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Estudo dirigido sobre o papel das proteínas virais no processo de infecção de uma célula por um vírus (Parte integrante da Avaliação à Distância 2 – Bioquímica I) Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção ANTES DE COMEÇAR... Na aula passada, você viu uma introdução à estrutura dos vírus. Estes patógenos são compostos por: • um genoma, que pode ser de DNA ou RNA; • um capsídeo protéico, formado por muitas unidades de uma mesma proteína (ou de algumas proteínas diferentes), que se organizam de forma simétrica (e essa simetria pode ser helicoidal ou icosaédrica, dependendo da família de vírus); • um envelope lipídico, em alguns vírus – aqueles que saem da célula por um processo chamado brotamento e que levam consigo um pedaço da membrana da célula. Os vírus são agentes causadores de doenças realmente particulares. Eles não podem se reproduzir por conta própria e precisam usar a maquinaria enzimática e os suprimentos energéticos das células hospedeiras para transcrever e traduzir seus genes. Um vírus passa por dois momentos bastante diferentes durante a sua existência: em um, ele precisa ser capaz de se manter no ambiente durante longos períodos de tempo, sem que seu genoma seja degradado ou danificado. O que dá essa proteção ao genoma é o capsídeo, uma estrutura estável o suficiente para se manter íntegra quando o vírus está no ar, por exemplo. Em outro, quando o vírus infecta uma célula, o genoma viral deve ser exposto ao interior dessa célula para que o vírus possa se replicar. Assim, é necessário que as partículas virais sejam extremamente estáveis quando se encontram no meio extracelular e se tornem instáveis e se desmontem após atingirem o meio intracelular. Mas como isso é possível? Nesta aula, você vai entender como a FLEXIBILIDADE ESTRUTURAL das proteínas que constituem os vírus exerce um papel fundamental no processo de infecção viral. Para isso, propomos um estudo dirigido, dividido em duas partes, no qual usaremos dois exemplos de vírus bem diferentes: o poliovírus, vírus causador da poliomielite e o HIV, o vírus que causa a síndrome da imunodeficiência adquirida humana, a AIDS. A partir da análise de uma série de experimentos realizados por cientistas dedicados a estudar os vírus, você vai compreender como as proteínas virais funcionam mediando o processo de entrada dos vírus em suas células hospedeiras. Durante a sua leitura, não deixe de acessar o Tema 3 no Fórum de seu pólo, disponibilizado em nossa Plataforma. Vocês devem ler cuidadosamente as informações que fornecemos e discutir cada uma das perguntas do estudo dirigido que se segue. Sempre que necessário, peça ajuda ao tutor. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção 1ª PARTE – A ENTRADA DE UM VÍRUS NÃO-ENVELOPADO NA CÉLULA No final da aula passada, mencionamos a família Picornaviridae, que contém uma série de patógenos de grande importância médica e veterinária. Dentre eles, podemos citar o poliovírus, vírus que causa a poliomielite; o vírus da hepatite A; o vírus da febre aftosa e o rinovírus, que causa o resfriado. Vamos analisar o nome desta família de vírus: O nome “picornavírus” combina duas características destes vírus: o seu pequeno tamanho (pico = unidade de medida equivalente a 10-12), e o tipo de ácido nucléico que constitui o seu genoma, o RNA. O capsídeo dos picornavírus é composto por três proteínas estruturais, que se organizam seguindo a simetria icosaédrica que você aprendeu na aula passada. Essas proteínas chamam-se VP1, VP2 e VP3 e estão diretamente expostas ao meio externo, uma vez que esse grupo de vírus não é envelopado. Existe também uma quarta proteína, VP4, que se localiza “por dentro” do capsídeo, sempre embaixo da VP1. Veja um esquema da estrutura do capsídeo dos picornavírus na Figura 1: Figura 1: O capsídeo dos picornavírus apresenta simetria icosaédrica e é formado pelo arranjo de três proteínas diferentes: a VP1, a VP2 e a VP3. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção No início dos anos 1950, já havia vários grupos de pesquisa estudando os picornavírus, em especial o vírus da poliomielite. Estudos desses grupos mostraram que esse vírus apresentava TROPISMO bastante definido por determinados tecidos do indivíduo infectado. In vivo, o poliovírus se multiplicava principalmente em células do sistema nervoso central, podendo infectar também células do intestino e da faringe. Algumas questões bastante intrigantes em relação a estes vírus eram: Como ele identifica a célula hospedeira? Como “sabe” que aquela célula é uma célula do sistema nervoso, e não de qualquer outro tecido? Como é capaz de interagir com determinadas células e não com outras? 1ª questão Com o objetivo de testar quais fatores estavam envolvidos nesse tropismo, um cientista chamado J. J. Holland mediu em 1961 a adsorção (ligação) de dois tipos de vírus da pólio a vários tecidos. (Você está confuso com a expressão “dois tipos de vírus”? Então veja o boxe “O que são tipos de vírus?”) Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Voltando a J. J. Holland, o experimento que ele fez foi assim: colocou os vírus da pólio em contato com células de diversos tecidos. A alguns desses tecidos ele aplicou um dos três tratamentos listados a seguir (esses três tratamentos têm em comum o fato de que desestabilizam a estrutura terciária de proteínas): - aqueceu a 60oC por 15 minutos; - colocou em contato, por um determinado período (incubou), com tripsina – uma enzima que quebra proteínas; - incubou com uréia 8M. Os resultados obtidos por J. J. Holland estão na Tabela 1. Tabela 1: Adsorção do poliovírus em diversos tecidos. Observando os resultados obtidos, preste atenção no que ocorria (1) quando o tecido era aquecido, (2) quando era incubado com tripsina (tripsinizado), (3) quando era incubado com uréia (um agente desnaturante de proteínas). Agora, discuta as informações com seus colegas e proponha uma causa para o tropismo do vírus (folha de papel à parte). E aí? Conseguiu? Então, passe para a próxima questão. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção 2ª questão Ainda estudando a ligação do poliovírus nas CÉLULAS SUSCETÍVEIS, outros pesquisadores – Wolfgang K. Joklik e James E. Darnell Jr., descobriram, em 1961, que quando colocavam os poliovírus em contato com as células, uma grande quantidade das partículas virais (cerca de 90%) se soltava das células e não era mais capaz de infectar novas células. Apesar de, à primeira vista, parecer que essas partículas virais que se soltavam eram vírus com algum defeito que os deixavam incapazes de infectar a célula, não era esse o caso. Essa grande quantidade de vírus se soltava porque, nas condições experimentais que os pesquisadores usaram, eles colocaram uma quantidade muito grande de vírus em relação à quantidade de células que eles usavam no experimento. Então, alguns vírus ligavam-se à célula, mas logo outro vírus se ligava no mesmo local, deslocando aquele primeiro. Com isso, por acaso, eles conseguiram isolar vírus em um estágio intermediário do processo de entrada e, então, puderam estudar o que ocorria durante a interação do vírus com a célula. Esses mesmos pesquisadores, e, posteriormente, outros grupos de pesquisa, observaram que uma série de mudanças ocorria nas partículas virais após seu contato com as células hospedeiras. Eles imaginaram que já que estas mudanças estruturais decorriam do contato do vírus com a célula, deveriam estar relacionadasao processo de entrada do vírus na célula. Por isso, resolveram caracterizá-las. Para fazer essa caracterização, eles usaram vírus que se soltaram das células após a ligação (vírus eluídos), e analisaram: • como se encontrava o RNA viral; • a densidade das partículas virais; • como estavam as proteínas dos vírus. A seguir, você poderá observar alguns dos resultados obtidos nesses estudos. Após interpretar todos os resultados, faça um resumo das características apresentadas pelas partículas eluídas. a. Análise do RNA viral: Com o objetivo de avaliar se houve perda do RNA do vírus durante a interação com a célula, os pesquisadores extraíram o RNA de vírus antes que este fosse colocado em contato com as células e de vírus após esta interação (Tabela 2). Tabela 2: Quantidade de RNA (em %) obtida da extração feita com vírus antes e depois do contato com as células susceptíveis. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção O que você percebe em relação aos percentuais? O resultado anterior fez com que eles resolvessem avaliar também o quanto este RNA dos vírus estava acessível, ou seja, sujeito à degradação. Eles fizeram isso medindo se ele podia ser digerido pela enzima RNASE, que era adicionada ao meio pelos cientistas. Os resultados dessas experiências está na Tabela 3. Tabela 3: Medida de sensibilidade das partículas virais à ação da RNAse Observando as duas tabelas, o que você pode concluir sobre o RNA dos vírus eluídos? Anote suas conclusões, para não se esquecer delas na hora de elaborar o resumo. b. Determinação da densidade das partículas: Lembra o que você estudou sobre densidade na Aula 2? Densidade é uma relação entre massa e volume de um corpo. Assim, se a densidade de um corpo aumenta, sua massa aumentou ou seu volume diminuiu, ou os dois aconteceram; se a densidade de um corpo diminui, sua massa diminuiu ou seu volume aumentou, ou os dois aconteceram. Os cientistas decidiram determinar a densidade do vírus, para ver se havia diferenças entre os vírus “normais” e os eluídos. Para isso, utilizaram uma técnica que envolve um gradiente de sacarose e marcação dos vírus com radioatividade. Calma, você já vai entender. • Gradiente de sacarose: A sacarose é um açúcar, e, como toda molécula desse tipo, se dissolve bem em água. Quando colocamos sacarose em água, fazemos com que a solução de sacarose formada seja mais densa do que a água pura. Quanto mais sacarose colocamos, mais densa fica a solução. Preparar um gradiente de sacarose nada mais é do que fazer duas soluções de sacarose com densidades diferentes (uma pouco densa e outra muito densa) e usar um aparelho que misture essas soluções pouco a pouco, enquanto a colocamos em um tubo. Esse misturador deixa passar primeiro a solução mais densa (com mais sacarose) para o fundo do tubo e, em seguida, vai misturando essa solução Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção com a menos densa – isso é um gradiente de densidade, feito com soluções de sacarose. A essa altura, você talvez esteja se perguntando como isso pode auxiliar no experimento. Muito simples! É no topo deste tubo que vamos colocar nossa amostra de vírus (um tubo para o vírus “normal”, outro para o vírus “eluído” e outro para uma amostra de vírus que foi previamente aquecida a 80ºC, um tratamento que leva à perda do RNA viral. Este último tratamento era um controle para confirmar se o RNA viral havia ou não se perdido durante o contato com a célula). Em seguida, colocamos este tubo em uma centrífuga capaz de rodar a velocidades muito altas (por isso é chamada ultracentrífuga). A força que a rotação exerce no líquido que está no tubo faz com que a amostra de vírus vá entrando no gradiente, até o ponto em que suas densidades (da amostra e de alguma parte do gradiente) se igualem. No final da centrifugação, retiramos os tubos e coletamos as amostras com todo o cuidado, para não as misturarmos. Se houver diferença nas densidades, saberemos analisando o material coletado. Mas... como se faz esse tipo de análise? • Marcação com radioatividade: A marcação com radioatividade é uma técnica utilizada para monitorar estruturas. Marcar o poliovírus com radioatividade nos permite detectar sua presença nas frações coletadas após a centrifugação do gradiente de sacarose. Isso porque há maneiras de se detectar a radioatividade que está associada ao vírus. Assim, a fração que contiver radioatividade será a mesma que contém o vírus. Observe os gráficos que mostram a contagem da radioatividade nas frações das amostras: Contagem de radioatividade nas frações coletadas dos tubos com gradiente de sacarose. (A) Amostras de vírus “normal”, (B) de vírus aquecido a 80ºC e (C) de vírus “eluído” marcadas com radioatividade foram aplicadas no topo de um gradiente de sacarose e submetidas à ultracentrifugação. Frações foram coletadas, do topo (t) ao fundo (b) de cada tubo e submetidas à contagem de radioatividade. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Analisando os resultados do experimento, o que você conclui em relação à densidade dos vírus eluídos e dos vírus “normais”? Como você chegou a essa conclusão? Anote esta conclusão para incluí-la no resumo posteriormente. c. Análise das proteínas virais: Amostras de vírus antes e depois da interação com a célula hospedeira foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. Essa técnica permite a separação e identificação das proteínas presentes em determinada amostra. O resultado obtido mostrou que a amostra antes do contato com as células apresentava as quatro proteínas virais, enquanto apenas três, VP1, VP2 e VP3, estavam presentes na amostra após o contato com as células. Quando foi analisado o meio de cultura onde as células foram incubadas com o vírus para obtenção do “vírus eluído”, observou-se a presença da VP4 neste meio. O que você conclui acerca do resultado deste experimento? Com base em tudo o que você analisou nos itens a, b e c, tente agora propor o que ocorre com o vírus após o contato com as células, fazendo um resumo das suas análises em uma folha de papel à parte. Após a discussão de todos estes experimentos, você deve ter chegado à conclusão de que a interação do poliovírus com a célula hospedeira se dá pela ligação do vírus a uma proteína desta célula. Esta proteína está presente na superfície das células susceptíveis à infecção e é o RECEPTOR CELULAR para este vírus. A interação do vírus com o receptor leva a uma série de mudanças no capsídeo viral. No final dos anos 1980, o receptor celular para o poliovírus foi identificado. Com isso, foi possível analisar a interação desse receptor com as partículas de poliovírus isoladamente. Os resultados foram idênticos àqueles obtidos com o “vírus eluído”, sugerindo que as modificações estruturais observadas nos experimentos que você analisou realmente ocorriam durante a infecção. Resumindo o que foi possível descobrir a partir dos experimentos... Após a interação do poliovírus com uma proteína na superfície da célula (seu receptor celular) ocorre a expansão do capsídeo, que, por isso, torna-se menos denso (aumenta de volume). Esta expansão permite que a proteína VP4, localizada no interior do vírus, seja exposta e se desligue do capsídeo viral. Com isso, o RNA viral, anteriormente protegido pelo capsídeo, torna-se mais acessível. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção O que se sabe atualmente A partir de todos estes resultados experimentais, hoje sabe-se que a interação do vírus com o receptorcelular induz a mudanças na conformação das proteínas que formam o capsídeo, cujos contatos se afastam, levando à sua expansão. Essa expansão explica a diminuição de densidade observada nos vírus após contato com a célula e, também, por que o RNA viral torna-seacessível à ação da RNAse. A expansão do capsídeo gera espaços por onde a enzima pode entrar. Note que na experiência mostrada no item “a” da 2ª questão do estudo dirigido, a enzima RNAse foi adicionada com o objetivo de testar o grau de exposição do genoma viral ao meio, o que não significa que o RNA viral seja, necessariamente, digerido ao entrar em contato com a célula. A proteína do capsídeo viral que interage com o receptor celular é a VP1. Quando a VP1 se liga ao receptor, ela sofre uma mudança de conformação, que resulta na exposição de uma região hidrofóbica. Essa região interage com a membrana da célula hospedeira e provoca a formação de um poro (um buraco) na membrana plasmática, que une o ambiente interno do vírus com o meio intracelular (Figura 2). Em seguida, ocorre a liberação da VP4 e, posteriormente, do RNA do vírus, por meio do poro. Figura 2: Esquema da inserção da VP1 na membrana celular, formação do poro e entrada da VP4 e do RNA viral na célula hospedeira. 2ª PARTE – A ENTRADA DO HIV EM SUAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS Acabamos de ver um exemplo de como as proteínas que formam o capsídeo de um vírus não- envelopado participam da infecção viral. Agora, vamos analisar um outro caso, em que, além da barreira protéica (o capsídeo), temos uma barreira lipídica (membrana) separando o genoma viral do meio externo. Este é o caso dos vírus envelopados. Por causa da presença da membrana lipídica, a infecção de células pelos vírus envelopados sempre envolve uma etapa de fusão de membranas, na qual a membrana viral se funde com uma membrana celular, sendo o capsídeo lançado no interior da célula. Mas como isso ocorre? De que forma a fusão de membranas está relacionada a este processo? Para você entender esta parte, nós usaremos como exemplo um vírus muito estudado nos últimos anos, o vírus da imunodeficiência humana, o HIV (para saber um pouco mais sobre esta doença, veja o boxe “AIDS – o mal sem cura ainda”). Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Vamos conhecer um pouco sobre esse vírus antes de começar a analisar os experimentos. Como é o HIV? O HIV pertence à família Retroviridae. Os retrovírus se carac-terizam por replicarem seu genoma, constituído de RNA, por meio da ação de uma enzima presente no próprio vírus, a transcriptase reversa. Esta enzima é capaz de produzir uma molécula de DNA a partir do RNA viral. Este DNA, então, pode ser inserido no genoma da célula hospedeira, onde será transcrito pelo sistema enzimático celular. Veja a estrutura do HIV na Figura 3. Figura 3: Estrutura esquemática (à esquerda) e imagem de microscopia eletrônica do HIV. O HIV é composto por um genoma de RNA que, em associação com a proteína NC, forma o nucleocapsídeo do vírus. Associada a esse nucleocapsídeo se encontra a enzima-chave para o processo de replicação do HIV, a transcriptase reversa (RT). Nucleocapsídeo e RT são abrigados no interior do capsídeo viral, formado pela proteína CA. Além disso, esse vírus apresenta um envelope lipídico. Entre o envelope e o capsídeo fica a proteína MA. Já inseridas no envelope e expostas para o meio externo, encontramos as glicoproteínas gp41 e gp120. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Como você pode ver na Figura 3, no vírus íntegro, o RNA viral está associado a várias cópias de uma proteína chamada NC (proteína do nucleocapsídeo), e este conjunto associa-se à transcriptase reversa (RT – Veja o boxe Uma enzima diferente...). Várias cópias de outra proteína, chamada CA (proteína capsídica), formam um capsídeo protéico ao redor do nucleocapsídeo (proteínas que estão associadas ao genoma). Uma bicamada lipídica proveniente da célula hospedeira forma a membrana viral, que, por sua vez, associa-se internamente à proteína MA (proteína de matriz). A membrana viral contém dois tipos de glicoproteínas em sua superfície: a gp41, uma proteína que atravessa a membrana do vírus (proteína transmembrana), e a gp120, uma proteína globular trimérica (ou seja, com três subunidades). As glicoproteínas da superfície do vírus são responsáveis pela interação da partícula viral com a célula hospedeira. Mas... quais são estas células? O tropismo do HIV O vírus da imunodeficiência humana (HIV) apresenta um tropismo seletivo por uma população de células que possuem em sua superfície uma proteína denominada CD4. Nessas células, o vírus se replica e produz EFEITOS CITOPÁTICOS. Clinicamente, a infecção pelo HIV pode resultar em uma progressiva perda numérica e funcional dos linfócitos T CD4+, uma população de linfócitos que apresenta a proteína CD4 em sua superfície. Vamos, agora, por meio das questões propostas a seguir, tentar compreender quais são os mecanismos moleculares envolvidos na entrada do HIV nas suas células hospedeiras. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção 1ª questão Alguns trabalhos realizados no ano de 1984 buscavam entender a razão do tropismo do HIV pelos linfócitos T CD4+. A Figura 4 mostra um dos resultados obtidos. Figura 4: Replicação do HIV (monitorada pela atividade da transcriptase reversa) em linfócitos previamente tratados com diferentes anticorpos. Cada curva representa a replicação viral em células previamente tratadas com os seguintes anticorpos: – anti-MHC de classe II, um complexo de histocompatibilidade presente em algumas células do sistema imunológico; – anti-”TNK-target”, uma proteína muito expressa em todos os linfócitos em cultura; – ou três anticorpos contra diferentes regiões da molécula de CD4. Fonte: adaptado de Klatzmann et al. (1984) Nature 312, 767-768. Neste experimento, os pesquisadores mediram a replicação do HIV em linfócitos T em cultura (crescidos em laboratório). A forma usada para quantificar a replicação do vírus foi a dosagem da atividade da transcriptase reversa (RT, enzima específica dos retrovírus) no meio de cultura. Observe o gráfico da Figura 4. O pesquisador que fez este experimento testou a atividade da RT em linfócitos tratados (incubados na presença de anticorpos) para diferentes moléculas desse tipo celular. Sabendo que o anticorpo forma um complexo com seu antígeno ao se ligar a ele, impedindo o seu funcionamento, interprete os resultados apresentados na Figura 4. Qual anticorpo ligado aos linfócitos afetou mais a transcriptase reversa? O que isso significa? Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção 2ª questão A infecção por HIV pode levar não só à morte dos linfócitos infectados, como também à formação de sincícios (células multinucleadas), devido à fusão das células infectadas com células não infectadas. Um outro trabalho, desenvolvido simultaneamente àquele que você discutiu na questão anterior, mostrou que não só a replicação viral, mas também a formação de sincícios, era inibida pelo tratamento das células com anticorpos anti-CD4. Veja os dados na Tabela 4. Tabela 4: Inibição, pelo uso de anticorpos, da formação de sincícios após a infecção de linfócitos T CD4+ com HIV. Anticorpos contra diversas moléculas da superfície de linfócitos foram utilizados para verificar a inibição da formação de sincícios, desencadeada pela infecção com o vírus HIV. ANTICORPO UTILIZADO INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO SINCÍCIO Anti-CD1 (Timócito cortical) 0 inibidos / 16 testados Anti-CD2 (Pan-T) 0 inibidos / 13 testados Anti-CD3 (Pan-T) 0 inibidos/ 11 testados Anti-CD4 (Linfócito T “helper”) 14 inibidos / 14 testados Anti-CD5 (Pan-T) 0 inibidos / 17 testados Anti-CD6 (Pan-T) 0 inibidos / 11 testados Anti-CD7 (Pan-T) 0 inibidos / 21 testados Anti-CD8 (Linfócito T citotóxico) 0 inibidos / 9 testados Anti-CD25 (Receptor de interleucina 2) 0 inibidos / 4 testados Anti-CD26 (Antígeno de ativação) 0 inibidos / 9 testados Fonte: Adaptado de Dalgleish et al. (1984). Nature 312, 763-767. Analisou a Tabela 4? A que conclusão você chega juntando as informações obtidas nas questões 1 e 2? 3ª questão Com o objetivo de avaliar qual componente viral interagia com o receptor celular dos linfócitos, pesquisadores fizeram o seguinte experimento: 1. Marcaram radioativamente as proteínas do HIV nos resíduos de metionina e cisteína (a marcação era feita nos enxofres presentes nesses aminoácidos); Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção 2. Incubaram linfócitos T CD4+ com o HIV-marcado por 30 minutos; 3. Arrebentaram (lisaram) as células com detergente para que todas as proteínas presentes no interior delas ficassem em solução – essa amostra se chama lisado celular; 4. Submeteram as proteínas das células infectadas à imunopre-cipitação (usar um anticorpo para separar as proteínas capazes de se ligar a esse anticorpo das outras proteínas presentes na amostra). Eles fizeram isso dividindo o lisado celular em três partes e colocando anticorpos diferentes em cada uma delas para precipitar suas proteínas. 5. Aplicaram as proteínas que precipitaram em cada uma das amostras em um GEL DE POLIACRILAMIDA para serem identificadas após eletroforese e auto-radiografia. Na eletroforese em gel de poliacrilamida, a amostra é aplicada em um gel e submetida a uma corrente elétrica. A corrente faz com que as proteínas migrem de acordo com suas cargas (que são a soma da carga líquida de todos os aminoácidos que a compõem); o gel, por sua vez, limita essa migração de acordo com o tamanho da proteína. Assim, uma proteína grande não poderá migrar por dentro da malha do gel tanto quanto uma proteína pequena. Você verá a proteína grande “na parte de cima” da imagem de um gel e, quanto mais para baixo na imagem, menor é a proteína. 6. Expuseram esse gel a um filme sensível à radioatividade (fizeram uma auto-radiografia). Se as proteínas virais, marcadas com radioatividade, tivessem sido precipitadas, eles as veriam na auto-radiografia. Veja o resultado que os cientistas obtiveram, na Figura 5: Figura 5: Auto-radiografia de amostras de células infectadas com HIV marcado radioativamente e submetidas à imunoprecipitação com diferentes anticorpos. Na coluna 1, você vê as proteínas precipitadas com anticorpo anti-CD4+; na coluna 2, aquelas precipitadas com ANTICORPOS POLICLONAIS anti-HIV; e, na coluna 3, aquelas precipitadas com IGG de humano não infectado. Os valores escritos à esquerda são referências de tamanho/massa das proteínas encontradas (em KDa – unidade de massa utilizada para as proteínas). Fonte: adaptado de McDougal et al. (1986). Science 231, 382-385. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Na coluna 1 da auto-radiografia, uma proteína de cerca de 100KDa de massa foi encontrada quando a imunoprecipitação da amostra de HIV-marcado e células foi realizada com um anticorpo anti-CD4+. Nessa imunoprecipitação, somente a proteína CD4+ e proteínas associadas a ela são precipitadas. Vale ressaltar que todas as proteínas que você vê na Figura 5 estão marcadas com radioatividade (você está vendo a auto-radiografia!), ou seja, você só vê as proteínas virais, que foram as únicas a serem marcadas. Na coluna 2, estão as proteínas que foram precipitadas com anticorpos capazes de detectar proteínas do HIV em geral (anticorpos policlonais anti-HIV). Na coluna 3, os cientistas colocaram proteínas precipitadas com anticorpos produzidos por um organismo que nunca esteve em contato com o HIV, ou seja, anticorpos que não são capazes de reconhecer nenhuma parte do HIV. O que você pode concluir a partir desses resultados? Que proteínas do vírus estão envolvidas na interação dele com a célula hospedeira? Interprete e comente os resultados obtidos. A metodologia empregada neste experimento é mais complicada do que aquelas usadas em outros experimentos analisados por você. Caso você não consiga entender os procedimentos e os objetivos de cada etapa, peça ajuda ao seu tutor. Comentário Leia após responder à 3ª questão. Como foi demonstrado neste último experimento, uma única proteína viral é capaz de interagir com a molécula CD4 presente na superfície das células – a proteína que pesa cerca de 100KDa. Os sítios de interação entre a proteína identificada no experimento relatado acima (posteriormente chamada gp120) e a molécula de CD4 foram identificados. Foi assim que o papel de CD4 como receptor para o HIV ficou bem estabelecido. 4ª questão Vamos, agora, analisar o papel da outra proteína da membrana do HIV, a gp41. Ela é uma proteína transmembrana, ou seja, ela atravessa a membrana do vírus, possuindo uma porção interna, um segmento inserido na membrana e uma porção externa ao vírus. No vírus íntegro, ela se encontra associada à gp120. Para muitos vírus envelopados estudados até agora, foram identificadas proteínas capazes de mediar o processo de fusão de membranas, necessário ao acesso do genoma viral ao interior da célula hospedeira. Estas proteínas foram chamadas proteínas de fusão. Elas apresentam um segmento responsável pela fusão de membranas, chamado peptídeo de fusão. A análise da seqüência de aminoácidos da gp41 levou à identificação de uma porção hidrofóbica, bastante semelhante aos peptídeos de fusão de outras proteínas virais. Observe a Figura 6 um modelo esquemático desta proteína. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Figura 6: Esquema da proteína gp41 do vírus HIV. A barra representa a proteína inteira. N-34 e C-28: duas regiões de α-hélice presentes na estrutura da proteína. Domínio: porção interna (região que fica dentro do vírus). Considerando o que dissemos sobre o processo de entrada na célula de um vírus envelopado –, que você viu sobre a ligação do HIV na célula hospedeira e a estrutura da gp41 na Figura 6 –, como deve ser a entrada do HIV nos linfócitos T CD4+? Proponha um modelo para a fusão de membranas mediada pelo HIV. Provavelmente, você propôs um modelo de entrada na célula que envolvia a participação dos receptores CD4, ligados à proteína gp120. De alguma forma, a partir da ligação da gp120, a gp41 passa a participar do processo, mediando a fusão de membranas com seu peptídeo de fusão. Veja o esquema da Figura 7, a seguir. Figura 7: Interação do HIV com a célula hospedeira. A estrutura do HIV compreende duas proteínas expostas na sua superfície – a gp120 (representada por uma “nuvem”) e a gp41 (no esquema, parcialmente inserida na gp120). Quando a gp120 interage com a proteína CD4, ocorre uma mudança na sua conformação, que promove dois eventos: (1) o seu deslocamento para um co-receptor, uma molécula chamada CCR5 e (2) a exposição do peptídeo de fusão da gp41, que se liga imediatamente à membrana da célula. Mudanças na conformação da gp41 fazem com que o envelope viral se aproxime da membrana plasmática. Essa aproximação mediada pelo peptídeo de fusão provoca a fusão da membrana do vírus com a membrana da célula, fazendo com que o vírus entre na célula. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção O esquema mostra o processo de entradado HIV em uma célula suscetível. O vírus interage com a molécula de CD4 por meio de sua proteína de superfície gp120. Uma outra proteína presente na membrana da célula hospedeira, chamada co-receptor, associa-se ao complexo formado pela gp120 e o CD4, promovendo a remoção da gp120. Com isso, a porção hidrofóbica da gp41, anteriormente escondida pela gp120, fica exposta e insere-se na membrana da célula. Uma nova mudança conformacional na gp41 leva à aproximação da membrana viral com a membrana celular, que se fundem. Assim, o conteúdo interno do vírus é lançado no citoplasma, e o vírus pode se replicar! Para complementar seu conhecimento sobre a entrada de vírus envelopados nas células hospedeiras, dê uma olhadinha na Figura 8, que mostra um outro mecanismo de entrada desse tipo de vírus. Figura 8: Mecanismo de entrada do vírus influenza na célula hospedeira. Este vírus, causador da gripe, interage por meio da sua proteína HA, com uma molécula na superfície das células, chamada ácido siálico. Essa interação provoca o início de um processo de endocitose, em que o vírus entra na célula englobado por um pedaço da membrana plasmática dela. O endossoma (uma vesícula formada pela membrana da célula) com o vírus em seu interior é encaminhado em direção ao lisossoma, e o pH em seu interior vai diminuindo durante este trajeto. A diminuição do pH provoca a exposição do peptídeo de fusão do influenza, que promove a fusão da membrana do vírus com a membrana do endossoma, liberando o conteúdo do vírus no citoplasma da célula para que ele possa se replicar. Na Figura 8, você vê um outro exemplo bastante conhecido de entrada de um vírus envelopado em sua célula hospedeira: o do vírus influenza (causador da gripe). O vírus entra na célula por endocitose. A endocitose é um mecanismo de internalização de partículas pelas células. Resumidamente, o que ocorre neste caso é: o vírus é englobado pela membrana da célula e passa a se localizar em uma vesícula intracelular conhecida como endossoma. O meio presente no interior Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção deste compartimento celular torna-se ácido, o que induz a mudanças conformacionais na proteína viral, tornando-a capaz de mediar a fusão de membranas. O genoma viral é, assim, lançado no citoplasma. Em outras palavras, o que queremos mostrar é que este processo também ocorre por fusão de membranas, mas, neste caso, a mudança conformacional na glicoproteína de superfície viral ocorre não por interação com o receptor celular, mas devido a variações no pH no interior do endossoma. Todo o conhecimento adquirido durante anos de estudo sobre os vírus, seus processos de entrada na célula e de replicação no interior dela são fundamentais para que tenhamos, hoje, drogas antivirais disponíveis para o tratamento de doenças. É isso que vamos discutir na 5ª questão! 5ª questão No início dos anos 1990, diversos estudos utilizando peptídeos sintéticos de seqüência semelhante à região N34 da gp41 (volte à Figura 6 para rever esta região) forneceram resultados bastante interessantes. A região N34 é assim denominada por ser um segmento da região N-terminal da gp41 que contém 34 aminoácidos. Essa região representa um papel fundamental na fusão de membranas mediada pelo HIV. Analise a Figura 9. Neste experimento, a fusão de células induzida pelo HIV foi analisada na presença de concentrações crescentes de uma série de peptídeos derivados da região N-terminal da gp41. Figura 9: Quantificação da fusão de membranas mediada pelo HIV na presença de vários peptídeos sintéticos com seqüências semelhantes à N34. Fonte: Adaptado de Wild CT et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 9770-9774. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção Após analisar o resultado do experimento, responda: qual peptídeo foi capaz de inibir a fusão de membrana de forma mais eficaz? Um peptídeo capaz de inibir a fusão de membranas entre o vírus e a célula é um bom candidato a ser uma droga de combate à infecção por um determinado vírus. Como você deve ter percebido, o peptídeo DP-178 foi extremamente eficiente em inibir a fusão de membranas mediada pelo HIV. A droga anti-HIV mais conhecida é o AZT, um composto capaz de inibir a transcriptase reversa, enzima-chave da replicação deste vírus. No entanto, após um certo tempo de administração de AZT em um paciente contaminado com HIV, a droga passa a não fazer efeito, provavelmente porque, devido à alta taxa de mutação dos vírus, apareceu uma população insensível ao remédio. Por isso, pacientes portadores de HIV normalmente são medicados com um coquetel de remédios, a fim de evitar o desenvolvimento de resistência às drogas. Testes clínicos em humanos já foram realizados para a utilização do DP-178 (também chamado T-20) como mais um medicamento contra a AIDS para fazer parte do coquetel que mencionamos. CONCLUSÃO Os vírus, como você já sabe, são patógenos de grande importância. O que talvez você ainda não soubesse é como esses agentes causadores de doenças entravam nas suas células. Após o estudo dirigido, esperamos que você tenha percebido a importância do papel das proteínas no processo de infecção. Elas são as estruturas que medeiam a interação da partícula viral com a célula, quer se ligando a outras proteínas na superfície celular, quer interagindo com outras moléculas (como a proteína CD4, no caso do HIV, ou o ácido siálico, no caso do influenza) na superfície da célula para promover a infecção. Mais uma vez, vemos como o estudo das proteínas pode trazer informações importantes para o combate a doenças – como você viu explicitamente no caso do peptídeo de fusão DP-178, da última questão. Bioquímica I / As proteínas virais e seu papel na infecção
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