Resumo OGM

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Engenharia Genética 
 
 
 
Matéria 1º teste 
 
 
 
 
 
 
1º Semestre - 2010/2011 
 
3º ano - Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica 
Instituto Superior Técnico 
 
 
 
 
Baseado nas aulas e nos livros Principles of Gene Manipulation and Genomics 
e Gene Cloning and DNA analysis 
 
 
Resumo por Inês Amorim 
 
 
 
 
 
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Índice 
 
Potenciais benefícios da Biotecnologia/Engenharia Genética .................................................................................. 5 
Potenciais problemas e consequências da Biotecnologia/Engenharia Genética ...................................................... 5 
Técnicas fundamentais de manipulação genética ..................................................................................................... 5 
Principais passos na clonagem de um gene .............................................................................................................. 6 
Vectores de clonagem: plasmídeos e bacteriófagos ................................................................................................. 6 
Plasmídeos ............................................................................................................................................................. 6 
Classificação de plasmídeos............................................................................................................................... 7 
Gama de hospedeiros ........................................................................................................................................ 7 
Bacteriófagos ......................................................................................................................................................... 8 
Fago λ ................................................................................................................................................................. 8 
Fago M13 ............................................................................................................................................................... 9 
Preparação de DNA ................................................................................................................................................. 10 
DNA total de bactérias ......................................................................................................................................... 10 
DNA plasmídico – lise alcalina ............................................................................................................................. 10 
DNA fago λ ........................................................................................................................................................... 11 
DNA fago M13 ..................................................................................................................................................... 11 
Manipulação de DNA purificado.............................................................................................................................. 11 
Nucleases ............................................................................................................................................................. 12 
Polimerases.......................................................................................................................................................... 12 
Enzimas que actuam nas extremidades .............................................................................................................. 13 
Endonucleases de Restrição ................................................................................................................................ 13 
Nomenclatura .................................................................................................................................................. 14 
Tipos de endonucleases ................................................................................................................................... 14 
Tipos de extremidades .................................................................................................................................... 15 
Digestão de restrição in vitro ............................................................................................................................... 15 
Construção de um mapa de restrição ............................................................................................................. 16 
Ligases e ligação de DNA ..................................................................................................................................... 16 
Introdução de DNA em células vivas ....................................................................................................................... 17 
Técnicas de introdução de DNA em bactérias ..................................................................................................... 18 
Transformação ................................................................................................................................................. 18 
Electrotransformação (ou electroporação) ..................................................................................................... 19 
Conjugação bacteriana .................................................................................................................................... 20 
3 
 
Conjugação Triparental.................................................................................................................................... 20 
Conjugação Biparental ..................................................................................................................................... 21 
Introdução de fagos em bactérias ....................................................................................................................... 21 
Transfecção ...................................................................................................................................................... 21 
Introdução de DNA em organismos eucariotas ................................................................................................... 21 
Introdução de DNA em Saccharomyces cerevisae........................................................................................... 21 
Introdução de DNA em células animais ........................................................................................................... 22 
Introdução de DNA em células vegetais .......................................................................................................... 23 
PCR – Polymerase Chain Reaction ........................................................................................................................... 24 
Passos da PCR ...................................................................................................................................................... 24 
Material necessário ......................................................................................................................................... 24 
Design de primers ............................................................................................................................................ 25 
Produtos de PCR .............................................................................................................................................. 26 
Vectores de clonagem para E. coli ........................................................................................................................... 27 
Plasmídeos ...........................................................................................................................................................27 
Vectores de clonagem baseados no fago M13 ........................................................................................................ 29 
Vectores de clonagem baseados no fago λ ............................................................................................................. 31 
Bibliotecas genómicas ............................................................................................................................................. 32 
Vectores de clonagem para leveduras .................................................................................................................... 32 
YEps – Plasmídeos epissomais de levedura ............................................................................................................. 33 
Outros plasmídeos para levedura ....................................................................................................................... 33 
YACs – cromossomas artificiais de levedura ........................................................................................................... 34 
Processo de clonagem com pYAC3: ................................................................................................................. 34 
Vectores de clonagem para plantas superiores ...................................................................................................... 35 
Vectores de clonagem para insectos ....................................................................................................................... 35 
Obtenção de clones para genes específicos ............................................................................................................ 36 
Processo de preparação do cDNA: ...................................................................................................................... 36 
Hibridação de Southern ....................................................................................................................................... 37 
Mutagénese aleatória .............................................................................................................................................. 39 
Mutantes de eliminação em bactérias ................................................................................................................ 40 
Mutantes de inactivação por inserção ................................................................................................................ 43 
Mutantes de eliminação em S. cerevisae ............................................................................................................ 43 
RNA de interferência – iRNA.................................................................................................................................... 44 
Mutagénese dirigida ................................................................................................................................................ 45 
4 
 
 
 
5 
 
Engenharia Genética 
Potenciais benefícios da Biotecnologia/Engenharia Genética 
 Diagnósticos e tratamentos mais precisos; 
 Melhoramento de colheitas e da sua resistência a doenças e stress ambiental; 
 Produção de químicos, enzimas, aditivos alimentares, medicamentos, polímeros, etc; 
 Eliminação de poluentes e resíduos. 
Potenciais problemas e consequências da Biotecnologia/Engenharia Genética 
 Organismos perigosos para outros organismos ou para o ambiente; 
 Redução da biodiversidade genética natural de organismos; 
 Possível uso da Eng. Genética em humanos; 
 Pouca disponibilidade nos países mais pobres; 
 Sobreposição da procura de lucros à procura livre de conhecimento. 
 
Gene: fragmento de DNA que codifica para uma determinada proteína. 
DNA recombinado: qualquer molécula de DNA criada artificialmente que conjuga sequências de DNA que 
geralmente não se encontram juntas na natureza. 
Manipulação genética: qualquer técnica utilizada para a criação de DNA recombinado. 
Clonagem: replicação de DNA recombinado no interior de um organismo hospedeiro de modo a produzir várias 
cópias da mesma sequência. 
Técnicas fundamentais de manipulação genética 
 Plasmídeos e bacteriófagos; 
 Preparação de DNA a partir de células vivas; 
 Manipulação de DNA purificado; 
 Vectores de clonagem para diferentes organismos; 
 Métodos de selecção de clones. 
 
6 
 
Clonagem de genes 
 
Vectores de clonagem: moléculas de DNA às quais podem ser adicionados fragmentos de DNA exógeno. Têm 
capacidade de replicação – são geralmente replicões, tendo apenas uma origem de replicação. 
Principais passos na clonagem de um gene 
 Gerar ou isolar um fragmento de DNA; 
 Inserir o fragmento num vector de clonagem; 
 Introduzir o vector numa célula hospedeira e replicá-lo; 
 Seleccionar as células que contém o fragmento. 
Vectores de clonagem: plasmídeos e bacteriófagos 
 
Características dos vectores de clonagem: 
 Sofrem replicação na célula hospedeira (necessitam por isso de uma origem de replicação para que 
sejam produzidas várias cópias do DNA recombinado (DNA de interesse)) *; 
 São relativamente pequenos (< 10 Kb), uma vez que as moléculas grandes tendem a quebrar durante a 
purificação; 
 Têm marcadores de selecção (como genes de resistência a antibióticos) que permitem seleccionar os 
organismos que contém o gene clonado. 
* têm de ser replicativos na célula onde se vai realizar a clonagem. 
 
Plasmídeos 
 Moléculas de DNA circular (geralmente em cadeia dupla) que têm uma existência independente na 
célula (não fazem parte do cromossoma e replicam-se independentemente). 
 Existem essencialmente em bactérias (nos eucariotas só foram identificados em leveduras). 
 Contêm um ou mais genes responsáveis por características úteis às células (embora não contenham 
genes essenciais). Podem conferir resistência a antibióticos, factores de fertilidade, produção de compostos 
xenobióticos, degradação de toxinas, etc. 
 
Estas características são importantes quando as bactérias/células se encontram sob pressão selectiva (i.e. meio 
com antibiótico). Caso contrário apenas atrasam o crescimento do organismo devido ao peso metabólico 
adicional do plasmídeo – tornam-se uma desvantagem. 
 
 
7 
 
Classificação de plasmídeos 
 
Plasmídeos conjugativos: contém os genes tra, que sintetizam o pilus sexual das bactérias e outras estruturas 
necessárias à conjugação. 
Plasmídeos mobilizáveis: contém genes mob e são capazes de transferir cópias de si próprios (por conjugação) 
para outras células. 
Plasmídeos autotransmissíveis: simultaneamente conjugativos e mobilizáveis (tra+mob+). 
Plasmídeos integrativos (epissomas): podem existir sob a forma circular ou integrados no cromossoma. A 
integração depende do factor F. Têm um número de cópias definido. 
Plasmídeos não integrativos: mantêm-se sempre no citoplasma, independentes do cromossoma. Têm um maior 
número de cópias. 
São os mais usados: produzem um maior número de cópias e não são integrados no cromossoma – não se 
“perdem” e não transferem características para o genoma da célula, o que pode ser prejudicial (i.e. proliferação 
de resistência a antibióticos). 
O número de cópias de um plasmídeo presente numa bactéria varia (desde apenas 1 até mais de 100). 
Para efeitos de clonagem preferem-se plasmídeos que apresentem múltiplas cópias de modo a que se possa 
obter a maior quantidade possível da molécula recombinada. 
A capacidade de plasmídeos diferentes coexistirem na mesma célula, em simultâneo, prende-se com a 
sua compatibilidade. Diz-se que dois plasmídeos são incompatíveis se da sua interacção resulta a destruição de 
um deles. Geralmente plasmídeos compatíveis têm mecanismos de replicação diferentes. 
Podemdefinir-se grupos de incompatibilidade que englobam plasmídeos incapazes de coexistir na 
mesma célula. São mutuamente incompatíveis. 
 
Gama de hospedeiros 
 
A origem de replicação de um plasmídeo determina a sua gama de hospedeiros, i.e., os tipos de 
hospedeiros em que pode ser replicada. 
Vasta gama de hospedeiros: ori codifica a maioria das proteínas necessárias à replicação e a região promotora e 
os ribossome binding sites (RBS) são reconhecidos por uma grande diversidade de bactérias - plasmídeos 
promíscuos. 
Baixa gama de hospedeiros: replicam-se em poucos tipos de bactérias. 
 
 
8 
 
Bacteriófagos 
 
Bacteriófagos são vírus que infectam especificamente bactérias. Têm uma estrutura simples que 
consiste numa molécula de material genético (geralmente DNA) rodeada por uma cápside (cápsula). 
Podem ser de dois tipos: 
 Head and tail: DNA linear de cadeia dupla. I.e. fago λ: infecta E.coli. 
 Filamentoso: DNA circular em cadeia simples. I.e. fago M13: infecta bactérias com pilus sexual. 
 
Fago λ 
DNA linear, cadeia dupla. Infecta E.coli ~ 48,5 Kb 
 
Ciclo lítico: ciclo de vida dos bacteriófagos no qual, findo o processo de infecção, as células lisam. 
1) Fago adere à parede celular da bactéria e injecta o seu DNA; 
2) DNA exógeno utiliza os recursos da célula para se replicar; 
3) A transcrição e tradução das proteínas codificadas pelo fago leva à síntese da sua cápsula; 
4) DNA replicado é encapsulado, a célula hospedeira lisa e novos fagos são libertados para o meio. 
Ciclo lisogénico: ciclo no qual um bacteriófago se insere no genoma das células que infecta e se mantém na 
forma de pró-fago. 
1) Fago adere à parede da bactéria e injecta o seu DNA; 
2) DNA circulariza no interior da célula; 
3) DNA circular é integrado no cromossoma e forma um pró-fago. Mantém-se no genoma por indefinidas 
gerações, sem manifestar as suas características, e é replicado juntamente com o genoma. 
4) Em situações de stress o fago é excisado do cromossoma, passando a estar de novo na forma circular. 
Em condições normais, uma proteína repressora impede que o fago (integrado no cromossoma) seja activado. 
Quando uma molécula está sob stress (UV, falta de nutrientes, etc) o repressor torna-se instável e desprende-se 
do DNA, permitindo a transcrição do fago – vai entrar em ciclo lítico. 
5) Célula entra em ciclo lítico e são produzidos novos fagos. 
 
Em cada extremidade 5’ do fago λ há projecções de 12 nucleótidos que formam sequências 
complementares que permitem a circularização da molécula de DNA. A essas zonas chama-se locais cos. 
São importantes aquando da infecção da bactéria (para a circularização) e também durante o ciclo lítico, pois 
intervêm no processo de multiplicação do genoma do fago. 
 
 
9 
 
Método do círculo rolante: método de replicação do genoma do fago 
 
 O fago está sob a forma circular. Replicação tem início na região DSO – double-strand origin. O DNA 
sofre clivagem e a cadeia 3’ serve de primer para a polimerase poder actuar. A cadeia complementar vai sendo 
sintetizada e cresce como uma única molécula contendo muitas cópias do fago. 
 Na longa cadeia simples são reconhecidos os locais cos e uma endonuclease cliva aí o DNA, dando 
origem a várias moléculas do genoma do fago. 
 
Fago M13 
DNA circular, cadeia simples. Infecta bactérias com pilus sexual ~ 6,5 Kb 
 
Ciclo de infecção: é um ciclo não lítico nem lisogénico. 
1) Fago liga-se a um receptor nas células (o pilus sexual) e injecta o seu DNA. 
2) DNA em cadeia simples é convertido em DNA de cadeia dupla. Passa a funcionar como se fosse um 
plasmídeo. 
3) DNA é replicado através do método círculo rolante (produz fragmentos lineares). 
4) São transcritas e traduzidas as proteínas do fago. 
5) DNA recircularizado é introduzido na cápside e o fago completo é libertado para o meio extracelular. 
Não se conhece bem o processo de libertação do fago. 
 
Há medida que a célula se replica o M13 passa entre progenitores e descendentes, sendo transmitido entre 
gerações. 
Não ocorre lise das células pelo que o fago M13, após infecção de uma bactéria, pode ser aí replicado 
indefinidamente. Pelo facto de não ocorrer lise é difícil identificar quais as células infectadas. Pode verificar-se 
um crescimento mais lento devido ao peso metabólico extra acarretado pela presença do fago. 
 
Importância do M13 como vector de clonagem 
 Genoma pequeno (< 10 Kb); 
 A sua forma replicativa em cadeia dupla (existente no interior da célula) funciona como um plasmídeo; 
 É facilmente preparado a partir de uma cultura de E.coli infectadas; 
 Pode ser reintroduzido nas células; 
 Genes clonados usando um vector M13 podem ser obtidos na forma de cadeia simples de DNA, útil para 
a sua sequenciação e mutagénese in vitro. 
 
 
10 
 
Preparação de DNA 
 
DNA total de bactérias 
 
 Crescer as células em meio nutritivo apropriado; i.e. meio LB 
 Centrifugar e retirar sobrenadante; elimina-se o meio de crescimento 
 Prover lise das células: 
 Lisozima: degrada peptidoglicanos; (componentes da parede celular bacteriana) 
 SDS (detergente): destrói os lípidos e lisa a célula; (destrói a membrana celular) 
 Purificar os ácidos nucleicos: 
 Métodos enzimáticos (RNAses, proteases); 
 Fenol (desnatura/precipita proteínas); 
 Centrifugar – forma-se uma fase orgânica e uma fase aquosa (remover esta fase); 
 Precipitar DNA utilizando álcoois; 
 Suspender DNA. 
 
DNA plasmídico – lise alcalina 
 
 Crescer as células em meio apropriado; 
 Lisar as células: 
 Lisozima; 
 EDTA; promove agregação de iões metálicos e co-factores das DNAses, diminuindo a sua 
actividade. Estas enzimas são responsáveis pela degradação do DNA após a lise. Também 
destabiliza a membrana. 
 25% sacarose. Aumenta a pressão osmótica e atrasa a lise celular. 
 Desnaturar DNA: (genómico e plasmídico) 
 NaOH; aumenta o pH (~11/12) e leva à desnaturação de todo o DNA; 
 Renaturar DNA plasmídico: 
 Ácido acético; baixa o pH (~4) muito rapidamente e leva à renaturação do DNA como o 
processo é muito rápido só o DNA plasmídico, que tem menores dimensões, consegue 
renaturar. O DNA cromossómico precipita e o DNA plasmídico fica em solução. 
 Purificar o DNA: 
 Clorofórmio; “limpa” a solução. 
 Precipitar DNA plasmídico: 
 Isopropanol. 
 
 
 
 
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DNA fago λ 
 
 Cultivar células inoculadas pelo fago; 
 Induzir ciclo lítico; para multiplicar o fago. 
 Centrifugar – fago fica no sobrenadante; pois é muito leve. O sedimento tem como constituição os 
resíduos das bactérias. 
 Remover suspensão de fagos; 
 Adicionar polímero de polietilenoglicol; remove a água da superfície do fago e permite a formação de 
agregados maiores, que já precipitam quando centrifugados. 
 Centrifugar e rejeitar sobrenadante. 
 
DNA fago M13 
 
 Cultivar as células inoculadas pelo fago; 
 Extracção por lise alcalina; quando já está no interior da célula, o fago tem um comportamento 
semelhante a um plasmídeo. 
 Fago isolado (exterior da célula); 
 Remover cápsula: 
 Fenol; precipita as proteínas. 
 Remover H2O; formam-se duas fases (aquosa com DNA M13 e fenol) separadas por proteínas. 
 Adicionar etanol; precipita DNA. 
 Centrifugar. DNA M13 forma precipitado. 
 
Manipulação de DNA purificado 
 
Os fragmentos de DNA (obtidos por diversos métodos) nem sempre estão adaptados aos vectores nos 
quais vão ser clonados, pelo que podem necessitar de ser modificados. Essas modificações incluem: 
 Diminuição/aumento do seu tamanho; 
 Cópia em novas moléculas de DNA; 
 Adição/remoção de grupos específicos; 
 Modificações de extremidades. 
Muitas destas técnicas de manipulaçãofazem uso de enzimas existentes naturalmente nas células e que 
foram purificadas e apuradas para serem utilizadas in vitro. De entre essas enzimas destacam-se: 
 Nucleases (endonucleases, exonucleases); 
 DNA polimerases; 
 Enzimas que actuam nas extremidades; 
 Endonucleases de restrição; 
 Ligases. 
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Nucleases 
 
Nucleases (RNAses, DNAses): degradam ácidos nucleicos através da quebra de ligações fosfodiésteres entre 
nucleótidos. Fazem hidrólise da ligação entre um grupo fosfato e um grupo hidroxilo. 
Exonucleases: removem nucleótidos, um de cada vez, a partir das extremidades da molécula de DNA. Encurtam 
fragmentos. I.e. BAL 31. 
 Exonuclease III: só actua em pontas cegas e só digere uma das cadeias. 
Endonucleases: quebram ligações internas (corte aleatório) na cadeia de DNA. Obtém-se fragmentos de vários 
tamanhos. I.e. S1, cliva cadeias simples. 
 DNAse I e desoxirribonuclease I: cortam cadeias simples ou duplas. 
Quando se utilizam nucleases in vitro tem que se ter atenção ao tempo de incubação pois estas enzimas são 
inespecíficas e degradam todo o DNA indiferentemente. 
DNAse I actua apenas em moléculas de DNA pelo que é bastante útil quando se quer obter apenas RNA. 
 
Polimerases 
 
Polimerases sintetizam novas cadeias de DNA complementares a cadeias de DNA/RNA molde (cadeias 
simples pré-existentes). A maioria necessita de um primer (iniciador) – região de cadeia dupla onde se liga a 
enzima para iniciar a polimerização. 
Exemplos de polimerases usados em Engenharia Genética: 
DNA polimerase I: liga-se a pequenas zonas de cadeia simples (nicks) de moléculas maioritariamente de cadeia 
dupla. Sintetiza uma nova cadeia, no sentido 5’ – 3’, degradando a cadeia já existente à medida que avança – 
acumula função de exonuclease no sentido 5’ – 3’ (bifuncional). 
Em Eng. Genética isolou-se apenas a parte da pol I com actividade de polimerase, a que se chamou 
fragmento Knelow. Evita-se o desperdício de dNTP’s devido à actividade da nuclease. 
Usa-se frequentemente este fragmento para sintetizar extremidades de fragmentos e transformar 
extremidades coesivas em cegas, compatíveis com vectores de extremidades cegas. 
Polimerases deixam um nick no início da cadeia que sintetizam. Esse nick é corrigido por ligases. 
Taq polimerase provém do organismo Thermus aquaticus e é termoestável (resistente à desnaturação pelo 
calor), sendo a sua temperatura de ~70°C. É por isso usada em PCR. 
Tem a desvantagem de cometer 1 erro por cada 1000 nucleótidos. Podem usar-se outras enzimas 
termoestáveis e que são proofreading. Reconhecem e corrigem erros de replicação. Têm actividade de 
endonuclease 3’ – 5’. I.e.: Pfu (Pyrococcus furiosus), Pwo (Pyrococcus woosi) e Tma (Thermologa maritima). 
 
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Transcriptase reversa utiliza moldes de RNA para sintetizar DNA. Está envolvida na replicação de vírus 
(retrovírus, i.e. HIV) e é utilizada na técnica de DNA complementar (cDNA). 
Permite a clonagem de genes e a sua transferência de eucariotas para procariotas: a partir de RNA processado 
(já sem intrões) é sintetizada uma cadeia de DNA complementar. Essa cadeia simples pode ser então 
transformada em cadeia dupla de DNA, que agora contém o gene de interesse. 
 
Enzimas que actuam nas extremidades 
Estas enzimas actuam no DNA removendo ou adicionando grupos químicos específicos. 
 
Fosfatase alcalina remove grupos fosfato das extremidades 5’ de moléculas de DNA. É utilizada, por exemplo, 
para impedir que vectores de DNA digeridos por endonucleases de restrição voltem a recircularizar. 
Quando um vector é restringido a probabilidade deste recircularizar é superior à de ser inserido um fragmento 
de DNA – pois a inserção requer duas ligações e não apenas uma. Ao eliminar os fosfatos 5’ a enzima ligase 
deixa de poder actuar e o vector não recirculariza. O fragmento de DNA exógeno (não tratado) contém 
extremidades com fosfato e, portanto, consegue ligar-se a uma das cadeias do vector. Na outra cadeia fica um 
nick, mas ainda assim a molécula é suficientemente estável para entrar na célula hospedeira, onde os 
mecanismos de reparação da mesma vão corrigir o nick. 
Transferase terminal adiciona nucleótidos no terminal 3’ de uma molécula de DNA (actua no sentido 5’ – 3’). É 
muito utilizada para adicionar caudas de homopolímeros a moléculas de cDNA para poderem ser clonadas em 
vectores. 
Clonagem com extremidades coesivas é mais eficiente do que com extremidades cegas. Incuba-se o 
vector e o fragmento a inserir em meio contendo a enzima transferase terminal e um tipo de nucleótidos 
(nucleótidos complementares em cada meio). Vão ser sintetizadas caudas que funcionam depois como 
extremidades coesivas complementares – aumenta a eficiência de inserção. 
 
Endonucleases de Restrição 
 
Endonucleases de restrição reconhecem determinadas sequências de DNA e hidrolisam as cadeias nesse 
local, dando origem a dois fragmentos . DNA pode ser protegido da acção destas enzimas através de metilação. 
Não actuam em RNA e são sintetizadas, provavelmente, por todas as bactérias. 
 
Experiência, com fagos, que permitiu a identificação das endonucleases de restrição: 
E. coli K: tem sistemas de modificação-restrição. 
E. coli C: não tem sistemas de modificação-restrição. 
 
 
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Um fago λ não metilado é inserido em: 
 E. coli K: fago é reconhecido como DNA intruso e é restringido. 
 E. coli C: fago não é reconhecido como estranho e é replicado pelos mecanismos da célula. Provoca a lise 
das células. Os fagos libertados não estão metilados. 
Fago metilado é inserido em: 
 E. coli K: o fago metilado está protegido da restrição e, portanto, infecta as células, provocando a sua 
lise e a libertação de fagos metilados (esta E. coli tem sistema de modificação) que podem infectar E.coli K e C. 
 E. coli C: mesmo metilado, o fago é replicado (esta E. coli não tem mecanismo de restrição) e a célula é 
infectada, produz mais fagos λ e sofre lise. 
 
Nomenclatura o nome das endonucleases transmite informação acerca da sua origem. 
A B C D 
A: 1ª letra do género 
B C: 1ª e 2ª letras da espécie 
D: ordem de isolamento 
I.e. Hind II: Hemophilus influenzae, estirpe d, 2ª enzima identificada. 
Tipos de endonucleases (sistemas modificação-restrição) 
 Tipo I: uma enzima com diferentes subunidades para reconhecimento, clivagem e metilação. Reconhece 
e metila sequências específicas mas metila até 1000bp à frente. 
 Tipo II: duas enzimas (uma cliva, outra modifica) que reconhecem a mesma sequência simétrica. 
 Tipo III: uma enzima com duas subunidades, uma para reconhecimento e modificação, e outra para 
clivagem. Reconhece e metila a mesma sequência, mas cliva 24-26bp depois. 
 Tipo IV: duas enzimas e local de reconhecimento assimétrico. Clivagem ocorre num dos lados da 
sequência de reconhecimento mas afastado até 20bp. 
 Tipo V: é o mais usado em Eng. Genética pois as endonucleases não têm a função de metilação (essa 
função é desempenhada por outra enzima do sistema M-R). Reconhecem sequências simétricas de 6 
nucleótidos (geralmente) e cortam no meio. 
5’ C G A T C G 3’ leitura 5’ – 3’ igual nas duas cadeias 
3’ G C T A G C 5’ 
Algumas enzimas reconhecem sequências degeneradas, i.e., que contêm locais onde pode existir 
qualquer base. 
Hinf I reconhece G A N T C. N – pode ser qualquer base. 
Enzimas de restrição que têm a mesma especificidade (mesmo local de restrição mas provêm de 
organismos diferentes) designam-se isosquizómeros. 
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Tipos de extremidades 
 
 Cegas: enzimas cortam a cadeia dupla de DNA no meio da sequência de reconhecimento. 
N N A G C T N N Alu I N N A G C T N N 
N N T C G A N N N N C T G A N N 
 
 Coesivas: enzimas cortam cada cadeiade DNA num local específico, espaçado de 2 a 4 nucleótidos, 
originando extremidades de cadeia simples. 
N N G A A T T C N N EcoR I N N G A A T T C N N 
N N C T T A A G N N N N C T T A A G N N 
 
Endonucleases com diferentes locais de restrição podem produzir as mesmas extremidades coesivas. 
Permite que se restrinjam vectores e fragmentos com enzimas diferentes e que as suas extremidades sejam 
complementares. No entanto, o vector recombinado obtido pode não ser reconhecido por nenhuma das 
endonucleases originais. 
Extremidades coesivas são mais eficientes para clonagem. A complementaridade de bases estabiliza 
associações entre fragmentos diferentes (associações intermoleculares) mas também promove associações 
intramoleculares pois torna mais fácil a recircularização de vectores. 
Não se sabe ao certo quantos locais de restrição existem numa molécula de DNA para determinada 
enzima. Pode prever-se 1 local em cada 44 ou 46 nucleótidos para sequências de restrição de 4 ou 6 bases. No 
entanto, estes valores não são exactos, sabendo-se até que o conteúdo GC de uma sequência afecta o seu 
reconhecimento por diferentes endonucleases. Sequências ricas em GC têm menos probabilidade de apresentar 
sequências de restrição AT. 
A frequência de locais de restrição determina o número e tamanho dos fragmentos restringidos. 
 
Digestão de restrição in vitro 
 
1) Obter DNA (DNA cromossómico, fago, plasmídeo, etc). 
2) Adicionar tampão de restrição: 
 Tris pH 7,4; 
 MgCl2 – Mg
2+ é necessário para activar endonucleases; 
 NaCl – acertar potencial iónico; 
 Dithiothreitol – estabiliza a enzima e previne inactivação. 
3) Introduzir enzima de restrição e incubar a temperatura óptima para a enzima. 
4) Parar a reacção: 70 °C ou fenol ou EDTA – desnatura a enzima ou precipitar DNA – álcool – e centrifugar. 
16 
 
Para determinar o número e tamanho dos fragmentos de restrição corre-se o preparado por um gel de 
electroforese. 
Pode desenhar-se um mapa de restrição onde figuram os locais de restrição de várias enzimas. Estes 
mapas permitem seleccionar as endonucleases a usar nos processos de clonagem. 
 
Construção de um mapa de restrição 
 
 Digerir o DNA alvo com enzimas isoladas (digestão simples) e com combinações (duplas, triplas,…); 
 Determinar o número e tamanho dos fragmentos para cada digestão; 
 Dispor os fragmentos na ordem correcta. 
 
Ligases e ligação de DNA 
 
Ligases são enzimas que fazem a ligação entre fragmentos de DNA – passo final na construção de uma 
molécula recombinante, na replicação ou recombinação. Promovem a formação de uma ligação fosfodiéster 
entre nucleótidos, podendo necessitar de ATP. É adicionado ao tampão da enzima. Não pode ser congelado 
muitas vezes. Nem todas as ligases utilizam os mesmos co-factores. 
Em Eng. Genética usa-se uma ligase purificada a partir de E. coli infectada pelo fago T4, pois esta enzima 
tem uma capacidade de catálise elevada. 
A ligação de extremidades cegas não é muito eficiente pois requer que a ligase e as pontas dos dois 
fragmentos estejam simultaneamente próximas. Para aumentar a eficiência da ligação pode: 
 Aumentar-se a concentração do fragmento em relação à do vector (1:10); 
 Baixar-se a temperatura até 16 °C – apesar de esta não ser a temperatura óptima da enzima e da 
actividade da enzima ser menor, como a agitação molecular é menor há maior probabilidade de os fragmentos e 
a ligase se encontrarem e estabelecerem ligação. 
 Adicionar-se glicerol – torna a mistura mais viscosa e limita o movimento das moléculas. 
 Aumentar-se um pouco a concentração da enzima – aumentar demasiado não é conveniente porque a 
reacção acaba por ser inibida. 
 Transformar-se as pontas cegas em coesivas. A complementaridade que se estabelece entre as 
extremidades fornece uma base estável para a acção da ligase. 
Podem obter-se extremidades coesivas através de vários processos: 
 Linkers: 
 Pequenos fragmentos de DNA de cadeia dupla sintetizados in vitro, que têm uma sequência de 
nucleótidos que contém locais de restrição para uma ou mais endonucleases. 
 Os linkers são ligados a ambas as extremidades cegas do fragmento de DNA (por acção de uma 
ligase) e de seguida são submetidos a digestão de restrição de modo a produzir extremidades 
coesivas. 
 O fragmento obtido pode então ser ligado a um vector restringido pela mesma endonuclease. 
17 
 
Problema: se existir um local de restrição igual ao do linker no meio do DNA. 
 Adaptadores: 
 Pequenos fragmentos de oligonucleótidos sintéticos que têm uma extremidade cega e outra 
extremidade coesiva (correspondente a um local de restrição). Para que os adaptadores não se 
liguem entre si à extremidade coesiva 5’ foi retirado o grupo fosfato (fosfatase alcalina). 
 Os adaptadores são incubados com o DNA alvo e ligam-se às suas extremidades. Tratamento 
com a enzima cinase polinucleotídica fosforila a posição 5’ (adiciona um grupo PO3
2-) e o 
fragmento de DNA fica pronto a ser introduzido num vector (restringido com a mesma 
endonuclease relativa ao adaptador). 
Alguns adaptadores contêm locais de restrição adicionais, de modo a facilitar processos de clonagem. 
 Caudas de homopolímeros: 
 Adiciona-se um tipo de nucleótidos aos terminais 3’ do fragmento de DNA e adicionam-se 
nucleótidos complementares aos terminais 3’ do vector de clonagem (a reacção é feita por 
enzimas terminal-transferases). 
 As extremidades coesivas das duas moléculas são complementares e podem emparelhar, 
permitindo depois a acção do fragmento Knelow (caso fique algum nick) e da ligase. 
O tamanho das caudas não é muito relevante. 
 
Introdução de DNA em células vivas 
 
O próximo passo na clonagem de um gene é a introdução do DNA recombinado em células vivas para 
que este possa ser amplificado e purificado. 
A purificação é necessária pois a amplificação de DNA via culturas de hospedeiros origina vários tipos de 
colónias: 
 Colónias com self-ligated vector. O vector ligou-se a si próprio, recircularizou. 
 Colónias com DNA recombinado errado. Um fragmento de DNA diferente do de interesse, ou ligado de 
forma errada. 
 Colónias com o DNA recombinado desejado. 
Para isolar os diferentes tipos de fragmentos introduzem-se em células vivas (que geralmente só captam um 
vector) e cultivam-se em meio selectivo (selecção depende do vector e do hospedeiro). 
 
 
 
 
18 
 
Técnicas de introdução de DNA em bactérias 
 
O DNA recombinado pode ser introduzido em células vivas por diversos métodos. 
 
Transformação 
 
A transformação é o processo natural de captação de DNA por bactérias. Algumas bactérias (como 
Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas) são naturalmente competentes e adquirem espontaneamente 
fragmentos livres de DNA presentes no meio ou, através de um processo activo, lisam outras células para 
obterem o seu DNA. 
A competência apenas se manifesta quando as bactérias se encontram sob stress, como no caso da falta 
de nutrientes ou presença de antibióticos. Mecanismo de sobrevivência. Englobam DNA na esperança que 
alguns dos fragmentos lhes possam conferir vantagem no ambiente adverso. 
Nem todas as transformações são estáveis e, portanto, nem todos os fragmentos se mantêm nas células 
que os captam. 
Fragmentos lineares têm maior probabilidade de serem degradados porque não têm origem de replicação e 
podem ser reconhecidos pelos sistemas de restrição bacterianos. No entanto, se uma região do fragmento tiver 
homologia com uma região do cromossoma pode ocorrer recombinação e o DNA exógeno é incorporado no 
genoma. 
No caso dos plasmídeos, como estes apresentam uma origem de replicação, podem manter-se na célula 
sem necessidade dese integrarem no cromossoma. 
 
Mecanismo de transformação natural 
 
 Fragmento de DNA liga-se à parede da bactéria por adesão de uma das cadeias. Há formação de um 
pilus ao qual o DNA se liga por atracção electrostática. Cargas negativas do DNA interagem com cargas positivas 
dos aminoácidos do pilus. 
 Pilus retrai-se e o DNA fica em contacto com o periplasma (entre a membrana plasmática e a membrana 
externa) e o peptidoglicano. Está no interior da parede celular. 
 Uma endonuclease corta o DNA em fragmentos mais pequenos (15-40Kb). Há um limite para o tamanho 
dos fragmentos que entram na célula. Há um limite para o tamanho dos fragmentos que entram na célula. Uma 
nuclease degrada a cadeia dupla, obtendo-se ssDNA. 
 A cadeia simples entra na célula por transporte activo e é associada a ssB-proteins, não sendo 
degradada. O sistema Rec-A procura regiões homólogas no cromossoma e se não encontrar nenhuma o DNA 
acaba por ser destruído. 
 
 
 
 
19 
 
Transformação artificial, clássica ou química 
 
Bactérias E. coli não naturalmente competentes podem ser induzidas a tornar-se competentes. Para tal: 
 Recolhem-se células numa fase de crescimento activo (fase exponencial). 
 Centrifuga-se para recolher as bactérias. 
 Fazem-se ressuspensões sucessivas numa solução de CaCl2 e banhos de gelo. Também se usa Mg. CaCl2 
afecta a parede celular e pode ser responsável pela ligação do DNA à superfície celular. O seu mecanismo de 
acção não é bem conhecido. 
 Podem guardar-se as células a -80°C até posterior utilização (guardar até 1 ano). 
 Em banho de gelo, introduzir mistura de ligação que contém o plasmídeo de interesse. 
 Choque-térmico: 3 minutos a 43°C. Apesar de as células já estarem competentes o DNA só é captado 
quando a mistura é submetida a choque térmico. 
 Plaquear a mistura em meio selectivo para a selecção de colones. 
 
A frequência de transformação é baixa (0,01%) e varia com o tamanho dos fragmentos: é ideal para 
cadeias <10Kb e praticamente nula para fragmentos >50Kb. 
É importante eliminar os sistemas de restrição de estirpes usadas para recombinação. Evita-se a 
degradação dos fragmentos introduzidos, possibilitando a sua clonagem. 
 
Electrotransformação (ou electroporação) 
 
A electrotransformação é um método físico de introdução de DNA em células (bactérias, células animais 
ou vegetais) no qual um pulso eléctrico curto e de elevada voltagem é aplicado às células, criando poros na 
membrana plasmática. O DNA de interesse, que se encontra em suspensão, entra por esses poros e mantém-se 
no interior da célula após reestruturação da membrana. 
Esta técnica é rápida e simples mas tem que ser ajustada a cada tipo de organismo, uma vez que os 
parâmetros eléctricos, como a voltagem e a resistência, não são universais. 
Embora não seja o método ideal, a electrotransformação tem uma eficiência superior à transformação 
clássica. Entre os factores que afectam a eficiência pode destacar-se: 
 Temperatura; 
 Parâmetros eléctricos; 
 Topologia do DNA: quanto mais pequenos e mais enrolados estiverem os plasmídeos maior é a 
eficiência. 
 Célula hospedeira: condições de crescimento, sistemas de restrição, património genético, etc. 
 
 
 
20 
 
Procedimento experimental 
 Recolher células numa fase de crescimento exponencial. 
 Centrifugar e recolher células. 
 Ressuspender células em água estéril e colocar em banho de gelo. Lavar as células várias vezes com 
água estéril/destilada elimina os sais presentes no meio e evita curto-circuito. 
 Adicionar DNA plasmídico e submeter choque. Não deixar bolhas de ar na solução para evitar curto-
circuito. 
 Adicionar imediatamente um meio nutritivo. Para promover recuperação celular. 
 Seleccionar transformantes. Usar meio selectivo. 
 
Conjugação bacteriana 
 
A conjugação bacteriana é um processo de transferência de DNA entre células por contacto físico célula-a-
célula através de um canal proteico, o pilus sexual. As proteínas necessárias para a síntese do pilus são 
codificadas em plasmídeos conjugativos (tra+ mob+), como o factor F+ (fertilidade), um plasmídeo natural de E. 
coli. Este plasmídeo tem 2 origens de replicação: 
 Ori T: origem de transferência: local reconhecido por uma enzima (endonuclease Tray) que faz um nick 
no DNA de cadeia dupla e dá início ao processo de transferência pelo método do circulo rolante. 
 Ori: origem de replicação do plasmídeo. 
O factor F é um plasmídeo bastante grande pelo que foi reduzido para poder ser mais facilmente utilizado 
em Eng. Genética. 
 
Conjugação Triparental 
 
A conjugação triparental utiliza 3 estirpes de bactérias: 
 Dadora: mob+tra-, contém um gene de interesse. 
 Ajudante: mob+tra+ e de baixa gama de hospedeiro (plasmídeos não se replicam na estirpe receptora). 
Esta estirpe é apenas um intermediário. 
 Receptora: onde o gene de interesse se vai replicar. 
A estirpe dadora adquire o plasmídeo tra+mob+ e fica conjugativa, podendo transferir o seu plasmídeo, que 
contém o gene de interesse, para a estirpe receptora. 
Usa-se meio selectivo que só permite a sobrevivência da estirpe receptora. i.e. meio PIA, E. coli não 
sobrevive, Pseudomonas sobrevive. (LAB1) 
 
 
 
 
21 
 
Conjugação Biparental 
 
A conjugação biparental utiliza apenas duas estirpes de bactérias: 
 Dadora: tem gene tra+ no cromossoma e plasmídeo de interesse com gene mob+. 
 Receptora: não tem gene tra+ e recebe o plasmídeo de interesse por conjugação com a estirpe dadora. 
Se a conjugação for feita sobre uma membrana em vez de ser em suspensão obtêm-se resultados mais rápidos 
porque a proximidade entre as bactérias facilita a formação dos tubos de conjugação. 
 
Introdução de fagos em bactérias 
 
Transfecção 
 
A transfecção é o processo equivalente à transformação, mas para DNA de fagos. 
Qualquer fragmento de DNA pode formar um fago desde que esteja na presença das proteínas da 
cápsula. O fago “monta-se automaticamente”. Este facto é aproveitado em Eng. Genética para se introduzirem 
moléculas de DNA grandes (45-50Kb) em bactérias, uma vez que este processo é mais eficiente que 
electroporação ou transformação. 
Para moléculas pequenas a eficiência de electrotransformação e transformação é aceitável e utilizam-se esses 
métodos por serem mais fáceis de aplicar. 
As proteínas da cápsula do fago podem ser obtidas de vários modos: 
 Ao introduzir uma mutação nos locais cos do fago λ impede-se a acção da nuclease e não são gerados os 
vários fragmentos de DNA do fago. As proteínas da cápsula são sintetizadas mas não se faz a montagem dos 
seus componentes. Induzindo-se a lise celular obtêm-se os diversos componentes da cápside, que podem ser 
usados para o empacotamento in vitro. 
 Utilizam-se duas estirpes independentes de E. coli infectadas com fago λ mas cada estirpe só produz um 
tipo de proteínas (da cápsula ou da cauda), pelo que os fagos produzidos não são funcionais. De cada estirpe 
extrai-se um dos componentes, que podem ser juntos in vitro. 
 
Introdução de DNA em organismos eucariotas 
 
Introdução de DNA em Saccharomyces cerevisae 
 
 Cultivar leveduras até crescimento exponencial. 
 Fragilizar a parede celular. Tratar com acetato de lítio ou de césio ou electrotransformação (meno 
usado). 
 Adicionar DNA plasmídico, fragmentos de DNA, histamina, PEG e TE/Cation MIXX (dá viscosidade ao 
meio e facilita a aderência do DNA à célula). 
 Choque térmico (30 minutos, 37°C). 
 Cultivar em meio nutritivo. 
22 
 
Introdução de DNA em células animais 
 
A introdução de DNA em células animais pode ser feita por vários métodos: 
 Transferência física (transfecção física): 
 Micro-injecção; 
 Bombardeamentode partículas; 
 Electroporação; 
 Ultrassons. 
 Transfecção mediada quimicamente. 
 Transdução (introdução por vírus). 
 Transferência mediada por bactérias. 
Nos métodos de transfecção física o DNA é introduzido por meios físicos, que incluem: 
 Micro-injecção: é utilizado apenas em células eucariotas grandes e é um método invasivo mas rápido. 
Uma solução de DNA de interesse é injectada directamente no núcleo da célula por meio de uma agulha ou 
pipeta muito fina. 
 Bombardeamento de partículas (biolística): esta técnica foi inicialmente desenvolvida para células 
vegetais e consiste no bombardeamento, a alta velocidade, de microprojecteis – partículas de ouro ou 
tungsténio revestidas com o DNA que se quer introduzir na direcção das células. O DNA exposto adere à 
superfície das células-alvo e difunde-se através da membrana chegando eventualmente ao núcleo e integrando-
se. 
 Ultrassons: os ultrassons são usados para abrir poros na membrana celular e permitir a entrada de DNA. 
Tem que se ter atenção à frequência utilizada pois para frequências demasiado altas as células acabam por lisar. 
 Electrotransformação: corrente eléctrica é usada para abrir poros na membrana celular. Quando 
comparada com a electrotransformação de bactérias, para células animais o pulso aplicado deverá ser mais 
longo e de menor intensidade (devido à dimensão das células). 
 
Os métodos de transfecção química incluem: 
 Cálcio-fosfato: com as células dispostas em monocamada, adiciona-se fosfato de cálcio à solução de 
DNA em suspensão e este precipita sobre a superfície celular, ficando em contacto com as células que, por 
endocitose, o captam. Eventualmente o DNA chega ao núcleo. Atenção, é muito importante que as células 
estejam em monocamada e não em aglomerados pois apenas as células em contacto com o DNA precipitado o 
vão precipitar. Quando funciona, esta técnica é muito barata. 
 Lipossomas: o DNA de interesse é inserido em vesículas lipídicas (lipossomas) que se fundem com a 
membrana das células e permitem a captação de DNA e a sua libertação no citoplasma. DNA entra 
eventualmente no núcleo. Criar lipossomas: adicionam-se lípidos a uma solução de DNA e criam-se micelas 
espontaneamente. Algumas dessas micelas vão conter o DNA que queremos introduzir. 
A transdução é a introdução de DNA em células por meio de um vírus. O DNA exógeno é adicionado ao 
genoma completo do vírus ou é usado para substituir um ou mais genes virais, sendo depois introduzido nas 
células através dos mecanismo naturais de infecção viral. 
23 
 
Na transferência mediada por bactérias (bactofection) o DNA-alvo é adicionado, na forma de 
plasmídeo, a uma bactéria que, seguidamente, infecta uma célula animal, transferindo o DNA para o seu 
interior. 
A introdução de DNA em células animais não permite a criação de microrganismos geneticamente modificados. 
Para isso seria necessário transformar células embrionárias. 
 
Introdução de DNA em células vegetais 
 
Tal como para a introdução de DNA em células animais, existem 4 técnicas fundamentais para a 
introdução de DNA em células vegetais: 
Métodos físicos directos 
 
No bombardeamento de partículas utilizam-se normalmente protoplastos (células sem parede celular), 
mas também se podem usar células normais. Em qualquer método físico é mais eficiente usar-se plasmídeos (de 
preferência super-enrolados) do que DNA linear. Uma vez no núcleo, o DNA exógeno integra o cromossoma por 
um mecanismo de recombinação não homóloga que ainda não é bem conhecido. 
Transferência química directa 
 
Polietileno-glicol: baseia-se no mesmo princípio da precipitação do DNA. No entanto, é necessário tratar 
primeiro as células de modo a remover a sua parede celular (ficam protoplastos) para que o DNA possa ser 
endocitado. No fim da transformação, a parede celular tem de voltar a ser formada. 
Transdução viral 
 
Semelhante ao descrito para as células animais. 
Transferência mediada por bactérias 
 
Nomeadamente por Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria encontra-se junto às raízes das plantas e 
quando a planta tem um corte, que exponha as suas células ao exterior, a bactéria infecta essas mesmas células. 
Estas bactérias possuem o plasmídeo Ti (tumor induction) que é responsável por provocar o crescimento 
descontrolado das células que infecta. Este plasmídeo contém uma região, T-DNA, que é copiada para o genoma 
das células. Nesta região existem genes onc responsáveis pela formação de tumores e pela síntese de opinas, 
compostos usados como fonte de energia pela bactéria. 
Em Eng. Genética introduzem-se genes de interesse na região do T-DNA de modo a que estes sejam 
integrados no genoma da planta. É comum alterarem-se os genes onc para evitar o crescimento celular 
descontrolado. 
Apesar de útil, este método apenas permite a transformação de células na zona de corte, o que não é 
viável quando se quer produzir uma planta totalmente transgénica. Para isso é necessário infectar uma cultura 
de células, cujos transformantes vão dar origem a novas plantas, já com as características desejadas. 
24 
 
Inocula-se uma suspensão celular com a bactéria transformante e seleccionam-se as células 
transformantes, que são cultivadas num meio nutritivo e com um cocktail de hormonas. O plasmídeo Ti 
recombinado não tem genes onc e tem uma marca de selecção que permita identificar as células transgénicas. 
No entanto, este método não funciona em todos os tipos de plantas. 
 
PCR – Polymerase Chain Reaction 
 
Uma reacção de PCR resulta na amplificação selectiva de uma dada região do DNA. As fronteiras da região a 
amplificar têm que ser conhecidas e têm que ser sintetizados dois pequenos oligonucleótidos (primers) que 
delimitem essa região, para que a polimerase possa iniciar a replicação das cadeias do DNA. 
 
Passos da PCR 
 
 Desnaturar DNA por aumento da temperatura (até 94-95°C). 
 Hibridação dos primers a temperatura de annealing (50-65°C) – temperatura utilizada depende das 
características dos primers. 
 Extensão das cadeias, a 72°C, pela enzima Taq polimerase – é termoestável e provém do organismo 
Thermus aquaticus. Não é proofreading. Repetem-se 25 a 30 ciclos. 
 Extensão final permite a síntese de cadeias que possam ter ficado incompletas. 
Em cada ciclo são sintetizadas o dobro das cadeias iniciais. Por cada molécula dupla de DNA são 
sintetizadas duas moléculas. No final da reacção têm-se 2n-2 fragmentos (n é o número de ciclos e a base 2 
provém do facto de nos primeiros dois ciclos serem obtidas duas moléculas longas) de DNA alvo. 
 
Material necessário 
 H20 
 dNTP’s 
 Primers 
 DNA alvo 
 Taq polimerase 
 Tampão (enzima) 
 MgCl2 (cofactor da enzima) 
Misturam-se todos os componentes no tubo de PCR. Estes tubos têm tamanho reduzido para que a temperatura 
no seu interior seja sempre mais ou menos homogénea. 
 
 
 
 
25 
 
Design de primers 
 
Os primers são o ponto-chave para o sucesso da PCR. Se os primers forem mal escolhidos pode não se 
obter qualquer produto de PCR ou pode obter-se um ou mais fragmentos errados. 
Os primers devem flanquear a região do DNA que se quer amplificar e serem complementares à cadeia 
para a qual servirão de molde durante a replicação. 
Primer codificante: permite a síntese da cadeia superior, no sentido 5’ 3’. Lido directamente na sequência 
alvo. Primer codificante upper primer. 
Primer não-codificante: permite a síntese da cadeia complementar, também no sentido 5’ 3’. Complementar 
à região final da cadeia alvo que surge com a ordem dos nucleótidos invertida. 
 Primer codificante 
5’ G T A G C C T A A T C C G G A T C G T T A G C C T G C A A 3’ 
3’ C A T C G G A T T A G G C C T A G CA A T C G G A C G T T 5’ 
 complementar ao primer não codificante e sequência invertida 
Primer codificante: 5’ CTAATCC 3’ 
Primer não-codificante: 5’ TCCGAT 3’ 
Nota: os primers não devem ser complementares entre si para não hibridarem um com o outro. 
 
Para garantir a eficiência da reacção de PCR os fragmentos amplificados não devem ser inferiores a 1Kb 
nem superiores a 3Kb, embora seja possível utilizar fragmentos com até 10Kb. Amplificação de fragmentos 
maiores requer métodos especiais. 
 Um dos primeiros aspectos a ter em conta aquando da escolha de primers é o seu tamanho. Primers 
demasiado pequenos podem hibridar com várias zonas e dar origem a produtos indesejados. 
8-mer (primer com 8 nucleótidos) pode hibridar, estatisticamente, em 46000 locais do genoma humano. Já um 
17-mer espera-se que apenas encontre uma sequência complementar em todo o genoma – é menos provável 
que origine produtos inespecíficos. 
No entanto, primers demasiado longos também não são aconselháveis porque levam mais tempo a 
hibridar e diminuem a eficiência da PCR. Na prática não se utilizam primers com mais de 30 nucleótidos. Não só 
devido à diminuição da eficiência da reacção mas também porque são muito mais caros de sintetizar. 
 A temperatura de ligação dos iniciadores é também muito importante. Deve ser suficientemente alta 
para que hibridações não perfeitas sejam instáveis mas não deve ultrapassar a temperatura de fusão dos 
primers (Tm), à qual eles se mantêm sempre dissociados do DNA. 1-2°C abaixo da Tm é considerada a 
temperatura ideal de ligação. 
Os primers devem ainda ser desenhados de modo a que os primers codificantes e não-codificantes 
tenham temperaturas de ligação semelhantes. Pode jogar-se com o tamanho dos primers. 
26 
 
Tm pode ser determinada pela fórmula: 
 
Nem sempre se conhece a sequência do DNA que se quer amplificar pelo que têm que se desenhar os 
primers recorrendo à sequência de aminoácidos da proteína codificada por esse mesmo DNA. 
Comparam-se proteínas de vários organismos e identificam-se as zonas consenso (têm os mesmos 
aminoácidos) e os genes homólogos. A partir da sequência de aminoácidos obtém-se a sequência de nucleótidos 
possíveis (tem de se ter em conta a degenerescência do código genético) e podem então desenhar-se os 
primers. 
Nos locais em que podem estar presentes várias bases utilizam-se bases degeneradas (que emparelham 
com qualquer nucleótido), como a inosina. Aos primers assim formados dá-se o nome de primers degenerados. 
 
Principais regras para o design de primers: 
 
 Comprimento 17-28 bases. 
 Conteúdo CG de 50-60%. 
 Terminação 3’ com C, G, CG ou GC aumenta eficiência – ligação C G é estável para a polimerase. 
 Tms entre 55 e 80°C. 
 Extremidades 3’ não devem ser complementares – para evitar a formação de dímeros. 
 Deve evitar-se complementaridades entre primers – para impedir a formação de estruturas secundárias. 
 Evitar sequências de 3 ou mais C’s e G’s nas extremidades 3’ – promovem erros de ligação em 
sequências com conteúdo CG elevado. 
 
Produtos de PCR 
 
Os produtos de PCR são usados principalmente para 3 fins: 
 Electroforese em gel; 
 Clonagem; 
 Sequenciação. 
A clonagem de um produto de PCR não é tão simples como pode parecer pois a Taq polimerase adiciona 
um nucleótido, geralmente adeninas, à extremidade 3’ de cada cadeia que sintetiza, dando origem a fragmentos 
de extremidades não cegas. 
Para ultrapassar este facto, pode usar-se uma exonuclease para remover as bases extra, mas é difícil 
prevenir que o DNA de interesse não seja também digerido. Pode também utilizar-se um vector que tenha 
projecções de timina, de modo a que estas emparelhem com as adeninas do fragmento de PCR. 
 
 
27 
 
No entanto, uma das soluções mais utilizadas é o design de primers que já incluem locais de restrição na 
região 5’. Desde que a extremidade 3’ do primer tenha cerca de 70% de complementaridade, o primer híbrida 
com a molécula de DNA alvo inicial, permitindo que a região de restrição seja copiada para os produtos finais de 
PCR. Esses produtos podem depois ser restringidos e ligados a vectores com extremidades coesivas. 
 
Vectores de Clonagem 
Vectores de clonagem para E. coli 
 
Plasmídeos 
 
Nomenclatura: 
pBR322 
p: plasmídeo 
BR: laboratório onde foi construído, cientistas que o desenvolveram 
322: distinção entre plasmídeos do mesmo laboratório 
 
pBR322 foi um dos primeiros plasmídeos a serem construídos e apresenta algumas características muito úteis: 
 É pequeno (4363 bp) – permite clonagem de fragmentos com 6Kbp e é clonado facilmente. 
 Tem duas marcas de selecção (resistência a ampicilina e tetraciclina) cada uma com um local de 
restrição único. 
 Tem vários locais de restrição únicos – que permitem clonar genes com vários tipos de extremidades 
coesivas. 
 Tem um número de cópias razoavelmente elevado – e que pode ser aumentado na presença de um 
inibidor da síntese proteica, o cloranfenicol (até 1000-3000 cópias). 
No entanto, este plasmídeo é conjugativo, o que pode não ser muito benéfico devido á transferência 
indesejada de genes entre espécies. 
O plasmídeo pBR322 foi construído a partir de 3 plasmídeos naturais de E. coli que forneceram: 
 R1: ampR 
 R6.5: tetR 
 pMB1: ori 
A selecção de transformantes utilizando-se pBR322 pode ser feita através da resistência à ampicilina ou 
à tetraciclina. 
Suponhamos que restringimos o vector com BamHI e introduzimos o gene de interesse na região que 
codifica o gene tetR. As células transformantes vão possuir apenas resistência à ampicilina, mas este antibiótico 
não pode ser usado unicamente para a selecção porque também o vector tem ampR. Para ultrapassar este 
28 
 
problema fazem-se dois “riscados” de colónias transformantes em placas contendo meio nutritivo e amp ou tet. 
As colónias que não crescerem em meio com tetraciclina são as que desejamos e podemos isolá-las a partir do 
meio apenas com ampicilina. 
Amp Tet 
(1) 
 
 
 
 
 
(2) 
 Estas colónias não crescem em meio com tetraciclina, portanto, são 
transformantes. São isoladas a partir da placa 1. 
 
Se clonássemos o gene utilizando a enzima PstI iríamos alterar o gene de resistência à ampicilina em vez de 
tetraciclina e o processo de selecção seria análogo. 
 
Se clonássemos o gene utilizando EcoRI não eliminaríamos nenhuma marca de selecção e o processo de 
selecção das bactérias transformantes seria mais complicado. Poderia ter que se correr o DNA das células num 
gel para determinar a sua massa molecular. 
O plasmídeo pUC8 tem outro tipo de características: 
 Elevado número de cópias (500-700 por célula). 
 Identificação de recombinantes num único passo – uso do gene LacZ’. 
 Locais de restrição aglomerados numa única região e que permitem que as duas extremidades dos 
fragmentos sejam cortadas por enzimas diferentes. 
 Resistência à ampicilina. 
 
29 
 
A selecção de recombinantes em pUC8 envolve o gene LacZ’. Este gene codifica a síntese da proteína β-
galactosidase, envolvida na degradação da lactose em glucose e galactose. 
Algumas estirpes de E. coli têm o gene LacZ’ modificado no seu genoma e só são capazes de metabolizar 
a lactose na presença de plasmídeos, como o pUC8. Em Eng. Genética utilizam-se estas estirpes para seleccionar 
recombinantes, juntamente com um composto análogo à lactose, a X-gal, mas que adquire a cor azul quando é 
degradado pela β-galactosidase, permitindo a identificação de colónias. 
A inserção de um gene no vector pUC8 inactiva o gene LacZ’, o que significa que colónias recombinantes 
cultivadas em meio com X-gal não vão ficar azuis. A selecção pode então ser feita num meio nutritivo com 
ampicilina(sobrevivem apenas as células transformantes) e X-gal (as colónias brancas são as recombinantes). 
 
 
 
 
 
 
Vectores de clonagem baseados no fago M13 
 
Os fagos contêm genes necessários à replicação codificados em genes das proteínas da cápsula, pelo 
que não se pode eliminar essas regiões. Deste modo, a liberdade para modificar fagos fica mais restringida e só 
se conseguem clonar genes pequenos, até 1,5Kb. 
No entanto, clonagem em vectores M13 é importante pois obtêm-se fragmentos de DNA de cadeia 
simples, muito utilizadas para sequenciação e mutagénese dirigida. 
M13mp7 é um vector baseado no fago M13 e que apresenta várias características: 
 Genoma do fago. 
 Gene LacZ’ – que permite a selecção de recombinates. 
 Polylinker – local múltiplo de clonagem, no interior do LacZ’. Tem locais de restrição para EcoRI, BamHI, 
SalI e PstI. 
 
Agar + X-gal + IPTG 
Recombinantes 
Não-recombinantes 
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O método de selecção utilizado para o M13mp7 é semelhante ao do pUC8, embora não se tenha 
resistência a ampicilina para seleccionar os transformantes. 
Cultivam-se as células num meio nutritivo com X-gal e as colónias recombinantes são as pequenas e 
brancas: colónias brancas porque significa que o gene LacZ’ não está funcional e pequenas porque esse facto 
indica que as células crescem menos devido ao peso metabólico adicional do plasmídeo. 
Colónias brancas e grandes: não captaram o vector – não são sequer transformantes. 
Fagemídeo (i.e., pEMBL8) é um vector híbrido entre um plasmídeo e um fago M13 criado de modo a permitir a 
clonagem de genes de dimensão superior às 1,5Kbp permitidas pelo M13pm7. 
A região de replicação do fago, sem as proteínas da cápsula mas contendo uma zona reconhecida pelas 
enzimas que transformam o DNA em cadeia simples, é inserida num plasmídeo como o pUC8, que apresenta os 
genes LacZ’ e ampR. 
Como um fagemídeo não contém a informação relativa à síntese das proteínas da cápsula, quando se 
quer obter um fago tem que se infectar as células com um fago ajudante. É mais fácil extrair o DNA utilizando as 
características do fago. 
Com o fagemídeo pEMBL8 podem clonar-se fragmentos de DNA de cadeia simples com 6Kbp. 
 
 
 
 
 
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Vectores de clonagem baseados no fago λ 
 
Antes de se desenvolverem vectores baseados no fago λ foi necessário resolver dois problemas: 
 Só se podiam adicionar fragmentos com 3Kbp – fragmentos maiores tornam o fago demasiado grande 
para ser encapsulado. 
 Não existiam locais de restrição únicos. 
A eliminação de uma região essencial do genoma do fago, responsável pela integração do fago no DNA 
cromossómico e sua posterior excisão, permitiu que fossem disponibilizados mais 15Kbp para a clonagem de 
fragmentos, perfazendo um total de 18Kbp. 
A remoção da região referida implica que o fago deixa de ser capaz de realizar o ciclo lisogénico (realiza 
apenas o ciclo lítico), o que até é uma característica desejável para os vectores. 
Para eliminar os locais múltiplos de clonagem utilizou-se selecção natural. 
Infectam-se E. coli que produzem endonucleases EcoRI. A maioria do DNA é restringido mas algumas moléculas 
mutadas (que contêm menos ou nenhum local de restrição para EcoRI) persistem, sendo seleccionadas. Ao fim 
de alguns ciclos de infecção obtém-se o DNA com as características pretendidas. 
Vectores de inserção: têm um único local de clonagem, adicionando-se o fragmento de DNA desejado ao vector 
local. 
Vectores de substituição: têm dois locais de restrição que flanqueiam uma região do DNA que é substituída 
pelo fragmento pretendido. 
A selecção dos fagos recombinantes é feita naturalmente pois apenas os fragmentos de DNA de 
dimensão 45Kbp a 52Kbp são empacotados. Deste modo, basta apenas garantir que o vector recombinado se 
encontra dentro desta gama de tamanho e que o vector simples tenha menos que 45Kbp para que os únicos 
fagos completos que se obtêm sejam recombinados. 
Os cosmídeos são vectores híbridos entre plasmídeos e fagos λ que permitem a clonagem de 
fragmentos de grandes dimensões. O seu design baseia-se no facto de as enzimas que promovem o 
empacotamento do DNA λ apenas necessitarem de reconhecer locais cos separados de 37-52Kbp. 
Um cosmídeo tem ainda uma marca de selecção (i.e.: ampR) e uma origem de replicação. É basicamente 
um plasmídeo com um local cos. Aprensentam um único local de restrição e durante o processo de inserção 
geralmente formam-se catenanos. O processo de empacotamento é ainda realizado in vitro e os fagos são 
depois usados para infectar E. coli cultivadas em meio selectivo contendo ampicilina. 
Capacidade de um cosmídeo: 5,4Kbp - 47Kbp 
 
 
 
 
 
 
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Bibliotecas genómicas 
 
Vectores λ e outros vectores de elevada capacidade permitem a criação de bibliotecas genómicas. Estas 
bibliotecas consistem num conjunto de clones recombinantes que contêm todo o DNA de um organismo, sendo 
muito úteis para estudar genes individualmente. Podem ser guardadas durante muitos anos e partilhadas entre 
laboratórios. 
Bibliotecas genómicas de eucariotas são feitas a partir de sequências às quais já foram eliminados os 
intrões – clona-se a partir do RNA. 
O número de clones necessário para fazer uma biblioteca genómica pode ser calculado pela fórmula: 
 
p: probabilidade de um dado gene estar presente 
a: tamanho médio dos fragmentos de DNA clonados 
b: tamanho total do genoma 
 
BAC: bacterial artificial cromossomes (capacidade 100-300Kbp) 
 
Vectores de clonagem para leveduras 
 
A maioria das estirpes de S. cerevisae tem um plasmídeo natural, o plasmídeo 2μm que apresenta 
algumas características: 
 Pequeno (6Kbp). 
 70-200 cópias por célula. 
 Tem origem de replicação. 
 Não tem marca de selecção – é um problema. 
As marcas de selecção introduzidas no plasmídeo 2μm são geralmente marcas metabólicas. 
Os organismos hospedeiros vão ser auxotróficos para um determinado aminoácido, i.e. vão ter em falta um 
gene responsável pela síntese desse a.a. e só sobrevivem se este for suplementado ao meio de cultura. 
Nos vectores para levedura introduz-se os genes que estão não funcionais no hospedeiro e cultivam-se os 
transformantes em meio mínimo (sem a.a. adicionados) de modo que só os organismos que captaram o 
plasmídeo vão conseguir sobreviver. 
 
 
 
 
 
 
 
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YEps – Plasmídeos epissomais de levedura 
 
YEps são plasmídeos derivados do 2μm e são do tipo vai-vém pois replicam tanto em E. coli como em S. 
cerevisae. 
Um exemplo deste tipo de plasmídeos é o YEp13: 
 Tem origem de replicação do plasmídeo 2μm – permite replicação em levedura. 
 Tem gene LEU2 – permite selecção de recombinantes em meio mínimo de leucina (selecção em 
levedura). 
 Tem sequência de pBR322 – permite replicação e selecção em E. coli. 
 20-50 cópias. 
Como a extracção de DNA plasmídico em levedura é complicada (o plasmídeo pode integrar-se no genoma) 
clonam-se sempre os fragmentos primeiro em E. coli. A partir das colónias recombinantes seleccionadas extrai-
se o DNA e introduz-se em S. cerevisae, seleccionando-se depois utilizando meio mínimo. 
Os YEps são epissomais, o que significa que se podem integrar no DNA cromossómico da levedura e, 
posteriormente, serem retirados. Epissomal Integrativo (integrativo fica inserido no cromossoma para 
sempre). 
A integração dá-se por recombinação homóloga (gene LEU2 do plasmídeo tem regiões homólogas ao gene 
respectivo não funcional no genoma da levedura) e permite que todas as gerações futuras apresentem as 
características pretendidas. 
No entanto, quando o objectivo da clonagem é a produção de uma proteína para extracção é mais eficiente 
usar plasmídeos não integrativos pois estestêm um elevado número de cópias. 
Quando há integração no genoma, só é possível obter uma cópia do gene em cada organismo. 
 
Outros plasmídeos para levedura 
 
YIps, Yeast Integrative plasmids, são plasmídeos bacterianos que contêm um gene de levedura. Não são 
replicáveis em levedura (não contêm regiões do plasmídeo 2μm) pelo que a sua sobrevivência em S. cerevisae 
depende da integração no genoma. 
URA3 é um exemplo deste tipo de plasmídeos. Consiste no pBR322 ao qual foi inserido o gene URA3, 
que codifica uma proteína interveniente na biossíntese de nucleótidos pirimidinicos (T,C). 
YRps, Yeast Replicative plasmids, têm uma origem de replicação para levedura e não se integram no 
genoma. São instáveis e podem ter entre 5 a 100 cópias. 
YRp7 é um exemplo deste tipo de plasmídeo e é composto pelo pBR322 e tem um gene de levedura, 
TRP1, que está envolvido na síntese do triptofano e é adjacente a uma origem de replicação em levedura. 
YRps não tendem a ser copiados para células filhas durante a divisão celular. 
 
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YACs – cromossomas artificiais de levedura 
 
YACs são utilizados para clonar longos (até 1400Kbp) fragmentos de DNA. Têm a estrutura de um 
cromossoma e, portanto, apresentam 3 componentes essenciais: 
 Centrómero: necessário à correcta separação do cromossoma durante a divisão celular. 
 Telómeros: para replicação das extremidades do cromossoma e protecção contra exonucleases. 
 Origens de replicação: várias ao longo do cromossoma permitem a replicação do DNA. 
pYAC3, um exemplo de YACs, contém vários genes responsáveis por diferentes características: 
 Ori: origem de replicação da levedura. 
 TEL: duas regiões que codificam os telómeros. 
 CEN4: centrómero. 
 TRP1: contém informação para ori e informação para a biossíntese de triptofano. 
 URA3: informação para a síntese de pirimidinas. 
 SUP4: confere cor vermelha. 
Tem um local de restrição para a endonuclease SnaBI. TRP1, URA3 e SUP4 são úteis para a selecção de 
recombinantes. 
Processo de clonagem com pYAC3: 
 Restrição do vector com BamHI (coesivo) e SnaBI (cego). 
 Obtém-se 3 fragmentos: 
 Fragmento flanqueado por locais de restrição BamHI é descartado. 
 Braço esquerdo contém TEL, TRP1-ori-CEN4. 
 Braço direito contém URA3 e TEL. 
 O gene SUP4 fica dividido entre os dois braços. 
 Ligação do fragmento de DNA – deve ter extremidades coesivas. 
 Selecção: auxotrofia dupla e cor. 
Podem ocorrer diversos tipos de ligação: 
 2 braços direitos: auxotrofia para triptofano. 
 2 braços esquerdos: auxotrofia para pirimidinas. 
 Braço esquerdo + braço direito sem gene: cor vermelha. 
 Braço esquerdo + braço direito + gene: recombinantes sobrevivem a meio mínimo para triptofano e 
pirimidinas e têm cor branca. 
(YACs são instáveis e podem sofrer recombinação homóloga entre si) 
 
11,4 Kb 
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Vectores de clonagem para plantas superiores 
 
Para plantas superiores, os vectores de clonagem mais usados são baseados no Ti, plasmídeo natural de 
Agrobacterium tumefaciens. 
O plasmídeo Ti tem grandes dimensões ( 200Kbp) e um único local de restrição, pelo que a sua 
manipulação se torna complicada. Para ultrapassar essa dificuldade utilizam-se duas estratégias: 
 Estratégia vector binário: a região do T-DNA não precisa de estar fisicamente associada ao resto do 
plasmídeo Ti. Utilizam-se dois plasmídeos no processo de infecção: 
 Plasmídeo 170Kbp que contém a região de virulência e a região de especificidade para o 
hospedeiro. Este plasmídeo permite a infecção das células animais mas mantém-se na 
agrobactéria, não sendo transferido. 
 Plasmídeo 20Kbp que contém o T-DNA e um único local de restrição. É neste plasmídeo que 
é inserido o gene de interesse. É transferido para as células vegetais e sofre recombinação, 
integrando-se no DNA cromossómico. 
 
 Estratégia de cointegração: utiliza-se um plasmídeo baseado num vector E. coli mas que contém duas 
repetições de 25bp pertencentes ao T-DNA (verificou-se que estas eram as únicas regiões envolvidas no 
processo de infecção. Já não tem oncogene – a região dos oncogenes pode ser substituída por DNA de interesse 
– não há formação de tumores). 
 
Este plasmídeo, designado Ti desarmado, apresenta ainda o gene LacZ’ e kanR (resistência à canamicina), 
necessários para a selecção de recombinantes e, devido às repetições de T-DNA, integra-se no genoma das 
células para os quais é transferido. 
A clonagem com plasmídeos de Agrobacterium tumefaciens tem a desvantagem de só poder ser usada 
em plantas dicotiledónias (tipo de plantas com flor). i.e. tomate, tabaco, batatas, ervilhas, feijões. 
Quando se pretende uma grande expressão do DNA exógeno é comum inserir o novo DNA no genoma 
dos cloroplastos, pois estes existem em muita quantidade nas células. A introdução do DNA deve ser feita por 
meios físicos. 
Vectores de clonagem para insectos 
 
A clonagem de insectos como a Drosophila (mosca da fruta) faz uso de transposões designados 
elementos P. 
Um transposão é uma curta sequência de DNA (<10Kbp) que se pode mover entre várias regiões do 
cromossoma de uma célula. São constituídos por duas repetições invertidas (IR) que flanqueiam o gene da 
transposase, a proteína responsável pela mobilidade das sequências de inserção (IS). 
Os elementos P podem “saltar” entre locais do cromossoma e entre um plasmídeo e um cromossoma. 
 
 
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Para clonar genes de interesse utilizam-se vectores que contêm dois elementos P: 
 Um deles tem a transposase interrompida pelo DNA que se quer inserir na célula. 
 O outro tem a transposase intacta mas não tem repetições invertidas – não pode ser transferido. 
O vector é introduzido nas células alvo por microinjecção. A transposase é sintetizada e a sequência 
transferida para o genoma é a que contém o gene de interesse. 
Um plasposão é um transposão que tem uma origem de replicação. 
Obtenção de clones para genes específicos 
 
O método mais simples para obter um clone de um determinado gene é através de PCR. No entanto, 
isso nem sempre é possível quando não se conhece a sequência de nucleótidos do gene. Existem duas 
estratégias básicas para permitir a selecção de genes: 
 Selecção directa de genes de interesse através do crescimento em meio selectivo. O gene clonado deve 
conferir uma característica que permita a selecção, como uma característica morfológica, a resistência a um 
antibiótico ou uma proteína associada a uma via biossintética (para organismos auxotróficos). Esta técnica pode 
ser extendida a organismos (estirpes) mutantes, nomeadamente a estirpes auxotróficas. 
Limitações: deve existir uma estirpe mutante para o gene em questão e um meio onde apenas os organismos 
recombinados sobrevivam. 
Aplicações: pode utilizar-se para a maioria dos genes que codificam para enzimas biossintéticas e não está 
restringida a E. coli, pois existem outras bactérias e até leveduras auxotróficas. 
 
 Identificação a partir de uma biblioteca genómica através do uso de sondas – Hibridação de Southern. 
Numa biblioteca genómica de eucariotas utiliza-se cDNA clonado em plasmídeos, YACs, BACs, etc. Devido à 
presença de intrões recorre-se ao transcritema e não ao genoma das células. Deve ter-se também em atenção o 
facto de células diferentes expressarem diferentes genes. 
Para seleccionar um gene cuja proteína não é sintetizada no fígado utilizam-se células hepáticas e não quaisquer 
outras. 
Processo de preparação do cDNA: 
 Extracção de mRNA e sua purificação – mRNA processado tem cauda poli A em 3’. 
 Ligação de um primer de TTT… 
 Síntese de uma molécula híbrida (RNA+DNA) por acção da transcriptase reversa. 
 Degradação da cadeia de RNA pela RNase H – esta enzima deixa algumas regiões