principal alimento e a primeira planta cultivada na Ásia. 
As mais antigas referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca 
de 5.000 anos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). 
National Institute of Crop Science 
(http://www.nics.go.kr/english/eng_index.htm) 
Alguns autores apontam o Brasil como o primeiro país a cultivar esse 
cereal no continente americano. Consta que integrantes da expedição de Pedro 
Álvares Cabral, após uma peregrinação por cerca de 5 km em solo brasileiro, 
traziam consigo amostras de arroz, confirmando registros de Américo Vespúcio que 
trazem referência a esse cereal em grandes áreas alagadas do Amazonas. A prática 
da rizicultura no Brasil, de forma organizada e racional, aconteceu em meados do 
século XVIII e daquela época até a metade do século XIX, o país foi um grande 
exportador de arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). 
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Atualmente, o arroz constitui uma das mais importantes culturas do 
mundo, sendo a fonte primária de alimento para mais da metade da população 
mundial. Para tanto, a rizicultura ocupa, anualmente, cerca de 154 milhões de 
hectares, o que corresponde a 11% das terras cultivadas no mundo. Mais de 90% de 
todo o arroz produzido no mundo é crescido e consumido na Ásia, onde vive 60% da 
população do planeta (KHUSH, 2005). 
De acordo com as estimativas da Organização das Nações Unidas (ONU), 
a população mundial passará de 6 bilhões em 2000 para 8 bilhões em 2025 (KHUSH, 
2005). Com o aumento populacional, a produção de arroz deverá aumentar 40% até 
2030 para satisfazer a crescente demanda dos países consumidores do grão. Para 
que seja alcançado o objetivo de produzir mais arroz, é necessária a obtenção de 
variedades com um maior potencial de rendimento e melhor estabilidade do 
rendimento. Em prol disso, várias estratégias têm sido empregadas, incluindo 
hibridação convencional e procedimentos de seleção, criação de ideotipos, criação 
de híbridos, e engenharia genética (KHUSH, 2005). 
 
 
1.1.2 – O arroz na era da genômica 
 
O início do século XXI marca a era da genômica funcional. Este evento é 
devido, principalmente, ao enorme fluxo de informação gerado pela decodificação do 
genoma de muitos organismos de vida livre (BERNAL et al., 2001). Haemophilus 
influenzae foi o primeiro organismo cujo genoma foi completamente seqüenciado, 
em 1995 (FLEISCHMANN et al., 1995). O impressionante progresso nessa área levou 
Philip H. Abelson a chamar a genômica – a análise da estrutura do genoma e da 
função do gene no contexto do conjunto genético completo de um organismo – de “a 
terceira revolução tecnológica” (ABELSON, 1998). Até o início de 2006, o 
seqüenciamento dos genomas de 216 organismos já havido sido concluído e 
publicado, e outros 965 genomas completos estavam a caminho, sendo 524 de 
organismos procariotos e 441 de eucariotos (AGRAWAL e RAKWAL, 2006). 
O primeiro “rascunho” da seqüência do genoma do arroz foi anunciado 
pela gigante empresa agrícola Monsanto em 2000 (BARRY, 2001). Em 2002, outra 
conquista notável foi a conclusão das “seqüências-rascunho” do genoma de dois dos 
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principais cultivares de arroz, o cultivar Nipponbare, do tipo japonica (GOFF et al., 
2002) e o cultivar 93-11, do tipo indica (YU et al., 2002). 
O completo seqüenciamento do genoma do arroz foi concluído no ano de 
2005 (INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT, 2005), e a partir do 
número total de loci expressos e clones de cDNAs inteiros (FL-cDNA) não mapeados 
foi estimado que o número de genes de arroz seria de, aproximadamente, 32.000 
(RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Entre esses genes, 28.540 são candidatos a 
genes que codificam para proteínas. Cerca de 25% (7.189 loci) das potenciais 
regiões abertas de leitura (ORFs), tiveram suas funções designadas por buscas 
através de BLASTX (RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Porém abordagens 
adicionais são necessárias para a elucidação das funções dos genes 
remanescentes (NAKAMURA et al., 2007). 
Com o intuito de acelerar a identificação e a caracterização dos genes de 
arroz com funções até agora desconhecidas, vários recursos têm sido produzidos 
(LIN et al., 1998; EBITANI et al., 2005). A infra-estrutura para as análises de 
bioinformática em arroz (revisada por SASAKI et al., 2005), incluindo bancos de 
dados integrados como RAP-DB (TANAKA et al., 2008; OHYANAGI et al., 2006; RICE 
ANNOTATION PROJECT, 2007), TIGR Rice Genome Annotation Database (OUYANG et 
al., 2007), BGI-RIS (ZHAO et al., 2004) e MOsDB (KARLOWSKI et al., 2003), tem sido 
continuamente desenvolvida e tais ferramentas encontram-se publicamente 
disponíveis. Os FL-cDNAs, agrupados em 28.469 clones não-redundantes (RICE 
FULL-LENGTH CDNA CONSORTIUM, 2003), e o banco de dados de proteômica em 
arroz (KOMATSU, 2005) também apresentam grande potencial para promover a 
descoberta e a elucidação da função gênica (NAKAMURA et al., 2007). 
A quantidade de informação gerada a partir destes recursos, 
inevitavelmente, levará a um ritmo sem precedentes (e eficiente) na análise e 
dedução da função gênica em um curto período de tempo, no nível de transcrito 
(transcriptômica: análise paralela da expressão do gene), proteína (proteômica: 
análise do polipeptídeo complementar), e metabólito (metabolômica: análise paralela 
dos metabólitos primários e secundários), que são os pilares integrais da genômica 
funcional (AGRAWAL e RAKWAL, 2006). 
 
 
 
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1.2 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em 
plantas 
 
 
1.2.1 – Estresses abióticos 
 
Estresses abióticos, tais como seca, salinidade, temperaturas extremas, 
toxicidade química e estresse oxidativo, desencadeiam uma série de mudanças 
moleculares, bioquímicas, fisiológicas e morfológicas que afetam negativamente o 
crescimento e a produtividade das plantas (WANG et al., 2001). Por esse motivo, este 
tipo de estresse ambiental é considerado grande ameaça para agricultura (GAO et 
al., 2007), sendo responsável por reduzir em até 50% os rendimentos anuais 
(BOYER, 1982; BRAY et al., 2000). Porém, durante a evolução, as plantas 
desenvolveram sofisticados mecanismos para perceber sutis mudanças nas 
condições de crescimento e desencadear respostas necessárias para sua 
adaptação às diversas condições ambientais (GAO et al., 2007). 
Seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo estão 
geralmente interconectados, e devem induzir danos celulares similares. Por 
exemplo, seca e/ou salinização são manifestados, inicialmente, como estresse 
osmótico, resultando na interrupção da homeostase e da distribuiçãoiônica na célula 
(SERRANO et al., 1999; ZHU, 2001a). O estresse oxidativo, que freqüentemente está 
associado aos estresses de alta temperatura, salinidade ou seca, deve causar 
desnaturação de proteínas funcionais e estruturais (SMIRNOFF, 1998). 
Conseqüentemente, esses diversos estresses ambientais ativam vias de sinalização 
e respostas celulares similares (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000; KNIGHT e 
KNIGHT, 2001; ZHU, 2001b; ZHU, 2002), tais como a produção de proteínas de 
estresse, indução de antioxidantes e acúmulo de solutos compatíveis (VIERLING e 
KIMPEL, 1992; ZHU et al., 1997; CUSHMAN e BOHNERT, 2000). A figura 1 ilustra a 
complexa resposta da planta ao estresse abiótico, que envolve muitos genes e 
mecanismos bioquímicos e moleculares. Os mecanismos de controle molecular da 
tolerância ao estresse abiótico são baseados na ativação e regulação de genes 
específicos relacionados ao estresse (WANG et al., 2003). Esses genes englobam 
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três principais categorias: (1) genes envolvidos nas cascatas de sinalização, tais 
como MYC, MAP kinases e SOS kinase (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997; 
MUNNIK et al., 1999; ZHU, 2001b), fosfolipases (CHAPMAN, 1998; FRANK et al., 2000), 
e fatores de transcrição como HSF, e as famílias CBF/DREB e ABF/ABAE 
(STOCHINGER et al., 1997; SCHÖFFL et al., 1998; CHOI et al., 2000; SHINOZAKI e 
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000); (2) genes que funcionam diretamente na proteção de 
membranas e proteínas, como proteínas heatshock (HSPs) e chaperonas, proteínas 
LEA (late embryogenesis abundant) (VIERLING, 1991; INGRAM e BARTELS, 1996; 
THOMASHOW, 1998; THOMASHOW, 1999; BRAY et al., 2000), osmoprotetores, e 
removedores de radicais livres (BOHNERT e SHEVELEVA 1998); e (3) genes envolvidos 
na absorção e transporte de água e íons, como aquaporinas e transportadores de 
íons (MAUREL, 1997; SERRANO et al., 1999; TYERMAN et al., 1999; ZIMMERMANN e 
SENTENAC, 1999; BLUMWALD, 2000). 
Portanto, para manter o crescimento e a produtividade, as plantas devem 
adaptar-se às condições do estresse ativando mecanismos específicos de 
tolerância. Dessa forma, a modificação de plantas visando aumentar a tolerância 
está baseada, principalmente, na manipulação desses genes, que protegem e 
mantêm a função e a estrutura dos componentes celulares (WANG et al., 2003). 
 
1.2.2 – Estresses bióticos 
 
Estresses bióticos podem ser causados por uma vasta gama de potenciais 
patógenos. Fungos, bactérias, nematódeos e insetos interceptam os produtos da 
fotossíntese produzidos pelas plantas, e os vírus utilizam a maquinaria de replicação 
a custo do hospedeiro. Porém ao longo da evolução, as plantas desenvolveram 
sofisticados mecanismos para perceber tais ataques, e traduzir essa percepção em 
uma resposta adaptativa (DANGL e JONES, 2001). 
 
 
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Transporte de água e 
íons (aquaporinas e 
transportadores de íons)
Função chaperonas
(Hsp, SP1, LEA, COR)
Osmoproteção
(prolina, glicina-
betaína)
Detoxificação
(SOD, PX)
Controle da 
transcrição
Detecção, percepção e 
transdução de sinal
Osmossensores, Enzimas de clivagem de 
fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP 
kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases
dependentes de cálcio.
Estresse secundário
Estresse osmótico
Estresse oxidativo
Seca
Frio
Salinidade
Calor
Poluentes
químicos
Rompimento da 
homeostase iônica e 
osmótica; danificação 
de proteínas 
funcionais e 
estruturais e 
membranas
Fatores de transcrição
(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Ativação de genes
Re-estabelecimento da homeostase celular, 
proteção estrutural e funcional de proteínas e 
membranas
Tolerância ao estresse ou Resistência
Mecanismos de 
resposta a estresse Transporte de água e 
íons (aquaporinas e 
transportadores de íons)
Função chaperonas
(Hsp, SP1, LEA, COR)
Osmoproteção
(prolina, glicina-
betaína)
Detoxificação
(SOD, PX)
Controle da 
transcrição
Detecção, percepção e 
transdução de sinal
Osmossensores, Enzimas de clivagem de 
fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP 
kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases
dependentes de cálcio.
Osmossensores, Enzimas de clivagem de 
fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP 
kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases
dependentes de cálcio.
Estresse secundário
Estresse osmótico
Estresse oxidativo
Estresse secundário
Estresse osmótico
Estresse oxidativo
Seca
Frio
Salinidade
Calor
Poluentes
químicos
Rompimento da 
homeostase iônica e 
osmótica; danificação 
de proteínas 
funcionais e 
estruturais e 
membranas
Fatores de transcrição
(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Fatores de transcrição
(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Ativação de genesAtivação de genes
Re-estabelecimento da homeostase celular, 
proteção estrutural e funcional de proteínas e 
membranas
Tolerância ao estresse ou Resistência
Mecanismos de 
resposta a estresse
 
 
Figura 1. A complexidade da resposta da planta ao estresse abiótico. Estresses 
primários, como seca, salinidade, frio, calor e poluição química, estão normalmente 
interconectados, e causam dano celular e estresses secundários, como estresse oxidativo e 
osmótico. Os sinais iniciais de estresse (por exemplo, efeitos osmóticos e iônicos, e 
mudanças na fluidez da membrana) disparam um processo de sinalização em cadeia e 
controles de transcrição que ativam mecanismos de resposta ao estresse a fim de 
restabelecer a homeostase e proteger e reparar proteínas e membranas defeituosas. Uma 
resposta inadequada a um ou muitos passos na sinalização e ativação do gene deve 
resultar em mudanças irreversíveis de homeostase celular e na destruição de proteínas 
funcionais e estruturais, e membranas, levando a morte celular. Adaptação de WANG et al., 
2003. 
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A percepção envolve a detecção de moléculas do patógeno ou, algumas 
vezes, da própria planta ferida. Essas moléculas, chamadas elicitores, são divididas 
em dois grupos. O primeiro grupo corresponde aos elicitores intrínsecos do 
organismo invasor, tais como os fragmentos de chitina da parede celular de fungos 
ou a proteína flagelina que compõem a cauda flagelar de bactérias. Receptores para 
esse tipo de elicitores estão presentes na membrana plasmática das plantas. O 
segundo grupo corresponde aos produtos, geralmente proteínas, que são 
codificadas por genes de avirulência (Avr) do patógeno. Esses produtos podem ser 
secretados no espaço intercelular ou injetados diretamente na célula via um sistema 
de secreção do tipo-III. Eles são reconhecidos por plantas que expressam o 
correspondente gene de resistência a doença (gene R) (PECK, 2003). 
Muitos dos mecanismos de defesa são ativados dentro de minutos após a 
percepção e funcionam para matar o patógeno ou limitar sua dispersão na planta 
(DANGL e JONES, 2001). A morte celular programada no local da invasão é um 
mecanismo comum de defesa contra patógenos biotróficos e insetos sugadores, que 
dependem de células vivas do hospedeiro para obter nutrientes. No entanto, a morte 
celular é um pré-requisito para o crescimento de patógenos necróficos, uma vez que 
estes se alimentam de tecidos mortos. É, portanto, essencial que as plantas ativem 
a resposta de defesa apropriada de acordo com o tipo de patógeno (SPOEL e DONG, 
2008). Nesse contexto, a resistência mediada por ácido salicílico (SA) é efetiva 
contra biotrófos, enquanto respostas mediadas por ácido jasmônico (JA) ouetileno 
(ET) são predominantemente contra necrótrofos ou insetos herbívoros (GLAZEBROOK, 
2005). 
De forma intrigante, alguns patógenos são capazes de induzir múltiplas 
moléculas sinalizadoras e fitormônios. Em tais casos, a comunicação entre essas 
vias de sinalização permite que a planta priorize a resposta de defesa em detrimento 
de suas funções celulares normais (SPOEL e DONG, 2008). Como uma estratégia de 
virulência, muitos patógenos desenvolveram mecanismos que mimetizam hormônios 
e interferem na resposta imune do hospedeiro. As plantas, por sua vez, utilizam a 
comunicação das vias como um mecanismo direto de defesa contra a perturbação, 
desencadeada pelo patógeno, na sinalização hormonal (SPOEL e DONG, 2008). 
Diversos estudos demonstraram que os fitormônios, tais como SA, JA, ET 
e ácido abscísico (ABA), que são moléculas endógenas de baixo peso molecular, 
participam na resposta contra ambos os estresses ambientais através de ações 
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sinérgicas e antagônicas, sugerindo uma comunicação cruzada entre as vias de 
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (BOSTOCK, 2005; LORENZO e SOLANO, 
2005; MAUCH-MANI e MAUCH, 2005). Adicionalmente, diversos resultados de análises 
de transcriptoma em larga-escala utilizando a tecnologia de microarray de DNA 
suportam, fortemente, a existência de uma comunicação cruzada entre as vias de 
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (SCHENK et al., 2000; CHEONG et al., 
2002; SEKI et al., 2002; NARUSAKA et al., 2003; DAVLETOVA et al., 2005). Nos dois 
tipos de estresse ambiental, conjuntos de genes diferentes, porém sobrepostos, são 
regulados. Dessa forma, as elaboradas vias de sinalização, com freqüentes pontos 
de intersecção, permitem que as plantas regulem tanto a tolerância a estresses 
bióticos quanto a resistência a doenças (FUJITA et al., 2006). A figura 2 ilustra os 
pontos de convergência molecular entre as vias de sinalização dos estresses 
bióticos e abióticos (FUJITA et al., 2006). 
 
1.3 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em 
arroz 
 
O arroz carrega características únicas de tolerâncias e susceptibilidades a 
estresses abióticos quando comparados a outras culturas. O arroz é capaz de tolerar 
solos encharcados e submersão em níveis que matariam outras culturas, é 
moderadamente tolerante a salinidade e à acidez do solo, mas é altamente sensível 
à seca e frio. Muito embora a resposta do arroz ao estresse seja superior à resposta 
de outras culturas, contudo, muitos ambientes onde o arroz é cultivado demandam 
ainda maiores níveis de tolerância que aqueles encontrados na maioria dos 
germoplasmas (LAFITTE et al., 2004). Em regiões tropicais, o arroz é cultivado em 
climas de monção, estando sujeito à submersão intermitente, seca e, em regiões 
costeiras, salinidade. O arroz também é crescido nos trópicos, durante a estação 
seca, onde a adequada irrigação está disponível, e a cultura fica exposta às baixas 
temperaturas na germinação e altas temperaturas na época de floração. Nas regiões 
temperadas, onde virtualmente todo o arroz é irrigado, a baixa temperatura é o 
principal estresse abiótico que afeta a produção (LAFITTE et al., 2004). Já nos solos 
não irrigados nos trópicos úmidos, a cultura é afetada pelo déficit de água, acidez do 
solo, e deficiência de fósforo, nitrogênio e zinco (WHITE e ZASOSKI, 1999). 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 8
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Figura 2. Pontos de convergência nas vias de sinalização dos estresses 
bióticos e abióticos. O esquema simplificado ilustra as vias de sinalização 
desencadeadas pelos estresses abióticos e bióticos, bem como os pontos de 
comunicação entre estas vias. Tal comunicação permite que a planta regule 
tanto a tolerância a estresse quanto a resistência a doenças. Figura adaptada de 
FUJITA et al., 2006. 
 
 
 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 9
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Os conhecimentos acerca de como os genes de arroz respondem às 
condições adversas vêm aumentando diariamente. Muitos estudos relataram 
mudanças na expressão de genes individuais quando o arroz é desafiado tanto por 
estresses bióticos quanto abióticos (LAFITTE et al., 2004). Tais mudanças incluem a 
regulação de diversos genes, como MAP kinases (AGRAWAL et al., 2003), genes 
DREB (DUBOUZET et al., 2003), proteína-kinase dependente de cálcio (SAIJO et al., 
2001), uma endo-1,3-beta-glucanase (AKIYAMA e PILLAI, 2001), um fator de 
elongação da tradução (LI ZI e CHEN SHOU, 1999) e glutathiona redutase (KAMINAKA 
et al., 1998). Estudos de transformação demonstraram que alterando a expressão de 
diferentes genes de distintas vias a resposta do arroz ao déficit de água e 
desidratação pode ser afetada. Tais genes incluem aqueles associados com 
diversas funções, tais como absorção de água (aquaporinas) (MARTRE et al., 2002), 
sinalização (kinases) (SAIJO et al., 2001; LIU et al., 2003), integridade da membrana 
(proteínas LEA) (XU et al., 1996; ROHILA et al., 2002; BABU et al., 2004), e 
metabolismo de carboidrato (TPS) (JANG et al., 2003). Adicionalmente, evidências 
que se acumularam ao longo da última década mostraram que o arroz, assim como 
outras plantas, sintetiza lectina(s) em resposta a situações de estresse como seca, 
alta concentração de sal, ferimento, ou tratamento com alguns fitormônios (VAN 
DAMME et al., 2008). 
 
 
1.4 – O gene salT e a proteína SALT 
 
 
Em 1990, CLAES e colaboradores identificaram e caracterizaram o gene 
salT, bem como seu produto, a proteína SALT. Nesta ocasião, a SALT, uma proteína 
de 145 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico (pI) de 5.5 (CLAES et al., 1990), e 
peso molecular de 14,5 kDa (CLAES et al., 1990; BRANCO et al., 2004), foi 
caracterizada como uma proteína induzida por estresse salino em arroz (CLAES et 
al., 1990). Posteriormente, foi demonstrado que a expressão desta proteína não está 
restrita a resposta a estresses ambientais, sugerindo, desta forma, sua participação 
num mecanismo global de resposta da planta (DE SOUZA FILHO et al., 2003). 
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Evidências bioquímicas demonstraram, ainda, que a proteína SALT exibe 
atividade lectina de ligação à mannose. Adicionalmente, foi mostrado que a atividade 
lectina é dependente de uma associação não-covalente de dois monômeros de 14,5 
kDa (HIRANO et al., 2000; ZHANG et al., 2000). Por se tratar de uma lectina com 
apenas um único domínio Jacalina, a proteína SALT pode ser considerada uma 
hololectina (lectinas que contém apenas domínios de ligação ao carboidrato), mais 
especificamente uma merolectina – lectinas compostas de um único domínio (VAN 
DAMME et al., 2008), como mostra a figura 3. 
Microarrays de DNA constituem uma das mais poderosas ferramentas 
para analisar rapidamente a expressão gênica sob diversas condições ambientais, 
bem como em diferentes tecidos de uma planta (SUDO et al., 2008). Com o início dos 
projetos de seqüenciamento do arroz, surgiram diversos projetos de microarrays em 
arroz e, até 2004, mais de 600 experimentos em 25 condições fisiológicas já haviam 
sido realizados (TYAGI et al., 2004). 
A proteômica, outra ferramenta de extrema importância, tornou-se uma 
metodologia essencial para a análise em larga-escala de proteínas em muitos 
campos da biologia de plantas (PANDEY e MANN, 2000). Assim, combinada à 
disponibilidade de dados de seqüências do genoma, ela tem aberto enormes 
possibilidades para identificar o grupototal de proteínas expressas, assim como 
mudanças no perfil de expressão, durante o crescimento e desenvolvimento e em 
resposta a estímulos bióticos e abióticos (YANG et al., 2005). Neste contexto, 
diversos trabalhos têm se dedicado à construção de proteomas e caracterização 
funcional das proteínas expressas em arroz, seja em tecidos, tais como 
folha,embrião, endosperma, raiz, caule, broto e calos (KOMATSU et al., 1993; ZHONG 
et al., 1997; KOMATSU et al., 1999a,b; TSUGITA et al., 1994; SHEN et al., 2002; IMIN et 
al., 2001; KOLLER et al., 2002; TANAKA et al., 2004a), ou em organelas, como 
complexo de Golgi, mitocôndria, e outros compartimentos celulares (MIKAMI et al., 
2001; HEAZLEWOOD et al., 2003; TANAKA et al., 2004b). 
A expressão do gene salT e o acúmulo da proteína SALT puderam ser 
detectados em inúmeros destes trabalhos, tanto naqueles de análise de microarray e 
northern blotting, quanto nos de estudos proteômicos e western blotting, que 
analisaram diversos cultivares de arroz sob diferentes condições fisiológicas e entre 
diferentes tecidos. Sendo assim, a tabela 1 se refere aos trabalhos encontrados, 
bem como os estresses e condições de cultivos, onde houve a expressão do gene 
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Figura 3. Ilustração da lectina SALT e seu domínio Jacalina. O esquema, gerado 
através do banco de dados de Domínio Conservado (Conserved Domain Database 
(NCBI): MARCHLER-BAUER et al., 2007 – acessado em 2008) ilustra o único domínio 
Jacalina presente na lectina SALT, caracterizando-a como uma merolectina de ligação à 
mannose da família das Jacalinas. 
 
 
 
 
 
salT, enquanto a tabela 2 lista os trabalhos, estresses e condições de cultivo onde a 
lectina SALT foi encontrada. Juntas, as tabelas 1 e 2 reúnem todos os trabalhos 
publicados até 2008 que apontam a expressão do gene salT, bem como o acúmulo 
da lectina SALT, quando plantas de arroz são submetidas à diversos tipos de 
estresses ambientais, tais como salinidade (sais MS, NaCl, KCl), seca, calor, frio, 
metais pesados (arsênico, cobre), baixos níveis de nitrogênio, ferimentos, 
fitormônios (ABA, JA, SA e ET), entre outros. 
Em estudos acerca da região promotora do gene salT, GARCIA (1993) revelou 
a presença de um íntron de 609 pb, nomeado íntron salT, situado entre 1117 pb e 
1725 pb. Adicionalmente, foi detectada a presença de elementos de transposição 
das famílias Castaway e Stowaway na região 5’ flanqueadora do gene salT. 
Somente nove pares de bases separam tais transposons, presentes na região 
promotora deste gene (BUREAU e WESSLER, 1994; NELSON et al., 1994; BUREAU et al., 
1996). Desta forma, entre o elemento móvel Stowaway e o íntron salT encontra-se 
uma região que compreende 256 pb. A Figura 4 mostra um esquema ilustrativo do 
promotor do gene salT. 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 12
Dissertação de mestrado 
 
 
 
Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
1 332 695 705 860 1116 1725
Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
1 332 695 705 860 1116 1725 
 
Figura 4. Esquema ilustrativo do promotor do gene salT. A região de 256 pb está 
compreendida entre 861 pb e 1116 pb e o íntron salT localiza-se entre 1117 pb e 1725 
pb. Castaway e Stowaway são elementos de transposição presentes na região 
promotora salT. 
 
 
 
 
 
Uma característica predominante na regulação da transcrição é a ligação de 
proteínas regulatórias, os chamados fatores de transcrição, a sítios de ligação ao 
DNA conhecidos como sítios de ligação de fatores de transcrição ou elementos 
regulatórios. A identificação computacional desses sítios de ligação ao DNA através 
da análise de seqüências de DNA em banco de dados tem sido, na última década, a 
principal técnica utilizada na elucidação de vias regulatórias da transcrição 
(THOMPSON et al., 2003). 
Os elementos regulatórios são pequenos motivos conservados de 
aproximadamente 5 a 20 nucleotídeos. A detecção desses motivos no promotor não 
é precisa, porque estatisticamente espera-se encontrar essas pequenas seqüências 
aleatoriamente a cada poucas centenas de pares de bases. Portanto, o principal 
problema consiste em distinguir os elementos regulatórios falsos dos verdadeiros 
(BLANCHETTE & SINHA, 2001). Comparada aos motivos desconhecidos, a detecção de 
motivos conhecidos é mais favorável e consiste no rastreamento de seqüências de 
DNA em bancos de dados especializados como TRANSFAC (WINGENDER et al., 
1996) e TFD (GHOSH, 2000), bem como em bancos de dados específicos para 
plantas como OSIRIS (MORRIS et al., 2008), PLACE (HIGO et al., 1999) e PlantCARE 
(LESCOT et al., 2002). 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 13
Dissertação de mestrado 
O OSIRIS (http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl), 
escolhido para as análises realizadas nesse trabalho, é um banco de dados 
integrados de promotores exclusivamente de O. sativa que contém, além de 
diversas outras informações, seqüências de promotores, baseadas na anotação do 
genoma do arroz, e sítios de ligação para fatores de transcrição já previamente 
descritos. Com a integração de diversas ferramentas, o website OSIRIS fornece 
uma compreensiva plataforma para análises de promotores, permitindo ao usuário 
visualizar sítios de ligação para fatores de transcrição em múltiplos promotores, além 
de outros tipos de análises (MORRIS et al., 2008). Portanto, análises in silico têm 
demonstrado ser uma alternativa privilegiada de aumentar o conhecimento sobre o 
promotor de forma mais rápida e com menores custos, especialmente em plantas 
(ROMBAUTS et al., 2003). Nesse sentido, a análise in silico da região promotora do 
gene salT torna-se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos 
regulatórios em cis presentes na mesma. 
Além disso, outro ponto fundamental no estudo da regulação gênica 
consiste em avaliar a influência do íntron do gene salT na regulação da transcrição, 
já que vários trabalhos sugerem a participação de íntrons na expressão de genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 14
Dissertação de mestrado 
Tabela 1. Expressão do gene salT em plantas de arroz em relação às condições e 
tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado. 
1% de sais MS, 3 dias. Bainha de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
1% de sais MS, 3 dias. Raízes de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 Sais MS 
1% de sais MS, 6 h, 2 dias e 4 dias. Bainha de arroz. Indica cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
1% de NaCl, 7 dias. Lâmina foliar de plântulas de arroz. Indica cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
1% de NaCl, 7 dias. Bainha de plântulas de arroz. Indica cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. 
Indica cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997 
100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. 
Indica cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997 
1% de NaCl, 10 dias. Segmentos de 1 cm da base da bainha de 
plantas com 14 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998 
1% de NaCl, 10 dias. Folhas jovens, em expansão, de plantas com 
14 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998 
1% de NaCl, 3 dias. Folhas completamente expandidas de plantas 
com 6 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998 
1% de NaCl, 3 dias. Folhas jovens de plantas com 3 semanas. cv. 
Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998 
0.5% de NaCl, 3 dias. Culturade células de arroz em suspensão. 
Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998 
0.5% de NaCl, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. 
Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998 
250 mM de NaCl, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. 
Nipponbare. RABBANI et al., 2003 
150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 6 a 7 dias. cv. Pokkali 
e cv. PB 1. SAHI et al., 2003 
250 mM de NaCl, 2, 4, 8 e 12 h. Cultura de células de arroz em 
suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004 
NaCl 
140 mM de NaCl, 20 min, 3 h, 24 h. Plantas com 12 dias. Indica cv. 
Nona Bokra (salt-tolerant) e IR28 (salt-susceptible). CHAO et al., 2005 
NaCl + 
CaCl2
NaCl e CaCl2 (5:1 M), 3 dias. Plantas com 9 a 10 dias antes da iniciar 
a formaçao da panícula. Indica cv. IR29. WALIA et al., 2007 
0.5% de NaCl + 1,5 ou 10 μM de GA3, 1 semana. Bainha de plantas 
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. 
GARCIA et al., 1998 
NaCl + 
GA3 0.5% de NaCl + 5 ou 10 μM GA3, 1 semana. Lâmina foliar de plantas 
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. 
GARCIA et al., 1998 
KCl 1% de KCl, 7 dias. Bainha de plântulas. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 15
Dissertação de mestrado 
 
Tabela 1. (continuação) 
Desidratação (ar), 0.5, 1 e 4 h. Raízes. cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Desidratação (ar), 3.5 h. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Bainha. Indica cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Desidratação (ar), 3.5 h. Raízes. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Raízes. Indica cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Desidratação, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. 
Nipponbare. RABBANI et al., 2003 
Seca 
Desidratação (15% de PEG), 9 h. Folhas. cv. IRAT109 
(resistente a estresse hídrico). WANG et al., 2007 
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3 dias. Lâmina foliar. cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Bainha, cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Raízes. cv. 
Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
Calor 
33°C para 28°C. Grãos de 10 dias após florescimento. 
Japonica cv. Nipponbare. YAMAKAWA et al., 2007
4°C, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. 
Nipponbare. RABBANI et al., 2003 
Frio 
10°C, 24 h. Brotos de plantas com 8 a 10 dias. Japonica cv. 
CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio). CHENG et al., 2007 
Escuro Plantas mantidas no escuro por 3 a 4 dias (senescência induzida por escuridão). Folhas. Japonica cv. Tainong 67. LEE et al., 2001 
Nitrogênio 
(baixo nível) 
1,44 mM de NH4NO3 (controle) e 0.24 mM de NH4NO3 
(tratamento), 20 min, 1 h e 2 h. Raízes. Indica cv. Minghui 63. LIAN et al., 2006 
Ácido 
ascórbico 
20 mM de Ácido ascórbico, 3 dias. Plantas com 10 a 14 dias. 
cv. Nipponbare. 
TOKUNAGA e ESAKA, 
2007 
Falta de 
sacarose 
Meio de cultura sem sacarose, 2 dias. Cultura de células de 
arroz em suspensão com 5 dias. cv. Tainan 5. TSENG et al., 1995 
Cobre 10 μM, 45 μM e 130 μM de CuCl2, 24–30 h. Plantas com 6-7 semanas. cv. Nipponbare. SUDO et al., 2008 
 
 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 16
Dissertação de mestrado 
Tabela 1. (continuação) 
1, 5 e 10 de mM prolina, 10 dias. Plantas com 4 dias. cv. 
Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
50, 100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Bainha de plantas com 4 
dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 Prolina 
100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Lâmina foliar de plantas com 
4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas 
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
5 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar de 
plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
1, 5 e 10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar 
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de 
plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
1, 5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de 
plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
50, 100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha 
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
Prolina (+ 
NaCl) 
100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar 
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 
Etileno 1 mM de ethephon (precursor de etileno), 1, 2, 4, 8 e 12 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004 
20 μM de ABA, 3 dias. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 
0,4 e 20 μM de ABA, 3 dias. Raízes. Indica cv. Taichung Native 
1. 
CLAES et al., 1990 
3, 9, 10, 20 e 40 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 12 
dias. Indica cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
3 e 9 μM de ABA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica 
cv. Taichung Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
9 μM de ABA, 4 e 8 h. Raízes de plantsa com 12 dias. Indica 
cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
10 μM de ABA, 3 dias. Cultura de células de arroz em 
suspensão. Indica cv. Pelita I/I. 
GARCIA et al., 1998 
10 μM de ABA, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. 
cv. Taichung Native 1. 
GARCIA et al., 1998 
100 μM de ABA, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. 
Nipponbare. 
RABBANI et al., 2003 
0,2 mM de ABA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de 
arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004 
0,05, 0,1 e 0,2 mM de ABA, 4 h. Cultura de células de arroz em 
suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004 
ABA 
100 μM de ABA, 24 h. Broto de plantas com 8-10 dias. 
Japonica cv. CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio). 
CHENG et al., 2007 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 17
Dissertação de mestrado 
 
Tabela 1. (continuação) 
1, 3 e 9 μM de JA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. 
Indica cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
3 e 9 μM de JA, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. Indica 
cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
9 μM de JA, 6 e 8 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica 
cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
0,2 mM de JA, 0.5, 1 e 2 h. Folhas de plantas com 2 
semanas. Japonica cv. Drew. XIONG et al., 2001 
Ácido jasmônico 
0,25 mM de JA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de 
arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004 
1 μg/mL N-acetilchitooctaose, 2 h. Cultura de células de 
arroz em suspensão. cv. Nipponbare. 
AKIMOTO-TOMIYAMA et 
al., 2003 
Elicitor fúngico 50 μg/mL de micélio do fungo Magnaporthe grisea race 
KJ401 (avirulento ao cultivar Jinheung), 2, 4, 8 e 12 h. 
Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. 
KIM et al., 2004 
Pyricularia grisea (fungo), 1, 2, 3 e dias após infecção. 
Folhas de plantas com 2 semanas. Japonica cv. Drew. XIONG et al., 2001 Inoculação com 
microrganismo Striga hermonthica (parasita de raiz), 2, 4 e 11 dias após 
infecção. Plantas com 21 dias. Japonica cv. IAC 165. SWARBRICK et al., 2008
Cultura de células de arroz em suspensão, entrando na fase 
logarítmica de crescimento. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998 
Cultura de células de arroz em suspensão, fase 
estacionária. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998 
Cultura de células de arroz em suspensão, 3 e 5 dias. Indica 
cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998 
Plantas com 5 dias. cv. Sasanishiki MATSUMURA et al., 1999 
Anteras de arroz. cv. Hayayuki. YAMAGUCHI et al., 2004
Pistilos, 0–5 h após polinização.cv. Indica. LAN et al., 2004 
Condição 
Fisiológica 
Anteras de arroz. cv. Hayayuki. YAMAGUCHI et al., 2007
 
 
 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 18
Dissertação de mestrado 
 
Tabela 2. Acúmulo da proteína SALT em plantas de arroz em relação às condições e 
tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado. 
Sais MS 1% de sais MS, 4 dias. Raízes de plantas com 8 semanas. Indica, cv. Taichung native 1. CLAES et al., 1990 
175 mM de NaCl, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica 
cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997 
170 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. cvs. 
Taichung Native 1, IAC 4440, IAC 201, Pesagro 104, Cica 08, 
Metica 01, Norin Mochi, Mogami chicanari, Guarani, Tomeo 
Mochi and Araguaia. 
DE SOUZA FILHO et al., 2003 
170 mM de NaCl, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1. BRANCO et al., 2004 
150 mM de NaCl, 10 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv. 
Nipponbare. CHITTETI e PENG, 2007 
NaCl 
150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv. 
Nipponbare. CHITTETI e PENG, 2007 
KCl 170 mM de KCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003 
Desidratação, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003 
Desidratação, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1. BRANCO et al., 2004 
Desidratação, 2, 4, 5, e 6 dias. Bainha de plantas com 2 
semanas. cv. Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006 
Desidratação (300 mM de manitol), 2 dias. Bainha de plantas 
com 2 semanas. cv. Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006 
Seca 
Desidratação, 2 dias. Folhas de plantas com 2 semanas. cv. 
Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006 
Calor 42°C, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003 
Arsênico 50 e 100 mM de arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O), 4 dias. Raízes de plantas com 2 semanas. cv. Dongjin. AHSAN et al., 2008 
20 e 40 μM de ABA, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias. 
Indica cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
20 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003 
100 μM de ABA, 12 h. Raíz e parte aérea de plantas com 2 
semanas. cv. Nipponbare. 
HASHIMOTO et al., 2004 
50 μM de ABA, 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas. 
cv. Nipponbare. 
RAKWAL e KOMATSU, 2004 
ABA 
10 μM de ABA, 48 h. Segmentos de raiz de plantas com 12 
dias. cv Nipponbare. 
KONISHI et al., 2005 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 19
Dissertação de mestrado 
Tabela 2. (continuação) 
10 e 20 μM de JA, 60 h. Raízes de plantas com 12 
dias. cv. Taichung Native 1. 
MOONS et al., 1997 
250 mM de JA, 24 e 48 h. Cultura de células de arroz 
em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2003 
100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias. 
Indica cv. IR36. 
MICHÉ et al., 2006 
Ácido 
jasmônico 
100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias. 
Indica cv. IR42. 
MICHÉ et al., 2006 
Ferimento (vários pontos de lesão mecânica ao longo 
da lâmina foliar e bainha), 24 h. Bainha de plantas com 
14 dias. 
DE SOUZA FILHO et al., 2003 
Ferimento Ferimento (lesão mecânica na parte aérea da planta), 
12, 24 e 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas. 
cv. Nipponbare. 
SHEN et al., 2003 
Elicitor 
fúngico 
50 mg/mL de micélio de Magnaporthe grisea, cepa 
KJ401 (avirulenta ao cv. Jinheung), 24 e 48 h. Cultura 
de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. 
KIM et al., 2003 
Magnaporthe grisea cepa 70-15 (fungo), 48 h. 
Plântulas de arroz. cv. Nipponbare. KIM et al., 2001 
Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 24 e 48 h 
após infecção. Cultura de células de aroz em 
suspensão. cv. Jinheung. 
KIM et al., 2003 
Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 48 h após 
infecção. Inoculação de tecido vascular de folhas. cv. 
Jinheung. 
KIM et al., 2004 
Rice yellow mottle virus (RYMV), 7 dias após infecção. 
Cultura de células de arroz em suspensão. Indica cv. 
IR64 (susceptível a RYMV). 
VENTELON-DEBOUT et al., 2004 
Azoarcus sp. cepa BH72 (BHGN3.1). Inoculação 
bacteriana em raízes de plantas com 20 dias. Indica cv. 
IR36 (susceptível). 
MICHÉ et al., 2006 
Inoculação 
com 
microrganismo 
Azoarcus sp. strain BH72 (BHGN3.1). Bacterial 
inoculation of 20-day-old rice roots. Indica cv. IR42 
(moderately resistant). 
MICHÉ et al., 2006 
Parte aérea com 3 cm de comprimento (bainha e folha) 
de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. SHEN et al., 2002 
Sementes com 7, 12, 18, 24 e 35 dias após 
florescimento. DE SOUZA FILHO et al., 2003 
Parte aérea de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare KOMATSU et al., 2003 
Condição 
Fisiológica 
Sementes com 0, 12, 24, 48 e 72 h após inibição da 
germinação. Indica cv. 9311. YANG et al., 2007 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 20
Dissertação de mestrado 
 
1.5 – A influência de íntrons na regulação da expressão gênica 
 
 
A habilidade de íntrons em aumentar a expressão de genes tem sido bem 
documentada em vários organismos, incluindo mamíferos (BUCHMAN e BERG, 1988; 
CHUNG e PERRY, 1989), insetos (MEREDITH e STORRI, 1993), nematóides (OKKEMA et 
al., 1993) e plantas (CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; ROSE e LAST, 
1997). Esse efeito é conhecido como aumento da expressão de genes mediado por 
íntron (IME, do inglês “intron-mediated enhancement”) (MASCARENHAS et al., 1990). 
Em plantas, estima-se que cerca de 80% dos genes nucleares contém 
íntrons (GOODALL et al., 1991; INITIATIVE et al., 2000; REDDY, 2001), e já foi mostrado 
que diversos deles aumentam a expressão gênica (SAMADDER et al., 2008). A 
eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL 
et al., 1996). Sabe-se que íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas 
incluem os íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1 
(CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e 
METTLER, 1992; DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al., 
1990; XU et al., 1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de 
dicotiledôneas que elevam a expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de 
petúnia rbcS (DEAN et al., 1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de 
Arabidopsis UBQ3, UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993; 
NORRIS et al., 1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). A 
intensidade do IME pode ser maior que 100 vezes (MAAS et al., 1991; ZHANG et al., 
1994), porém é mais comum na faixa entre 2 e 10 vezes e é tipicamente maior em 
monocotiledôneas que em dicotiledôneas (SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996; ROSE e 
BELIAKOFF, 2000; CLANCY e HANNAH, 2002; ROSE, 2002). Em plantas, a inclusão de 
um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o aumento do 
acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde faltam 
íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996). 
Estudos em células animais revelaram que o aumento mediado por íntron 
é alcançado através de um mecanismo combinatório que aumenta a transcrição, o 
acúmulo de mRNA e a tradução (FURGER et al., 2002; NOTT et al., 2003, 2004) mas 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 21
Dissertação de mestrado 
que, por outro lado, não afeta substancialmente a estabilidade do mRNA (NOTT et 
al., 2003; SAMADDER et al., 2008). Sabe-se que o IME é dependente tanto da posição 
quanto da seqüência do íntron (BOURDON et al., 2001; CLANCY e HANNAH, 2002; 
ROSE, 2002, 2004), porém, muito pouco é conhecido sobre o mecanismo de tal 
aumento, e diferentes íntrons devem afetar a expressão por diferentes maneiras 
(ROSE e BELIAKOFF, 2000). 
Evidências sugeremque os íntrons atuam pós-transcricionalmente, 
aumentando o nível de mRNA por facilitar a maturação e aumentar a estabilidade de 
transcritos nascentes (ROSE, 2004). Uma sugestão para essa função pós-
transcricional é provido pelos achados que os íntrons devem estar contidos dentro 
de seqüências transcritas e na orientação apropriada para elevar a expressão do 
gene (CALLIS et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; CLANCY et al., 1994; DONATH et 
al., 1995; DEAN et al., 1989; ROSE e LAST, 1997), diferentemente dos enhancers 
transcricionais, que geralmente são independentes de posição e orientação (CALLIS 
et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; SNOWDEN et al., 1996). 
Alguns trabalhos sugerem que o IME requer o splicing do íntron, porém, 
esta ainda é uma questão a ser esclarecida (SINIBALDI e METTLER, 1992; SULLIVAN e 
GREEN, 1993; LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Outros autores 
tentam explicar o mecanismo de IME avaliando características necessárias ao 
íntron. Desta forma, a partir de deleções feitas em sua seqüência, foi visto que a 
maioria das seqüências dos íntrons é dispensável para o IME (CLANCY et al., 1994; 
LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Percebe-se assim, que são 
inúmeros os trabalhos que sugerem, de alguma forma, uma importante participação 
de íntrons na regulação da expressão gênica. Portanto, para uma avaliação mais 
acurada acerca da regulação do gene salT, torna-se interessante analisar o grau de 
influência que íntron salT exerce sobre a atividade do promotor do gene salT. Para 
tanto, faz-se necessário uma comparação entre os níveis de expressão 
apresentados pelo íntron salT e por outro íntron cuja capacidade de aumentar a 
expressão já foi amplamente caracterizado na literatura, como o íntron Act1 de 
arroz. 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 22
Dissertação de mestrado 
 
2. OBJETIVOS 
 
 
O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente 
a região regulatória e estudar a influência do íntron salT na regulação do gene salT 
de arroz (Oryza sativa L.). Para tanto, foram concluídos os seguintes objetivos 
específicos: 
 
2.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway 
sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa. Foram determinados quais 
os cultivares possuíam tais inserções, e o nível de indução do gene salT na bainha 
destes cultivares foi mensurado através de ensaios de PCR em Tempo Real. 
Adicionalmente, foi avaliado o perfil de acúmulo da proteína SALT nos diferentes 
cultivares através de western blotting. 
 
2.2 – Identificação de sítios de ligação para fatores de transcrição presentes na 
região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico no banco de 
dados de promotores de arroz OSIRIS. 
 
2.3 – Construção de três vetores de expressão em plantas induzidos por estresses 
ambientais contendo as fragmentos “Região de 256 pb”, “Região de 256 pb + Íntron 
salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”. 
 
2.4 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 
256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de 
Arabidopsis thaliana. 
 
2.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O. sativa 
através de ensaios de microarrays desenvolvidos pelo banco de expressão da 
Universidade de Yale. O perfil transcricional do gene salT em tecidos e tipos 
celulares de embrião, broto, lâmina foliar e raiz foi avaliado por Northern eletrônico. 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 23
Dissertação de mestrado 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
3.1 – Materiais Utilizados 
 
- Para obtenção da seqüência completa do gene salT de arroz foi utilizado o banco 
internacional de seqüências NCBI (National Center for Biotechnology Information, 
www.ncbi.nlm.nih.org). Para a demonstração do domínio Jacalina, foi utilizado o 
Banco de Dados de Domínios Conservados do NCBI (Conserved Domain Database, 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). A identificação de sítios de 
ligação de fatores de transcrição foi realizada utilizando o banco de dados OSIRIS 
(http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl) e o perfil 
transcricional do gene salT foi analisado em diversos tecidos e tipos celulares de 
arroz através do Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil de Expressão 
Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling of Rice Yale 
Project, http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx); 
 
- As plantas de arroz (O. sativa) utilizadas nos ensaios de extração de DNA 
genômico, RNA e proteína, foram germinadas e cultivadas na casa de vegetação do 
Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). Foram utilizadas sementes dos cultivares 
Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 
1 (TN1). Todas as sementes foram gentilmente cedidas pelo Centro Nacional de 
Pesquisa Arroz e Feijão – EMBRAPA (Goiânia, GO, Brasil); 
 
- As plantas de Arabidopsis thaliana L. (Heyn), ecótipo Wassilewskija, utilizadas nos 
ensaios de expressão transiente do gene GUS foram germinadas e cultivadas em 
câmara de cultivo no Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). As sementes 
utilizadas foram obtidas em colaboração com INRA-Versailles (França); 
 
- A bactéria Escherichia coli linhagem DH5α foi utilizada nos trabalhos de 
transformação e clonagem dos fragmentos de DNA; 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 24
Dissertação de mestrado 
- A bactéria Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA 4440 foi utilizada nos ensaios 
de eletroporação e transformação transiente de tecido foliar de Arabidopsis thaliana; 
 
- Vetor utilizado como base para a construção dos vetores de expressão foi o 
plasmídeo pA19-GUS, gentilmente cedido pelo Dr. Gilberto Sachetto Martins, do 
Laboratório de Genética Molecular Vegetal – Departamento de Genética, Instituto de 
Biologia, Centro de Ciências e Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro 
(UFRJ). 
 
 
3.2 – Metodologia 
 
 
3.2.1 – Avaliação dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre 
a atividade do promotor do gene salT de O. sativa 
 
 
3.2.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região do gene salT em 
diferentes cultivares de arroz através de amplificação por PCR 
 
 
3.2.1.1.1 – Cultivo das plantas de arroz e realização do estresse 
 
Sementes de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, 
Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram germinadas e cultivadas em 
substrato embebido em solução nutritiva pH 5,8 (YOSHIDA, 1976). A germinação e o 
crescimento das plantas ocorreram a 27°C, com fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h no 
escuro, durante 21 dias. As plantas de arroz, utilizadas para a extração de RNA total 
e proteínas, foram transferidas, e permaneceram por 24 h, em potes de vidro 
contendo 100 mL da solução nutritiva acrescida, ou não, do agente estressante, 
NaCl 1% (170 mM). 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 25
Dissertação de mestrado 
 
3.2.1.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz 
 
Folhas de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-
1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram maceradas em nitrogênio líquido. 
Em seguida, aproximadamente 0,1 g dos materiais foi transferido para um tubo de 
microcentrífuga, onde foi adicionado 1 mL do tampão de extração (100 mM NaCl; 10 
mM Tris-HCl pH 7.5; 1 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS). Após, as amostrasforam 
agitadas vigorosamente e centrifugadas por 2 min a 12.000 x g. As fases aquosas 
(sobrenadantes) foram coletadas, divididas em dois tubos e a cada um foi 
adicionado igual volume de fenol:clorofórmio, seguido de agitação. Os tubos foram 
centrifugados por 5 minutos a 10.000 x g e a fase aquosa de cada tubo foi 
transferida para outro tubo, no qual foi adicionado 0,1 volume de acetato de sódio 
pH 5,2 3 M. As amostras foram misturadas por inversão e, imediatamente após, a 
cada tubo foram adicionados 2 volumes de etanol absoluto gelado (ou 1 volume de 
isopropanol). Depois de misturados por inversão, os tubos foram incubados por 1 h à 
-20°C ou 30 min à -70°C e então centrifugados por 10 min a 12.000 x g. Os 
sobrenadantes foram descartados, os sedimentos lavados duas vezes com etanol 
70% gelado e, em seguida, os tubos foram centrifugados por 2 min a 12.000 x g. Os 
sobrenadantes foram descartados e os sedimentos de DNA secos em estufa a 37°C. 
Após secos, os materiais foram ressuspensos em 200 µL de TE-RNAse e incubados 
por 1 h a 37°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ 
(Invitrogen), segundo recomendação do fabricante. 
 
3.2.1.1.3 – Ensaios de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase 
(PCR) 
 
Os ensaios de amplificação por PCR foram utilizados na amplificação de 
fragmentos correspondentes ao promotor salT inteiro e à região de 256 pb, 
adicionada do íntron ou não, com a finalidade de detectar em quais cultivares havia 
a presença dos elementos de transposição na região promotora do gene salT. 
Adicionalmente, a técnica de PCR foi utilizada para a obtenção dos fragmentos 
utilizados na construção dos vetores de expressão. 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 26
Dissertação de mestrado 
Desta forma, para o ensaio de PCR foram utilizados 20 ng de DNA 
genômico, tampão para enzima Taq DNA Polimerase (10 mM de Tris-HCl pH 9,0 e 
50 mM de KCl), 1,5 mM de cloreto de magnésio, 0,4 mM de dNTP, 20 pmoles de 
cada oligonucleotídeo seguindo a combinação descrita na tabela 3, 1U de Taq DNA 
Polimerase e água ultra pura q.s.p. 25 µL. As condições de amplificação foram: 95°C 
por 1 min, 42°C por 1 min e 72°C por 90 seg (1 ciclo) e 95°C por 1 min, 55°C por 1 
min e 72°C por 90 seg (39 ciclos). A combinação de primers utilizado em cada 
reação está indicada na tabela 3. 
Para facilitar a clonagem dos fragmentos obtidos por PCR no vetor pA19-
GUS digerido, foram desenhados iniciadores contendo sítios para enzimas de 
restrição. A tabela 4 mostra a seqüência dos iniciadores, e o destaque em azul 
corresponde ao sítio de restrição. O iniciador “Gus 5’ Rev” foi utilizado apenas nas 
reações de amplificação para a confirmação da clonagem dos insertos nos vetores. 
Tal iniciador anela na extremidade 5’ do gene repórter GUS e, dessa forma, o 
fragmento amplificado confirma a clonagem do inserto na porção 5’ do gene GUS. A 
figura 5 ilustra o local de anelamento e a direção de cada primer no promotor do 
gene salT. 
 
 
Tabela 3. Combinações de primers utilizados nos ensaios de PCR. 
Fragmento Par de primers utilizados no PCR Sítios de Restrição 
Promotor salT 
inteiro Bea 01 e Bea 04 Bam ---- 
Região de 256 pb Pro 250 Eco e Bea 02 Bam EcoRI e BamHI 
Região de 256 pb Pro 250 Eco e Bea 02 Xho EcoRI e XhoI 
Região de 256 pb 
+ íntron salT Pro 250 Eco e Bea 04 Bam EcoRI e BamHI 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 27
Dissertação de mestrado 
 
Tabela 4. Seqüência dos iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição. 
Primer Seqüência de nucleotídeos Enzimas 
Bea 01 5’ – GAA GAT CTG TAA CGC GTG GTC TTT C – 3’ - 
Bea 02 Bam 5’ – CGG GAT CCA CTC TTC GTG GTC GCT TAA AT – 3’ BamHI 
Bea 02 Xho 5’ – CCG CTC GAG ACT CTT CGT GGT CGC TTA AAT – 3’ XhoI 
Bea 04 Bam 5’ – CGG GAT CCA CTC TGT TTA GTA AAT AC – 3’ BamHI 
Pro 250 Eco 5’ – GGA ATT CTA GAG TAG CAT CAC CAG CT – 3’ EcoRI 
Gus 5’ Rev 5’ – GAT TTC ACG GGT TGG GGT TTC TA – 3’ - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bea 01
Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
Pro 250 Bea 04
1 332 695 705 860 1116 1725
Bea 02Bea 01
Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
Pro 250 Bea 04
1 332 695 705 860 1116 1725
Bea 02 
 
Figura 5. Local de anelamento e direção de cada primer no promotor do gene salT. O 
esquema ilustrativo mostra a região de anelamento de cada primer utilizado. A combinação 
de primers Bea 01 / Bea 04 amplifica o promotor salT inteiro, a combinação Pro 250 / Bea 
02 amplifica a Região de 256 pb, e o par Pro 250 / Bea 04 amplifica a Região de 256 pb + 
Íntron salT. 
 
 
 
 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 28
Dissertação de mestrado 
 
3.2.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de O. sativa expostos 
ao estresse salino através de RT-PCR e western blotting 
 
 
3.2.1.2.1 – Obtenção de RNA total de bainhas de plantas de arroz para 
ensaios de RT-PCR 
 
Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares 
Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 
foram maceradas em nitrogênio líquido e as amostras foram utilizadas para extração 
de RNA total. Para tanto, 300 mg de tecido foram utilizados para extração de RNA 
com o reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante. 
As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen), 
segundo recomendação do fabricante. 
 
3.2.1.2.2 – Síntese de cDNA e ensaio de RT-PCR 
 
Para síntese de cDNA foram utilizados 1 μg de RNA total, 100 pmoles de 
poli-T e 250U da enzima SuperScript III (Invitrogen). A reação ocorreu à 50ºC 
durante 1 h. 
Ensaios de RT-PCR foram realizados utilizando o kit Power SYBR Green 
(Applied Biosystems), 3 pmoles de cada oligonucleotídeo, 1 ng de cDNA (obtidos a 
partir do RNA total) e 7 μg de BSA (New England Biolabs) em um volume final de 10 
μL. As reações foram realizadas em capilares na máquina LightCycler 1.0 (Roche). 
Em tais ensaios foram analisado a expressão dos seguintes genes: salT 
(SalT-Fw: 5’ – CAG ATC CAT TGC CTT CAA CT – 3’ e SalT-Rev: 5’ – AGA TCA 
TAG ACT GGG CCA TG – 3’) e 18S (Rice18s-Fw: 5’ – ATG ATA ACT CGA CGG 
ATC GC – 3’ e Rice18s-Rev: 5’ – CTT GGA TGT GGT AGC CGT TT – 3’). O gene 
18S foi utilizado como controle interno para normalização da quantidade de amostra 
utilizada em cada reação. Os ensaios de RT-PCR foram realizados em dupicada. 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 29
Dissertação de mestrado 
3.2.1.2.3 – Obtenção de extrato protéico de bainhas de plantas de arroz 
 
Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares Cica 
8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 
foram maceradas, inicialmente, em nitrogênio líquido e logo depois maceradas 
novamente com 500 μL de solução PBS 1x pH 7,2 (0,13 M NaCl; 5 mM Na2HPO4) e 
0,1 mM PMSF. As amostras foram transferidas para tubos de microcentrífuga e 
centrifugadas a 12000 x g por 10 min. Os sobrenadantes foram transferidos para 
novos tubos e estocados a -20°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o 
sistema Qubit™ (Invitrogen), segundo recomendação do fabricante. 
 
3.2.1.2.4 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-glicina 
 
Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI, 
1970). A eletroforese ocorreu durante 2 h a 100 V em 12,5% SDS-PAGE. Os géis 
obtidos foram corados pelo método de Azul de Commassie. Para a remoção do 
corante não ligado à proteína, os géis foram incubados em solução descorante sob 
agitação constante. 
 
3.2.1.2.5– Ensaios de western blotting 
 
Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI, 
1970). Em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose, 
que foi então bloqueada durante 1 h em tampão TS-20 (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 
mM NaCl; 0,05% Tween-20), contendo 0,3% de leite desnatado, sob agitação. Após 
3 lavagens de 5 min com TS-20, a membrana foi incubada durante 1 h em tampão 
TS-20, contendo 0,1% de leite desnatado e o anticorpo anti-SALT, na diluição 1:500. 
Em seguida, a membrana foi novamente lavada 3 vezes, por 5 min, em TS-20. A 
membrana foi incubada durante 2 h em tampão TS-20 contendo 0,1% de leite 
desnatado e o anticorpo secundário, anti-coelho IgG conjugado à proteína A 
peroxidase, na diluição 1:2000. Após 3 lavagens de 5 min, com a solução TS-20, o 
ensaio foi revelado através da incubação da membrana com o tampão de revelação 
por DAB (6,5 mL ácido acético 0,1 M; 7,9 mL Na2HPO4 0,2 M; 5,0 mL H2O2 30v 
(30% v/v); H2O q.s.p. 25 mL; OPD (orto-fenil-diamina) 10 mg). O anticorpo anti-SALT 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 30
Dissertação de mestrado 
foi produzido no Laboratório de Biotecnologia do Centro de Biociências e 
Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro pelo 
aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira. 
 
3.2.1.3 – Identificação de sítios regulatórios presentes na Região de 256 pb do 
promotor do gene salT através de análises in silico 
 
O locus correspondente ao gene salT de arroz foi submetido às análises 
de visualização de elementos em cis do banco de dados de promotores de arroz 
OSIRIS. As regiões para ligação de proteínas regulatórias identificadas dentro da 
região de 256 pb do promotor salT foram avaliadas, uma a uma, e as informações 
obtidas foram organizadas em uma tabela. 
 
 
3.2.2 – Avaliação da influência do íntron salT na regulação do gene salT 
 
 
3.2.2.1 – Construção de vetores de expressão em plantas 
 
3.2.2.1.1 – Cultivo das plantas de arroz. 
 
Metodologia descrita no item 3.2.1.1.1. 
 
3.2.2.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz 
 
Ensaios descritos no item 3.2.1.1.2. 
 
3.2.2.1.3 – Ensaios de amplificação dos fragmentos de interesse por PCR 
 
Ensaios descritos no item 3.2.1.1.3. 
 
 
 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 31
Dissertação de mestrado 
3.2.2.1.4 – Restrição enzimática dos fragmentos obtidos por PCR com as 
enzimas EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI 
 
Os três fragmentos amplificados nas reações de PCR foram digeridos com 
as enzimas de restrição específicas para abrir os sítios de restrição e permitir a 
clonagem dos mesmos em seus vetores correspondentes. Sendo assim, os 
fragmentos obtidos foram digeridos com as seguintes enzimas: (1) Região de 256 
pb – EcoRI e BamHI; (2) Região de 256 pb – EcoRI e XhoI; (3) Região de 256 pb + 
Íntron SalT – EcoRI e BamHI. Para reação de digestão dos fragmentos foram 
utilizados aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição, 
tampão da enzima para uma concentração final de 1X (33 mM Tris-acetato pH 7,9; 
10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água 
ultra pura para um volume final de 80 µL. As amostras foram misturadas com auxílio 
de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h. 
 
3.2.2.1.5 – Extração do plasmídeo PA19-GUS de bactérias Escherichia 
coli DH5α 
 
Uma colônia isolada de uma placa foi inoculada em 10 mL de meio LB (5 g 
de extrato de levedura; 10 g de NaCl; 10 g de triptona; q.s.p. 1 L de água) contendo 
50 μg/mL de ampicilina e mantida sob agitação durante 16 h à 37°C. Transcorrido 
esse período as células foram coletadas através de centrifugação. O material foi 
ressuspenso em 200 μL solução I gelada (50 mM de glicose; 25 mM de Tris-HCl pH 
8,0; 10 mM de EDTA pH 8,0) e transferido para um tubo de microcentrífuga. Em 
seguida, para lise das células, 400 μL de solução II (0,2 N de NaOH e 1% de SDS) 
foram adicionados à amostra e a mesma foi agitada gentilmente por 30 segundos. 
Posteriormente, foram adicionados 300 μL de solução III gelada (acetato de potássio 
3 M pH 5,2) ao tubo. A amostra foi homogeneizada e incubada em gelo durante 5 
min. O material foi centrifugado a 12.000 x g durante 15 min e 600 µL do 
sobrenadante transferido para um tubo novo. A esse foram acrescentados 600 μL de 
fenol:clorofórmio (1:1), agitado vigorosamente e centrifugado a 12.000 x g durante 2 
min. A fase superior foi coletada e o DNA precipitado com igual volume de 
isopropanol durante 10 min a temperatura ambiente. O material foi centrifugado a 
12.000 x g por 5 min, o sobrenadante descartado e o sedimento lavado com etanol 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 32
Dissertação de mestrado 
70%. A amostra foi novamente submetida à centrifugação a 12.000 x g durante 3 
min e a fase líquida descartada. Em seguida o DNA foi seco em estufa a 37°C, 
ressuspenso em TE-RNase e incubado a 37°C por 1 h. Após esse período a 
amostra foi armazenada a -20°C. 
 
3.2.2.1.6 – Restrição enzimática do vetor pA19-GUS com as enzimas 
EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI 
 
Para as reações de digestão do plasmídeo pA19-GUS foram utilizados 
aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição, tampão 
da enzima (33 mM Tris-acetato pH 7,9; 10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato 
de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água ultra pura para um volume final de 80 µL. 
O plasmídeo foi digerido com combinações distintas de enzimas de 
restrição. Na primeira combinação, o DNA foi tratado simultaneamente com as 
enzimas EcoRI e BamHI. Utilizando essa combinação o promotor CaMV 35S e o 
íntron Act1 foram liberados, dando origem ao plasmídeo pA19-GUS-1. Na segunda 
abordagem, somente o promotor CaMV 35S foi retirado do plasmídeo pA19-GUS, e 
para tal, o DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI, 
dando origem ao plasmídeo PA19-GUS-2. As amostras foram misturadas com 
auxílio de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h. 
 
3.2.2.1.7 – Ligação dos fragmentos ao vetor de clonagem 
 
Para reação de ligação foi utilizado o vetor de clonagem pA19-GUS 
tratado previamente com enzimas de restrição visando produzir extremidades 
compatíveis com os insertos, conforme descrito anteriormente. Dessa forma, foram 
feitos três ensaios de ligação: (1) Região de 256 pb EcoRI/BamHI + pA19-GUS 
EcoRI/BamHI, (2) Região de 256 pb com íntron salT EcoRI/BamHI + pA19-GUS 
EcoRI/BamHI e (3) Região de 256 pb EcoRI/XhoI + pA19-GUS EcoRI/XhoI. O ensaio 
foi realizado utilizando a proporção de 1:3 de plasmídeo e fragmento a ser inserido, 
tampão de reação da enzima T4 DNA Ligase para uma concentração final de 1X 
(300 mM Tris-Hcl pH 7,8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT e 10 mM ATP) e 3U da 
enzima T4 DNA Ligase. O volume da reação foi ajustado para 10 µL com água ultra 
pura e a amostra incubada por 16 h à 16ºC. 
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 33
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3.2.2.1.8 – Produção de células competentes de E. Coli DH5α utilizando 
cloreto de rubídio 
 
Uma colônia de bactéria isolada de uma placa recente de LB foi inoculada 
em 10 mL de meio SOB líquido sem antibiótico (20 g/L de triptona; 5 g/L de extrato 
de levedura; 0,585 g/L de NaCl; 0,186 g/L de KCl. Corrigir o pH para 7,0 com KOH). 
A cultura foi incubada por 16 h à 37°C sob agitação moderada (250 x g). Após este 
período, 1 mL desta cultura foi transferido para 100 mL de meio SOB líquido fresco e 
incubado à 37°C sob agitação moderada (250 x g) até atingir densidade celular de 
aproximadamente5 x 107 células/mL (DO600 nm para bactéria DH5α de 0,45 – 0,55 
Abs). Após atingir a densidade desejada, a cultura foi transferida para dois tubos de 
centrífuga com volume de 50 mL e resfriado por 10 min em gelo. Os tubos foram 
centrifugados à 1.500 x g durante 10 min à 4°C e o sobrenadante descartado. 
Posteriormente, em cada tubo foi acrescentado 16 mL de solução RF1 gelada (30 
mM de acetato de potássio; 100 mM de cloreto de rubídio; 50 mM de cloreto de 
manganês; 100 mM de cloreto de cálcio; 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 5,8 
com ácido acético 0,2 M e esterilizar com filtro de 0,22 µm). A amostra foi agitada 
gentilmente à 4ºC até total e uniforme ressuspensão do precipitado. Os tubos foram 
novamente centrifugados a 1.500 x g por 10 minutos à 4°C e o sobrenadante 
descartado. As células foram ressupensas lentamente em 4 mL de solução RF2 (10 
mM de MOPS (3-[N-morpholino] propane-sulfonic acid), 10 mM de cloreto de 
rubídio, 75 mM de cloreto de cálcio e 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 6,8 
com NaOH 2 N e esterilizar com filtro de 0,22 µm) à 4°C até obter-se uma aparência 
homogênea. Os tubos foram deixados em gelo por 15 min e alíquotas de 200 µL 
foram distribuídas em tubos de 1,5 mL, congeladas em nitrogênio líquido e 
armazenadas à -70°C. Todo o processo foi conduzido em condições estéreis. 
 
3.2.2.1.9 – Transformação de E. coli linhagem DH5α 
 
Tubos contendo alíquotas de 200 µL de E. coli DH5α competentes, 
armazenadas em freezer à -70ºC, foram mantidas em gelo por 10 min. Em seguida 
foram acrescentados, em ambiente esterilizado, 10 µL da reação da ligação. As 
mesmas foram agitadas lentamente e submetidas a um choque térmico de 5 min em 
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gelo, 90 seg à 42ºC e imediatamente transferidas para gelo e mantidas por 3 min. 
Posteriormente, foram adicionados 800 µL de meio SOC à amostra (20 g/L de 
triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 0,585 g/L de NaCl, 0,186 g/L de KCl e 20 mM 
de glicose. Corrigir o pH para 7,0 com KOH) e esta incubada por 30 min à 37ºC. 
Após este período, 200 µL da cultura de bactérias foram plaqueadas em meio LB 
sólido (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de 
ágar. Corrigir o pH para 7,4 com NaOH) contendo 60 µg/mL de ampicilina. As placas 
de cultura foram colocadas invertidas em estufa à 37ºC e mantidas por 
aproximadamente 16 h. 
 
 
3.2.2.2 – Expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de A. thaliana 
 
 
Todos os experimentos desta etapa foram conduzidos em colaboração 
com a aluna de iniciação científica Fernanda Barbosa Bueno. 
 
3.2.2.2.1 – Cultivo de plantas de A. thaliana selvagem 
 
As sementes de Arabidopsis thaliana foram resfriadas por pelo menos 48 
h em a 4ºC. Em seguida, estas foram hidratadas por 1 h em água esterilizada com 
moderadas agitações para uniformizar a embebição. Posteriormente, as sementes 
foram desinfetadas através de duas lavagens de 15 min, utilizando 15% hipoclorito 
de sódio (v/v) diluído em água esterilizada. Posteriormente, para eliminar o excesso 
de hipoclorito de sódio, as sementes foram lavadas 6x com água esterilizada em 
ambiente estéril. Ao final do processo, as sementes foram distribuídas em Jiffy Pellet 
reutilizado hidratado com água destilada e autoclavado. As plantas foram cultivadas 
em câmara de cultivo apropriada a 19°C, com intensidade luminosa de 120 μmol m-
2.s-1, e hidratadas de 15 em 15 dias com solução nutritiva de Hoagland (OSTREM et 
al., 1987). 
 
 
 
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3.2.2.2.2 – Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens 
linhagem LBA 4440 
 
As bactérias A. tumefaciens que seriam utilizadas nos ensaios de 
transformação transiente de tecido foliar de A. thaliana deveriam conter os vetores 
de expressão construídos. Para tanto, foi necessário preparar células de A. 
tumefaciens eletrocompetentes. Brevemente, 50 mL de células foram cultivadas em 
erlenmeyer com chicana (500 mL) até alcançar o meio da fase exponencial em meio 
YEB (OD600 nm: 0,6 Abs) e então coletadas por centrifugação a 4°C sob 2.880 x g. As 
células foram lavadas 6 x com 40 mL de água ultra pura, sendo mantidas sempre a 
4°C. Ao final, as células foram ressuspensas em água ultra-pura em um volume 
equivalente a 20x o volume de células obtido. 
 
3.2.2.2.3 – Eletroporação de bactérias A. tumefaciens 
 
Células de A. tumefaciens LBA 4440 eletrocompetentes (50 μL) e 1 μL dos 
vetores de expressão (~100 ng) foram misturados, mantidos por 30 minutos a 4°C e, 
em seguida, eletroporados a 1,5 kV por 5 ms, usando TransPorator Plus (BTX) em 
uma cubeta 0,1 cm (Epicentre). Meio YEB sem antibiótico foi adicionado 
imediatamente após o pulso e as células foram incubadas a 28ºC sob agitação 
constante. Após 2 h, as células foram plaqueadas em meio YEB sólido, 
suplementado com rifampicina (100 μg mL-1) e incubadas à 37°C por 24 h para 
seleção dos transformantes. Foram feitos diferentes ensaios de eletroporação para 
cada um dos três vetor utilizados. 
 
3.2.2.2.4 – Detecção da expressão do gene GUS em A. tumefaciens 
 
As cepas de A. tumefaciens, contendo as três construções e o plasmídeo 
original pA19-GUS, que seriam utilizadas nos ensaios de transformação transiente 
de tecido foliar de A. thaliana foram testadas quanto à capacidade de expressar o 
gene GUS. Para tanto, foram inoculados 150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em 
20 mL de meio YEB contendo os antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina 
(50 μg mL-1), e os frascos foram colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C por 48 
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h. Após esse tempo, 1 mL de cada cultura crescida foi transferido para tubos de 
microcentrífugas e os tubos foram centrifugados a 1000 RPM por 2 min. O 
sobrenadante foi descartado e o material precipitado foi ressuspenso em 1 mL do 
tampão x-gluc (0,1 mM Fosfato de sódio pH 7,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,1% (v/v) 
Triton X-100; 1 mM K3Fe(CN)6; 2 mM X-gluc; água ultra-pura). Os tubos foram 
centrifugados a 1000 RPM durante 2 min, o material precipitado foi novamente 
ressuspenso no tampão x-gluc (sem adicioná-lo outra vez) e os mesmos foram 
incubados em temperatura ambiente por 24 h. 
 
3.2.2.2.5 – Infecção das diferentes cepas de A. tumefaciens em folhas de 
A. thaliana 
 
Para os ensaios que tiveram como objetivo analisar a influência do íntron 
salT sobre a atividade do promotor salT foram utilizadas folhas de A. thaliana 
infectadas com diferentes cepas de A. tumefaciens. Para tanto, foram inoculados 
150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em 20 mL de meio YEB contendo os 
antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina (50 μg mL-1), e os frascos foram 
colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C até que a DO600 nm atingisse 1.5. De 
cada cultura crescida, 5 mL foram transferidos para tubos estéreis de 15 mL e 
centrifugados a 1000 RPM por 10 min. O sobrenadante foi descartado, o material 
precipitado de cada tudo foi ressuspenso em 5 mL de Solução de Infecção fresca 
(10 mM MgCl2; 10 mM MES; 20 μM Acetoseringona; água ultra pura), e os tubos 
foram incubados a 25°C por 3 h. As folhas escolhidas para infecção pertenciam à 
parte inferior de plantas de A. thaliana com 28 dias, e foram selecionadas segundo 
tamanho e localização semelhantes. Apenas uma folha em cada planta foi utilizada. 
A inoculação de 1 mL da solução de infecção ocorreu ao longo da região abaxial da 
folha, partindo da ponta até o final do limbo, pressionando a folha contra uma 
seringa de 5 mL sem