Aula 16 Luminescência Molecular instrumentação, interferências e quimiluminescência

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Química Analítica II
Luminescência Molecular
Instrumentação, interferências e 
quimiluminescência
Prof. Luis Rafael Bonetto
luis.bonetto@caxias.ifrs.edu.br
Fluorescência molecular; fosforescência e quimiluminescência.
• A fluorescência e a fosforescência são similares, no tocante
ao processo de excitação, que é feita por absorção de fótons.
Por esse motivo são frequentemente mencionados pelo termo
mais genérico fotoluminescência.
• A quimiluminescência está baseada no espectro de emissão
de uma espécie excitada que é formada no decorrer de uma
reação química.
Luminescência Molecular
Luminescência Molecular
Fluorescência
Fosforescência
Quimiluminescência
Teoria da fluorescência e fosforescência
Processo não-
radiativo que 
será favorecido 
se houver 
superposição 
dos níveis de 
energia
Estado triplete
Estados singlete
Processo não-radiativo que 
ocorre quando há 
superposição de níveis de 
energia
Luminescência Molecular
Instrumentos para medir fluorescência e fosforescência
• Os componentes dos instrumentos para medir a fotoluminescência
são similares àqueles encontrados nos fotômetros e espectrofotômetros
UV/Vis, com algumas pequenas diferenças:
• A fonte de radiação necessita ser mais intensa do que aquelas
utilizadas na absorção molecular, pois a magnitude do sinal de
saída é diretamente proporcional à potência da fonte (P0);
• A maioria dos equipamentos emprega a óptica de duplo feixe para
compensar flutuações na potência da fonte (maior
sensibilidade);
Luminescência Molecular
Lâmpadas:
• Vapor de Hg de baixa pressão com janela de sílica fundida. Fornece
linhas úteis para fluorescência em 254, 302, 313, 546, 578, 691 e
773 nm.
• Xenônio de alta pressão de 75 a 450 W. Fornece linhas em um
espectro contínuo de 300 a 1300 nm.
Luminescência Molecular
Fontes
Lasers:
• Lasers de corante sintonizáveis bombeados por laser de nitrogênio
pulsado ou laser Nd:YAG (neodímio dopado com ítrio alumínio
granada – Nd:Y3Al5O12). Emite em 1064 nm.
• São essenciais em análises de amostras muito pequenas (μL ou
menor), em sensoriamento remoto e para minimizar os efeitos
interferentes da fluorescência (radiação altamente monocromática).
Luminescência Molecular
Fontes
• A fluorescência emitida pela amostra se propaga em todas as
direções, mas o ângulo reto em relação ao feixe incidente é mais
conveniente para evitar perdas por espalhamento na solução e,
principalmente, nas paredes da cubeta.
Luminescência Molecular
Instrumentação básica de um 
espectrofluorímetro
Fonte de 
luz
Sistema 
óptico de 
excitação
Detector
Processador 
de sinal
Sistema 
óptico de 
emissão
Amostra
Lâmpada
Espalhamento
Monocromador
FotomultiplicadoraComputador
hν
exc.
hν
exc.
hν
exc.
hν
emiss.
Monocromador
Instrumentação básica
Espectrofluorímetros
Aplicações
• Os métodos de fluorescência e fosforescência são intrinsecamente
aplicáveis a faixas de concentrações mais baixas que as medidas
espectrofotométricas baseadas em absorbâncias e estão entre as
técnicas analíticas mais sensíveis facilmente disponíveis.
• Essa sensibilidade elevada vem do fato que F aumenta se a potência
da fonte P0 aumentar, ou então, pelo fato do sinal poder ser
amplificado posteriormente. A absorbância, por estar relacionada com
o logaritmo de P0/P, não se altera com o aumento de P0, pois o
aumento deste causa um aumento proporcional em P.
• Em contraste a alta sensibilidade, os métodos fotoluminescentes são menos
precisos e exatos que os métodos espectrofotométricos por um fator de 2 a 5.
Luminescência Molecular
Aplicações
• Análises de complexos de metais que não são de transição
(Ex: Al3+), geralmente incolores e que formam complexos também
incolores, são menos suscetíveis a processos de desativação. Estes não
poderiam ser determinados por absorção molecular no visível. Assim a
fluorimetria é complementar à absorção molecular.
• Os complexos dos metais de transição possuem muitos níveis de
energia pouco espaçados, favorecendo a desativação por conversão
interna e não por fluorescência.
Luminescência Molecular
Aplicações
• Reagentes fluorimétricos
Luminescência Molecular
Aplicações
Luminescência Molecular
8-hidroxiquinolina
(reagente para Al, Be e 
outros íons metálicos)
Alizarina granada R
(reagente para Al, F-)
Flavonol
(reagente para Zn e Sn)
Benzoína
(reagente para B, Zn, Ge e Si)
Desvios da linearidade
• Quando a concentração da espécie emissora é grande o suficiente
para que a absorbância seja maior que 0,05, a simplificação do termo
exponencial se torna inválida e a linearidade é perdida. (absorção
primária).
Luminescência Molecular
Efeito da concentração na intensidade de fluorescência
• A potência de emissão de fluorescência F é proporcional à potência
radiante do feixe de excitação que é absorvido.
F = K´(Po – P)
• Escrevendo a lei de Beer, P / Po = 10
-εbc, onde e é absortividade
molar das moléculas fluorescentes
F = K´(Po - Po 10
-εbc) = K´Po(1 - 10
-εbc)
• O termo exponencial pode ser expandido e posteriormente
simplificado. Considerando A < 0,05, o resultado passa a ser
F = 2,303K´εbcPo. 
• Como εb é constante e é possível manter Po também constante, o
resultado final passa a ser: F = Kc
Luminescência Molecular
Como A > 0,05, o resultado não pode se aproximado para
F = 2,303K´εbcPo. 
•E com isso,
F = Kc
Luminescência Molecular
Não se aplica !!!
Desvios da linearidade
• Dois outros fatores também causam desvios negativos da
linearidade:
• Autossupressão
• Colisões entre moléculas excitadas provocam a transferência de energia
não-radiativa de um modo semelhante à transferência para moléculas do
solvente na conversão externa.
• Absorção secundária (inclui a autoabsorção)
• Ocorre quando emissão coincide com algum absorção. O resultado é a
reabsorção da radiação por quaisquer moléculas na solução.
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Supressão dinâmica 
• Também chamada de supressão colisional, necessita do contato
entre as espécies excitadas e um agente supressor. O mecanismo
não é muito bem compreendido.
• A concentração do agente supressor deve ser suficientemente alta para que
haja uma alta probabilidade de colisão entre as espécies excitada e de
supressor durante o tempo de vida do estado excitado.
• A presença de O2 dissolvido geralmente reduz a intensidade da
fluorescência por promover o cruzamento intersistema. Entretanto, também
pode promover a supressão do estado triplete, reduzindo também a
fosforescência.
• A fluorescência do sulfato de quinino é suprimida por altas concentrações
de íons cloreto.
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Supressão estática
• Neste caso, o supressor forma com o analito fluoróforo um 
complexo chamado de complexo escuro.
M + L ⇌ ML
Molécula 
fluorescente
Complexo 
não- fluorescente
supressor
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Uma vez que a emissão de fluorescência F é diretamente
proporcional à eficiência quântica Φ, se a supressão depender de um
único supressor, após alguma manipulação nas equações do sistema,
obtém-se:
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060
F
[Cl-]
y = 209,9462x + 1,0092
R² = 0,9999
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000
12,0000
14,0000
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060
F
o/F
[Cl-]
[Sup]K1
F
F
q
0 
onde F e Fo são os sinais de fluorescência na presença e ausência 
do supressor e Kq a constante de supressão
Supressão da fluorescência do sulfato de quinino por Cl-.
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
A aplicação da quimiluminescência à Química Analítica é
relativamente recente. O número de reações químicas que produz
quimiluminescência é pequeno, limitando assim o método.
• A quimiluminescência é produzida quando uma reação química
fornece uma espécie excitada eletronicamente que emite luz
quando retorna ao estado fundamental;
• A bioluminescência é a quimiluminescência que ocorre em
sistemas biológicos. Os exemplos mais conhecido são os vaga-
lumes e as águas-vivas;
• A instrumentação para medidas de quimiluminescência é
notavelmente simples. É necessário um sistema fechado com
apenas um tubo fotomultiplicador.
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
• A utilização do luminol para detecção de sangue em uma cena de
crime baseia-se a reação do luminol com H2O2 em meio alcalino
catalisada pelo ferro presente hemoglobina;
• Dentro de certos limites, a intensidade de quimiluminescência do
luminol é diretamente proporcional à concentração do oxidante, do
catalisador ou do luminol;
• Os métodos de quimiluminescência em geral são altamente sensíveis
porque níveis baixos de luz podem ser detectados na ausência de
ruído. Não há atenuação da radiação em monocromadores ou filtros.
Com isso limites de detecção na faixa de partes por bilhão (ppb) ou
partes por trilhão (ppt) podem ser alcançados.
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
luminol íon 3-aminoftalato
Luminescência Molecular
Questões para revisão
1) Quais as diferenças das fontes para os espectrofluorímetros em
comparação àquelas para espectrofotometria UV-Vis? Quais os tipos
de fontes disponíveis em espectrofluorímetros?
2) Qual é o esquema básico de instrumentação EFM?
3) Explique por que, na maioria dos fluorímetros, o detector
normalmente encontra-se disposto a 90° em relação à luz incidente?
4) Quais são as principais aplicações da fluorescência?
Questões para revisão
5) Quais são os quatro principais reagentes fluorimétricos? Represente
suas estruturas moleculares e diga para qual(is) elementos cada um é
recomendado.
6) Quais os principais tipos de desvios da linearidade podem ocorrer na
fluorescência? Explique sumariamente cada um deles.
7) Como a quimiluminescência é produzida?
8) Por que os métodos de quimiluminescência são bastante sensíveis?
Como ficam os limites de detecção nessa técnica?
Referências
HARRIS, Daniel C. Análise química quantitativa. 8.ed. Rio de Janeiro: 
LTC,2012.
OHLWEILER, Otto Alcides. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: 
LTC, 1974. Vol 2. 643 p.
SKOOG, Douglas A.; HOLLER, F. James; NIEMAN, Timothy A. Princípios de 
análise instrumental. 5.ed. Porto Alegre, RS: Bookman, 2002. xv, 840 p.
SKOOG, Douglas A. et al. Fundamentos de química analítica. São Paulo: 
Thomson, 2006. xvii, ca 1085 p.