REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS 
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPÍCAL DO AMAZONAS 
MESTRADO E DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS 
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS 
EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR 
AMERICANA 
ROSILENE VIANA DE ANDRADE 
MANAUS2007 
ROSILENE VIANA DE ANDRADE 
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE EM BIÓPSIAS DE PELE EMBLOCADAS 
EM PARAFINA COMPATÍVEIS COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR 
AMERICANA 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós Graduação em Medicina Tropical da 
Universidade do Estado do Amazonas, em 
convênio com a Fundação de Medicina 
Tropical do Amazonas, para a obtenção do 
grau de Mestre em Doenças Tropicais e 
Infecciosas. 
Orientador (a): Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira 
MANAUS 
2007 
 
ii
 
Andrade, Rosilene Viana 
 Reação em cadeia de polimerase em biópsias de pele emblocadas em parafina 
compatíveis com Leishmaniose Tegumentar Americana a histopatologia, 2007. 
 xii, 56f. 
 Tese (Mestrado) Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da 
Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina 
Tropical do Amazonas. 
 Título em ingles: Reaction Chain polymerase in paraffine-embedded skin 
biopsies with histopathological features consistent with American Cutaneous 
Leishmaniasis. 
 
 1.Cutaneous Leishmaniasis, 2.PCR, 3. kDNA minicircles, 4.histopathology. 
 
 
iii
 
 A Deus, o idealizador de tudo. 
 Á minha família, pela compreensão, pelo amor 
incondicional e pelo apoio nos momentos 
difíceis - o meu porto seguro. 
 
iv
 
AGRADECIMENTOS 
 A Deus, pela sua imensa bondade para com a minha vida, pois tenho 
somente que agradecer pelos momentos bons, por todas as conquistas e forças nos 
momentos difíceis. 
 À minha família, pelo carinho e amor, sempre me apoiando em todos os 
momentos da minha vida e da vida das minhas filhas. 
 
 Às minhas filhas, que são motivo de alegria, amor e força para seguir 
enfrentando os bons e os maus momentos da vida. 
 Ao Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira, pela paciência, incentivo, e 
conhecimentos científicos - a pessoa mais importante na minha vida profissional, 
pois tem estado sempre comigo. 
 
 À Meline Nogueira, bolsista do PAIC, pelo carinho, ajuda e conhecimentos 
técnicos imprencidíveis na realização da técnica Reação em Cadeia de Polimerase. 
 Ao Programa de Mestrado e Doutorado da Universidade Estadual do 
Amazonas, pelos conhecimentos técnicos e pelo apoio financeiro; à Drª. Graça, 
Coordenadora do programa e aos secretários, pela atenção, apoio e simpatia 
sempre manifestados. 
 A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas 
 
Ao Sr Presidente Dr. Sinésio Talhari, pelo apoio pessoal, financeiro e 
disponibilização de suporte técnico e laboratorial desta Fundação. 
 
A Gerência de Leishmaniose, pela disponibilização das Fichas de 
Atendimento Ambulatorial dos pacientes com biópsias c/c LTA. 
 
A Gerência de Virologia, que nos permitiu a utilização do espaço físico e 
aparelhagem para a realização da reação em cadeia de polimerase. 
 
v
 
Ao Laboratório de Anatomia Patológica; ao Dr. Araújo, pelo apoio neste 
trabalho; à Sandra Caranhas, pela ajuda na realização dos cortes 
histopatológicos das biópsias do estudo. 
 Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) e à Gerência de 
Leishmaniose, pela disponibilização de cepas de Leishmaniose, usadas nos 
controles positivos da PCR. 
 
 À Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA), pelo apoio 
financeiro na realização da pesquisa. 
 
 
vi
 
 
 
São muitas, Senhor Deus meu, as maravilhas 
que tens operado e também os teus desígnios para 
conosco; ninguém há que se possa igualar contigo. 
Salmos 40,5. 
 
vii
 
RESUMO 
Introdução. A Leishmaniose Cutânea é uma doença de alta incidência no Brasil e 
no ano de 2003 foram notificados 26.185 novos casos. No estado do Amazonas a 
doença é endêmica. Os métodos tradicionais de diagnóstico de LTA, como a cultura 
e histopatologia, requerem a presença de um número relativamente alto de 
microorganismos, porém, na fase crônica, o número de parasitas é muito baixo. 
Material e método O presente estudo avaliou a realização da PCR para o 
diagnóstico de Leishmaniose Cutânea em biópsias de pele emblocadas em parafina 
de pacientes c/c LTA a histopatologia. A amplificação de DNA de Leishmania utilizou 
primers de área conservada do kDNA com 120 pares de base. As biópsias foram 
também reavaliadas histopatologicamente e classificadas de acordo com Magalhães 
1986. Resultados. A PCR amplificou DNA de Leishmania sp em 96,66% das 
amostras de biópsias compatíveis com LTA. Na reavaliação histopatológica, os 
achados mais comumente percebidos nas biópsias compatíveis com LTA e PCR 
positivo foram a presença de hiperplasia pseudoepiteliomatosa em 90% dos casos e 
reação granulomatosa em 90,69%. O tipo histopatológico mais frequentemente 
encontrado foi o tipo IV da classificação de Magalhães et al em 62,22% dos casos 
Conclusão. O PCR demonstrou alta sensibilidade para o diagnóstico de 
Leishmaniose Cutânea nas fases crônicas da doença. 
Palavras-chave: Leishmaniose Cutânea, PCR, Minicírculo de kDNA, Histopatologia. 
 
viii
 
ABSTRACT 
Introduction.The Cutaneous Leishmaniasis is on of the infections-diseases of 
highest incidence in Brazil with 26.185 new cases in 2003, it has been observed in 
endemic area in North region. The diagnosis of chronic lesion using routine methods 
requires the presence of high numbers of the parasites, for example culture and 
histopathology but in chronic lesion, the number of parasite is low. Material and 
methods.In this study we assessed the ability of PCR to diagnostic cutaneous 
leishmaniasis. We used to amplify a 120 base pair fragment of Leishmania 
kinetoplast DNA (kDNA) minicircles of paraffin-embedded skin biopsies of specimens 
of cutaneous leishmaniasis with histopathological features consistent with cutaneous 
leishmaniasis but failed to detect parasite. The biopsies were reviewed and 
characteristic elements were descript and following grouped based with Magalhães 
classification. Results. The PCR amplify Leishmania DNA in 96,66% of the cases 
consistent with cutaneous leishmaniasis. The histopathological group more frequently 
observed were the group IV of Magalhães in 62,22%.The histopathological features 
more frequently observed were pseudoepitheliomatous hyperplasia and 
granulomatous reaction in 90% and 90,69% respectively . Conclusion.The PCR on 
paraffin-embedded tissue is highly sensitive test for diagnosis of chronic lesion of 
cutaneous leishmaniasis when others method failed to detect parasite. 
 
ix
 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária 
Tabela 2 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o número de lesões 
ulceradas. 
Tabela 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o tempo de evolução 
das lesões ulceradas. 
Tabela 4 Distribuição dos casos de c/c LTA de acordo com o tipo histológico 
baseados na Classificação de Magalhães. 
Tabela 5 Distribuição dos casos de acordo com a análise das características 
histopatológicas das biópsias c/c LTA reavaliadas. 
Tabela 6 Distribuição do númeromédio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c 
LTA e pacientes com LTA a histopatologia. 
Tabela 7 Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das 
características histopatológicas. 
Tabela 8 Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c 
LTA e PCR positivo para gênero Leishmania e nos casos positivos para LTA a 
microscopia óptica. 
 
x
 
LISTA DE QUADROS 
Quadro 1 Lista de espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose 
Tegumentar no Brasil e seus principais vetores. 
Quadro 2 Número de casos notificados de Leishmaniose Tegumentar de acordo 
com a região geográfica brasileira e os estados com maior número de casos. 
Quadro 3 Amplificação da PCR no termociclador :números de ciclos, variação de 
temperatura e o tempo de cada etapa. 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1 Distribuição dos casos de Leishmaniose Tegumentar no Velho e Novo 
Mundo de acordo com a Organização Mundial de Saúde. 
Figura 2 Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose 
Cutânea. 
Figuras 3 Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia de acordo com o 
sexo. 
Figura 4 Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com o localização das lesões 
ulceradas. 
Figura 5 Tipo IV, tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado de acordo 
com a classificação de Magalhães. 
Figura 6 Gel de eletroforese do resultado da amplificação do DNA de Leishmania sp 
através da PCR. 
 
xi
 
 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 
minutos
 
 
micro
 
> Maior 
< Menor 
dNTP Desoxirribonucleosídios trifosfato 
DNA Ácido desoxirribonucléico 
FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas 
INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia 
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana 
M molar 
pb Pares de base 
SDS Sulfato duodecil de Sódio 
Taq Termus aquaticus - polimerase termo estável 
TBE Tampão de Tris-base e ácido bórico 
V Volts 
 
xii
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 
2 JUSTIFICATIVA.......................................................................................................... 
3 OBJETIVOS................................................................................................................ 
3.1 Geral....................................................................................................................... 
3.2 Específicos............................................................................................................... 
4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 
4.1) População e Modelo de Estudo............................................................................. 
4.2) Delimitação da área de estudo............................................................................... 
4.3) Critérios de Inclusão.............................................................................................. 
4.4) Procedimentos técnicos.......................................................................................... 
4.4.1) Procedimentos histopatológicos.......................................................................... 
4.4.2) Procedimentos Moleculares................................................................................. 
4.4.3) Cortes histológicos............................................................................................... 
4.4.4 Desparafinização................................................................................................... 
4.4.5) Extração do DNA.................................................................................................. 
4.4.6) Amplificação do PCR........................................................................................ 
4.4.6) Detecção dos produtos do PCR........................................................................ 
4.4.6) Preparação do Gel............................................................................................ 
4.4.6) Preparação das amostras................................................................................. 
4.4.6) Visualização dos produtos da PCR.................................................................. 
5 RESULTADOS ................................................................................................ 
6 DISCUSSÃO .................................................................................................... 
7 CONCLUSÕES ................................................................................................. 
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 
9 ANEXOS............................................................................................................ 
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1 INTRODUÇÃO 
1.1. Considerações gerais. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é 
uma doença de evolução crônica que acomete, isoladamente ou em associação, a 
pele e mucosas do nariz, da boca, da faringe e da laringe (Veronesi et al) 2004. É 
causada por um protozoário do gênero Leishmania Ross 1903. Alexandre Cerqueira, 
em 1885, na Bahia, foi o primeiro a identificar a moléstia e a suspeitar do papel dos 
flebotomíneos como vetores. Gaspar Viana, em 1911, propôs a denominação de 
Leishmania brasiliensis para o agente da LTA. Apresenta-se agrupada em dois 
subgêneros: Viannia e Leishmania, de acordo com o local de adesão e multiplicação 
do parasita no tubo digestivo dos flebotomíneos, (Lainson & Shaw 1987). 
Atualmente sete espécies do gênero Leishmania foram identificadas no Brasil, 
seis pertencentes ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) brasiliensis, 
Leishmania (Viannia) guyanenensis, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania 
(Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) lindembergi, Leishmania (Viannia) naiffi e 
uma espécie do subgênero Leishmania: Leishmania (Leishmania) amazonensis. 
(Gontijo, Carvalho, 2003). 
O protozoário da Leishmania apresenta duas formas evolutivas principais: 
uma forma flagelada ou promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e 
em meios de cultura, e outra com flagelo interno, a amastigota, observada nos 
hospedeiros vertebrados. (Veronesi 2004 et al). 
A transmissão ao homem ocorre pela picada de vetores flebotomíneos. No 
Brasil diferentes espécies são responsáveis pela transmissão da leishmaniose, como 
estão relacionados abaixo. (Gontijo, Carvalho 2003). Referida no Quadro 1. 
 
2
 
Quadro1. Espécies de Leishmania que acometem o homem no Brasil e seus 
principais vetores. 
 
Espécies de Leishmania Principais vetores 
Leishmania (V) brasiliensis. 
Leishmania (V) guyanensis 
Leishmania (V) naiffi 
Leishmania(V) shawi 
Leishmania (V) lansoni 
Leishmania (L) amazonensis 
Lutzomyia whitmani, Lu. wellcomei e Lu. 
Intermédia 
Lu. squamiventris e Lu. umbralitis, Lu. anduzei
 
e 
Lu. whitmani 
Lu. squamiventris , Lu. paraensis e Lu. ayrozai 
Lu. whitmani 
Lu. umbiquitalis 
Lu. flaviscutellata e Lu. Olmeca 
 
A leishmaniose é primariamente uma enzootia de animais silvestres, o 
homem representa um hospedeiro acidental. Um grande número de espécies de 
mamíferos como roedores, edentados, marsupiais, procionídeos, canídeos, primatas 
e ungulados agem como reservatório de Leishmaniasp, (Arias et al 1981). 
A Leishmaniose Tegumentar Americana pode ser classificada de acordo com 
suas manifestações clínicas em forma cutânea localizada, sendo caracterizada por 
lesões ulceradas, indolores, únicas ou múltiplas e, menos freqüentemente lesões 
nodulares, vegetantes e em placa; a forma disseminada, que apresenta múltiplas 
úlceras cutâneas distribuídas em diversas áreas do tegumento; a forma cutâneo-
mucosa, caracterizada por lesões mucosas agressivas que afetam as mucosas 
nasofaríngeas de forma isolada ou concomitante a lesão cutânea e, finalmente, a 
forma difusa, com lesões nodulares múltiplas. (Ramos-e-Silva , Jacques, 2002). 
 1.2. Epidemiologia 
A Organização Mundial de Saúde estima uma incidência de 12 milhões de 
casos de leishmaniose no mundo, ocorrendo nos quatro continentes. Estimando-se 
dois milhões de novos casos (1,5 milhão de casos de leishmaniose cutânea e 
 
3
 
500.000 mil de Leishmaniose Visceral), sendo endêmica em 88 países e de 
notificação compulsória em 32 destes. (OMS 2006). Figura 1. 
Na distribuição Geográfica, 90 % dos casos de Leishmaniose Cutânea 
ocorrem no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria e 90% dos casos de 
Leishmaniose Cutâneo-Mucosa ocorrem na Bolívia, Brasil e Peru. (OMS 2006). 
 
Figura 1. Distribuição dos casos de leishmaniose cutânea no Velho e Novo 
Mundo (OMS 2006). 
No Brasil, a doença é endêmica e de elevada incidência, uma vez que no ano 
de 2006 ocorreram 23.427 casos notificados de LTA, segundo o Ministério da Saúde 
(2006). Só no Amazonas, neste mesmo ano , foram notificados 1.437 casos e em 
2005, a taxa de incidência da doença foi de 60,24/100.000 hab. No quadro abaixo 
se observa o número de casos notificados, distribuídos de acordo com a região e os 
estados com o maior número de notificações. 
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem 
se mantido elevada, como acima citado. No ano de 2003 foram notificados 3.436 
casos. A associação com atividades profissionais pode estar ausente em áreas onde 
surgiram condições para a transmissão domiciliar, por exemplo, em Manaus, no 
estado do Amazonas, onde a expansão urbana aproximou a população dos focos 
naturais da doença (Guerra 2006 et al ). 
Nas florestas vicinais, a zoonose, mantida principalmente pelo gambá, passou 
a acometer indistintamente adultos e crianças de ambos os sexos (Arias 1981). A 
 
4
 
abertura de novas estradas, a instalação de núcleos residenciais em áreas de 
floresta e os treinamentos militares constituem fatores importantes na epidemiologia 
da leishmaniose, (Guerra et al 2006). 
Na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, centro de referência do 
estado em doenças infecciosas e parasitárias, foram registrados 828 casos de 
Leishmaniose Tegumentar no ano de 2004, 823 casos em 2005 e 462 casos em 
2006, (Boletim Epidemiológico da FMTAM 2006). 
1.3. Diagnóstico Laboratorial 
O diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana abrange aspectos 
epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Os exames laboratoriais empregados são: 
pesquisa direta, isolamento em cultura, inoculação em animais de laboratório, exame 
histopatológico, exame sorológico e, mais recentemente, reação em cadeia da 
polimerase (PCR). (Safei 2002 et al ), (Gontijo et al 2003). 
1.3.1. Escarificação 
A pesquisa direta do parasito pode ser realizada em material obtido pela 
escarificação na borda da lesão ulcerada ou da lesão não ulcerada, com estilete 
descartável ou lâmina de bisturi. Realiza-se um esfregaço em lâmina, fixado em 
metanol por 3 minutos e corada pela técnica de Giemsa. O resultado positivo é dado 
pela presença, no microscópio óptico, de formas amastigotas de leishmania isoladas 
ou intracelularmente, (Gontijo, Carvalho 2003). 
1.3.2. Cultura 
O isolamento do parasito pode ser feito em cultura de tecidos biopsiados ou 
aspirados dos bordos da lesão ou a partir de inóculos em animais susceptíveis. A 
cultura permite a definição de espécie. O parasito cresce em meios de cultura como, 
por exemplo, Nicolle, Nevy e Mcneal ( NNN ), entre 24º a 26º C, após o quinto dia, 
formas promastigotas podem ser observadas, (Gontijo, Carvalho 2003). 
1.3.3. Inoculação em animais de laboratório 
Na inoculação, os animais utilizados são o camundongo e o hamster, o 
inóculo deve ser obtido a partir de uma suspensão homogeneizada do material de 
 
5
 
biópsia em solução salina estéril e aplicado preferencialmente nas extremidades 
(patas posteriores). As lesões desenvolvem-se tardiamente (a partir de um mês), 
(Ministério da Saúde 2006). 
1.3.4. Diagnóstico Imunológico 
1.3.4.1.Intrademorreação de Montenegro: traduz a resposta de 
hipersensibilidade celular retardada a uma injeção de antígeno preparado com 
promastigotas. O resultado é positivo quando se observa pápula ou nódulo maior ou 
igual a 5 mm de diâmetro ou ulceração que é lida após 48 a 72 h. Em áreas 
endêmicas, deve-se considerar a possibilidade de leishmaniose anterior ou 
exposição ao parasito sem a doença.( Gontijo, Carvalho 2003). 
1.3.4.2. Imunofluorescência Indireta (IFI) e Teste Imunoenzimático 
(ELISA): expressam os níveis de anticorpos circulantes. Nas lesões ulceradas por 
Leishmania (V) braziliensis a sensibilidade da Imunofluorescência está em torno de 
70%. Geralmente considera-se positiva a reação a partir da diluição de 1:40. 
(Ministério da saúde 2000). 
1.3.5 Histopatologia 
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a 
presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que 
o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomopatologista 
emite o laudo histopatológico de compatível com Leishmaniose Tegumentar . 
Considera-se compatível com Leishmaniose Tegumentar as biópsias de pele com 
suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico demonstre 
formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células gigantes 
tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos vacuolizados 
e moderado infiltrado de plasmócitos. ( Safaei et al 2002). 
A primeira classificação de Leishmaniose Tegumentar Americana foi proposta 
por Azulay, em 1960, que acreditava que um processo exsudativo agudo 
caracterizava histopatologicamente a fase inicial da doença e um granuloma 
tuberculóide surgisse na fase tardia. 
 
6
 
Em 1980, Ridley e colaboradores classificaram histopatologicamente 60 
biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea em cinco grupos: grupo l, que foi 
quase normal exceto por leves alterações degenerativas do colágeno; grupo ll, a 
característica predominante foi um processo necrotizante mais severo que o grupo l. 
O grupo lll corresponde a um infiltrado inflamatório acentuado sem necrose e 
granuloma. O grupo lV e V foram associados a células epitelióides e células gigantes 
multinucleadas. 
Magalhães et al 1986, na Bahia, através de um estudo histopatológico de 162 
casos de Leishmaniose cutânea e mucosa, descreveram cinco padrões 
histopatológicos distintos: 
-Tipo l reação exsudativo-celular com infiltrado inflamatório 
histiolinfoplasmocitário dérmico ou do córion da mucosa com proporções que 
tendem a equivalência; 
-Tipo ll reação exsudativo-necrótica caracterizada por necrose tissular na 
derme ou córion da mucosa de amplitude variável, além do infiltrado 
histiolinfoplasmocitário; 
-Tipo lll reação exsudativa e necrótico-granulomatosa consistente com reação 
granulomatosa desorganizada ao redor ou nas proximidades da área de necrose 
tissular, caracterizada pela presença de macrófagos ativados e de células gigantes. 
Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário. 
- Tipo lV reação exsudativa e granulomatosa com reação granulomatosa 
desorganizada isolada noseio do infiltrado inflamatório, sem presença de necrose 
tissular. Presença de infiltrado histiolinfoplasmocitário; 
- tipo V reação exsudativa e tuberculóide com reação granulomatosa 
constituída por macrófagos, células epitetióides e células gigantes, dispostas em 
arranjos tuberculóides bem delimitados, além do infiltrado histiolinfoplasmocitário. 
Bittencourt et al, em 1991, realizaram avaliação das classificações 
histopatológicas anteriores de Leishmaniose Cutânea e Leishmaniose Mucocutânea 
 
7
 
(Riddley et al 1980 e Magalhães et al 1986) propondo uma classificação mais 
simplificada com apenas três padrões. Aspectos histopatológicos distintos foram 
observados em diferentes lesões ou ainda na mesma lesão. Os autores concluem 
neste trabalho que os padrões histopatológicos não representam um estágio de 
leishmaniose tegumentar e então não podem ser correlacionados com prognóstico e 
resposta terapêutica como sugere a literatura. 
 Andrade-Narvaez et al 2005 avaliaram, através da histopatologia, 73 casos 
de leishmaniose cutânea localizada. Os achados histopatológicos foram baseados 
na classificação de Magalhães et al 1986 é o padrão mais comumente encontrado 
foi caracterizado pela presença de granulomas não organizados sem necrose 
(43,8%). A identificação do parasito foi positiva em 50/73(68,5%) dos casos. 
Ramirez et al em 2000, realizaram um trabalho comparando a sensibilidade 
do exame de esfregaço do centro e das bordas de lesões ulceradas de 115 
pacientes com leishmaniose cutânea, a sensibilidade do exame microscópico foi 
respectivamente de 90,4 e 78,3%. Quando o método da PCR foi utilizado com um 
grupo de 40 pacientes, observou-se alta sensibilidade nas amostras do cento das 
úlceras, com 80,8% versus 57,7% nas amostras colhidas das bordas da lesão. 
Outros métodos diagnósticos parasitológicos, tais como cultura e histopatológico, 
foram menos sensíveis com 67,5 e 64,3 respectivamente. A coleta simultânea para 
exame microscópico do centro e das bordas da úlcera aumentou a sensibilidade 
para 94%,sendo está rotina indicada pelo autor. 
1.3.6. REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE 
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica in vitro que permite 
a amplificação de seqüências específicas de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou de 
ácido ribonucléico (RNA), sendo este último realizado a partir da síntese de ácido 
desoxirribonucléico complementar. A PCR foi originalmente descrita por Mullis 
(1987) e desde então tem sido utilizada em vários campos da ciência. A aplicação do 
PCR permite rápida detecção e identificação do DNA dos parasitos sem a 
necessidade de isolamento, permitindo a geração de cópias de seqüências 
específicas de DNA. 
 
8
 
No diagnóstico de leishmaniose, um dos principais alvos das técnicas 
moleculares desenvolvidas é o DNA do cinetoplasto (kDNA) Rodgers et al 1990. O 
kDNA é constituído por duas moléculas, os minicírculos de 1,42 Kb e os 
maxicírculos de cerca de 36 Kb. A reação em cadeia de polimerase pode ser usada 
para aumentar a sensibilidade da detecção de
 
Leishmanias por métodos de 
hibridização através da amplificação de seqüências do minicírculo. O Método foi 
sensitivo o suficiente para detectar o kDNA de um simples organismo e essa 
sensibilidade permitiu o uso de métodos de hibridização não radioativos. (Rodgers 
et al 1990). 
Os estudos da reação em cadeia da polimerase em tecidos, fixados em 
parafina, para diagnóstico de leishmaniose foram iniciados por (Laskay et al 1995) 
que avaliou a habilidade da PCR para detectar DNA de Leishmania aethiopica em 
biópsias de pele emblocadas em parafina nos 17 casos de leishmaniose cutânea, 
confirmados pela cultura e/ou exame histopatológico de 40 pacientes com 
diagnóstico clínico de leishmaniose sem a demonstração laboratorial do parasito. O 
PCR foi positivo nos 17 pacientes com o diagnóstico confirmado laboratorialmente 
de leishmaniose e em sete dos 22 pacientes com achados histopatológicos 
consistentes com leishmaniose e negativas em todos os 18 pacientes que 
histopatologicamente não apresentavam características suspeitas de leishmaniose. 
Libório et al, em 2005, avaliaram a extração do DNA genômico de amostras 
de cavidade oral fixadas em parafina e arquivadas nos últimos 40 anos. Na reação 
em cadeia da polimerase, foram utilizados fragmentos de globina de 268pb que 
amplificou o DNA em 55% das amostras, preferencialmente nos casos mais 
recentes. Nos fragmentos com 536 pb, o gene da globina foi amplificado somente 
em 25% das amostras e também preferencialmente nos casos mais recentes. O 
fragmento do gene WAF1 com 149 pb apresentou amplificação fraca, mais presente 
em 75% dos casos, uma correlação positiva foi observada entre a quantidade de 
DNA e a idade das amostras. A eletroforese mostrou DNA genômico 
predominantemente nos fragmentos menores (com número menor de pares de 
base). 
 
9
 
Cao et al, em 2003 compararam métodos de extração de DNA de 34 
biópsias fixadas em parafina,
 
analisando o gene da globina, comparando a 
eficiência de 3 protocolos diferentes de extração. O resultado obtido foi 30/34 
(88,2%) com o uso do boiling method , 29/34 (85,3%) com utilização de fenol-
clorofórmio e 18/34 (52,9%) com um Minikit de extração. Os métodos de extração do 
DNA que utilizaram o fenol-clorofórmio e o boiling method foram os mais eficientes. 
Na amplificação da PCR de células bucais, com boiling método em 2/16 casos 
(12%), com fenol clorofórmio em 16/17 casos (94,1%) e com o Kit em 12/16 (75%). 
Safaei et al, em 2002 mostrou que a reação em cadeia de polimerase em 
tecidos parafinizados apresenta-se como um método altamente sensível (92% de 
sensibilidade) e específico (100% de especificidade) no diagnóstico de leishmaniose 
cutânea. O estudo dividiu os pacientes em dois grupos: o grupo um, cujos pacientes 
apresentavam Leishmania a histopatologia, a PCR mostrou parasito em todos os 33 
casos. No grupo dois, constituído de 29 pacientes que foram negativos à 
visualização microscópica de amastigotas, 24 amostras foram positivas através da 
PCR. Na avaliação histopatológica, os achados mostraram que a presença de 
granulomas imaturos foi diretamente correlacionada com a detecção de parasitos na 
biópsia e a presença de granulomas bem formados foi inversamente correlacionada. 
Pirmez et al, em 1999 avaliaram 216 pacientes com diagnóstico clínico de 
leishmaniose, sendo o PCR positivo em 94% (203/216) dos casos, enquanto os 
métodos convencionais (esfregaço, cultura e reação de Montengro) em 62% destes 
pacientes. Na doença mucosa o impacto foi maior, pois enquanto o diagnóstico foi 
realizado em apenas 17% (4/24) dos pacientes por técnicas convencionais, o PCR 
foi positivo em 71%(17/24) dos pacientes. 
Em estudos (Medeiros et al 2002), utilizaram a PCR em 54 biópsias de pele e 
mucosa de pacientes com diagnóstico clínico e/ou laboratorial de leishmaniose 
cutâneo americana usando primers gênero-específico (13A e 13B), com resultados 
positivos obtidos em 82% das amostras. Quando o PCR foi comparado com aqueles 
do histopatológico, o PCR mostrou resultados superiores com 81.5% de 
sensibilidade. 
 
10
 
Rodrigues et al, 2002 avaliaram 119 biópsias de pele através de PCR do DNA 
do cinetoplasto de pacientes com Leishmaniose Cutânea Americana de áreas 
endêmicas do Norte do Brasil. Foram usados primers gênero-específico e 
subgênero Viannia. O PCR específico para o subgênero Viannia teve sensibilidade 
de 95.4%, enquanto o PCR gênero-específico detectou DNA em 88.2% das 
amostras testadas. 
Faber et al, em 2003 na Holanda realizaram estudo de biópsias de pele de 46 
pacientes com suspeita clínica de Leishmaniose Cutânea através de métodos 
convencionais e encontraram sensibilidade de 65% no esfregaço, 84% na cultura, 
82% no histopatológico,87% na reação de Montenegro, compararam-nos a PCR 
que identificou 100% , demonstrando ser o mais sensível teste diagnóstico para 
leishmaniose cutânea. 
Mimori et al 1998 realizaram estudo para identificação das cinco principais 
espécies de Leishmania que causam Leishmaniose Cutânea do Novo Mundo em 
biópsias fixadas em parafina através da reação em cadeia de polimerase, 
enfatizando sua importância no arsenal de ferramentas utilizadas no diagnóstico de 
leishmaniose cutânea. 
Na Amazônia, em particular no Estado do Amazonas, a incidência de LTA tem 
se mantido elevada. A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, que atende em 
média 47,5% dos casos de leishmaniose do Estado, vem registrando em torno de 
1.000 casos novos a cada ano, quase todos oriundos do Município de Manaus, 
principalmente de áreas periféricas da cidade e das rodovias AM-010 e BR-174. 
A doença é endêmica e de elevada incidência no estado do Amazonas; 3.436 
casos notificados em 2003. Assim, trabalhos visando seu estudo são importantes, 
principalmente quando dão ênfase a fase crônica da doença, quando outros 
métodos falham em demonstrar o parasita na lesão, como exemplo, exame direto, 
cultura in vitro e histopatológico, pois requerem a presença de número relativamente 
alto de microorganismos intactos morfologicamente, sendo mais sensíveis apenas 
nos primeiros meses de doença . 
 A busca de técnicas mais especificas e reprodutíveis como a PCR ajudam na 
decisão de condutas clínicas e ações de caráter epidemiológico. Na reação em 
 
11
 
cadeia da polimerase, o diagnóstico pode ser dado mesmo na presença de 
quantidades reduzidas de DNA do parasita, permitindo inclusive o conhecimento das 
espécies de Leishmania causadoras da doença e minimizando os falsos 
diagnósticos, como também os efeitos adversos da terapia para leishmaniose. 
O presente estudo dá ênfase ao uso da PCR como ferramenta importante no 
diagnóstico de Leishmaniose Cutânea, principalmente na fase crônica da doença, 
quando os métodos tradicionais apresentam sua sensibilidade diminuída em 
decorrência do número reduzido de parasitos encontrados. 
 
12
 
2 OBJETIVOS 
 
2.1 Objetivos Gerais 
- Diagnosticar Leishmaniose Tegumentar Americana através da PCR em tecidos 
parafinizados com laudos histopatológicos compatíveis com leishmaniose 
tegumentar americana. 
2.2 Objetivos Específicos 
- Estudar a utilização do PCR no diagnóstico de LTA em tecidos parafinizados, tendo 
como padrão diagnóstico o laudo histopatológico de compatível com LTA; 
- Estabelecer o padrão histopatológico através da microscopia óptica das biópsias de 
pele compatível com LTA e PCR positivo; 
- Realizar estudo comparativo com biópsias de pele PCR positivo com ausência de 
amastigotas e PCR positivo e presença de amastigotas a histopatologia. 
 
13
 
3 MATERIAL E MÉTODOS 
3.1) População e Modelo de Estudo 
Foi realizado estudo transversal, retrospectivo com delineamento do tipo 
detecção de casos através da técnica de reação em cadeia de polimerase e revisão 
de 90 biópsias de pele com diagnóstico histopatológico compatível com 
Leishmaniose Tegumentar Americana (c/c LTA) da Gerência de Anatomia Patológica 
e análise das Fichas Ambulatoriais do arquivo da Gerência de 
Leishmaniose/Dermatologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas 
(FMTAM) no período de 2003 e 2004. 
Foram usados como controles positivos biópsias com diagnóstico 
histopatológico de Leishmaniose tegumentar realizadas na FMTAM e amostras de 
cultura de leishmaniose cedidas pelo Laboratório de Leishmaniose do Instituto de 
Nacional de Pesquisa da Amazônia e como controles negativos biópsias de pele 
com outras patologias, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge Lobo, 
cromomicose tuberculose cutânea e micobacteriose atípica realizadas na FMTAM no 
período de 2003 a 2004. 
3.2) Delimitação da área de estudo 
As amostras foram obtidas dos blocos em parafina de biópsias de pele 
arquivados no Laboratório de Patologia da FMTAM, Centro de Referência Terciária 
no atendimento de doenças infecciosas na cidade de Manaus. 
A cidade de Manaus é a capital do estado do Amazonas e possui população 
estimada pelos dados do IBGE para 2006 de 1.688,524 habitantes, com área 
territorial de 11.401,06 km2, situada na margem esquerda do Rio Negro, a 92m 
acima do nível do mar e apresenta clima quente e úmido. A economia está baseada 
no turismo e montagem de artigos eletroeletrônicos e setor de duas rodas. 
3.3) Critérios de Inclusão: 
- Biópsia colhida devido a suspeita clínica de Leishmaniose Tegumentar Americana; 
- Biópsia com laudo histopatológico compatível com Leishmaniose Tegumentar 
Americana; 
- Quantidade de tecido representativo para a realização da PCR. 
 
14
 
3.4) Comitê de Ética: 
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos 
da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas em janeiro de 2006 (n.1757/05). 
3.5) Procedimentos realizados: 
 3.5.1) Estudo clínico dos pacientes c/c LTA a histopatologia 
Foram analisadas 90 Fichas Ambulatoriais colhidas na gerência de 
Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas 
na gerência de Anatomia Patológica. 
3.5.2) Procedimentos histopatológicos: 
Os procedimentos histopatológicos foram realizados no serviço de patologia 
do FMTAM e seguiram padronização técnica, (Prophet 1994). 
Foram revisadas as 90 lâminas dos histopatológicos, com laudo de 
compatíveis com leishmaniose tegumentar americana, do arquivo da Gerência de 
Anatomia Patológica dos anos de 2003 e 2004, 
O exame histopatológico permite a visualização direta do parasito e/ou a 
presença de características histopatológicas sugestivas de LTA. Nos casos em que 
o exame histopatológico não visualiza o agente etiológico, o anatomo-patologista 
emite o laudo histopatológico de compatível com Leishmaniose Tegumentar . 
 Considera-se compatível com Leishmaniose Tegumentar as biópsias de 
pele com suspeita clínico-epidemiológica de LTA cujo exame histopatológico 
demonstrou formações granulomatosas, constituídas por células epitelióides, células 
gigantes tipo Langhans, linfócitos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, histiócitos 
vacuolizados e moderado infiltrado de plasmócitos. O desejável é o diagnóstico de 
certeza, visto que, outros agentes etiológicos podem exibir o mesmo padrão 
histopatológico, ou seja, inflamação granulomatosa crônica. Figura 2 
 
15
 
IV 
Figura 2. Padrão histopatológico das biópsias compatível com Leishmaniose 
cutânea: caracterizado por infiltrado inflamatório crônico granulomatoso constituído 
por linfócitos, histiócitos, plasmócitos células epitelióides e células gigantes 
multinucleadas. 
As biópsias foram agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de 
Magalhães et al 1986. Numa etapa posterior, 43 biópsias dos 90 pacientes c/c LTA e 
40 biópsias dos pacientes com diagnóstico de LTA comprovado na microscopia pela 
visualização das amastigotas foram avaliadas histopatologicamente, sendo 
verificadas as seguintes características: hiperplasia, ulceração, necrose e presença 
de granulomas. O exame microscópico foi realizado avaliando-se seis campos com 
aumento de 200x em cada lâmina corada pela hematoxilina-eosina, provenientes do 
arquivo da Gerência de Anatomia Patológica da FMTAM. 
 Foram analisados também nos seis campos, em aumento de 200x, o número 
médio de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes c/c LTA à microscopia óptica e 
PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes com diagnóstico de LTA à 
microscopia óptica (com presença de amastigotas). 
 
 
163.5.3) Procedimentos Moleculares: No protocolo para a realização da PCR as 
seguintes etapas foram realizadas: 
3.5.3.1) Cortes histológicos: 
Os blocos de tecido parafinizados foram submetidos a cortes de 20 m com 
navalhas descartáveis, uma navalha para cada bloco, em micrótomo usual. Os 
cortes foram acondicionados em microtubos estéreis e mantidos em geladeira até o 
momento dos procedimentos para PCR. 
3.5.3.2) Desparafinização. 
- Adicionou-se aos cortes de 20 m armazenados previamente 1,0 ml de xilol 
aquecidos em banho-maria a 65º C por 10 min e a seguir centrifugou-se a 13.000 
rpm por 5 min a 4º C. Desprezou-se o sobrenadante. O procedimento de lavagem 
com xilol foi repetido por duas vezes. O sedimento foi mantido à temperatura 
ambiente em etanol a 100% até completa evaporação do etanol e obtenção de 
resíduo seco (em torno de 2h). 
3.5.3.3) Extração do DNA: 
1) Protocolo de fenol/clorofórmio. Isola et al (1994) 
- Adicionou-se 500µL de solução tampão ao resíduo seco (0,1M de Nacl 0,01 de Tris 
Hcl pH 8,0 e 0,001M de EDTA com pH 8,0), 15 L de proteinase k a 1% e 75 L de 
sulfato de duodecil a 10%, misturando-se cuidadosamente os tubos por inversão. 
- As amostras permaneceram em banho-maria a 56º C em pernoite e foram 
misturadas para dissolver qualquer resíduo sólido. Adicionou-se 600 L de fenol 
agitando-se por inversão por 2 minutos, centrifugando-se as amostras a 14000 rpm 
por 10 minutos. Em novos tubos retirou-se a fase aquosa, preservando o que não 
pode ser coletado. 
- Adicionou-se 600 L de fenol-clorofórmio/álcool isoamilico (24:24:1) e agitou-se por 
inversão durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 10 
minutos e em novos tubos, desprezou-se o sobrenadante. 
- Adicionou-se 600 L de clorofórmio e misturou-se por 2 minutos, realizou-se 
centrifugação das amostras a 14000 rpm por 10 minutos e troca para novos tubos, 
desprezando o sobrenadante. 
 
17
 
- Adicionou-se 55 l de 5M NaCl em cada tubo (10% do volume total) e 1000 l de 
álcool absoluto (a 95%), misturou-se cuidadosamente os tubos por inversão. 
- As amostras permaneceram à temperatura de - 20ºC em pernoite e então foram 
centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool, deixando o 
resíduo que foi lavado em 500 L de álcool a 70% . Removeu-se o álcool, deixando 
o resíduo de DNA secar a temperatura ambiente e depois se dissolveu o resíduo em 
50 l de água. Armazenou-se o DNA à temperatura de -20º C em freezer. 
2) Protocolo de extração com sal. (Disch et al 2004) 
- Após a retirada da parafina, colocou-se em banho-maria e adicionou-se 500 l de 
solução tampão STF buffer e 15 l de proteinase k a 1% e 75 l de sulfato de 
duodecil a 10% em cada tubo, misturou-se cuidadosamente os tubos com 
movimentos de inversão. As amostras permaneceram em pernoite no banho-maria 
(56°C) e foram misturadas para dissolver qualquer fragmento sólido. 
- Adicionou-se 60 l de 5M NaCl em cada tubo (volume total de 10%) e misturou-se 
o conteúdo dos tubos por inversão, permanecendo em refrigeração de 1h ao 
pernoite. Centrifugaram-se as amostras a 14000 rpm por 10 minutos. 
- Retirou-se a parte aquosa e colocou-se o sobrenadante em novos tubos, 
permanecendo no gelo. Centrifugou-se o sobrenadante a 14000 rpm por 5 minutos. 
O sobrenadante foi colocado em novos tubos e adicionou-se 1000 l de álcool 
absoluto (a 95%) que foram misturados cuidadosamente. As amostras 
permaneceram em pernoite no freezer a -20° C. Centrifugaram-se as amostras a 
14000rpm por 10 minutos. Desprezou-se o álcool deixando o resíduo de DNA, 
adicionou-se 500 l de álcool a 70%. Repetiram-se as etapas de centrifugação e 
retirada do álcool, deixando o resíduo secar a temperatura ambiente. Quando os 
tubos secaram, o resíduo foi ressuspenso em 50 L de água. Armazenou-se o DNA 
a - 20°C em freezer. 
Obs: Solução tampão (STE): 0,1M de NaCl, 0,01M deTris HCL (pH 8,0), 0,001M 
EDTA (pH 8,0). 
3.5.3.4) Amplificação da PCR: 
Para a realização da PCR utilizou-se uma enzima termoestável (DNA polimerase) 
que, na presença de oligonucleotídios iniciadores (primers) e dos nucleotídeos, que 
 
18
 
compõem a molécula de DNA, amplificou a região de interesse. Molina et al 2004. 
Foram usados primers para amplificar regiões do minicírculo do DNA do cinetoplasto 
da Leishmania (kDNA). A seqüência de nucleotídeos dos primers utilizada foi 
Leishmania sp 13 A (5-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3), 13 B (5- 
ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3) e seguiu protocolo de (Rodgers et al 1990). 
Esta amplificação ocorreu durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 
94ºC para a desnaturação (separação das fitas de DNA), de 45ºC a 70ºC para o 
anelamento (ligação) dos nucleotídeos iniciadores (primers da marca Invitrogen) às 
seqüências complementares e 72ºC para a síntese do DNA com a ligação dos 
nucleotídeos complementares da marca Invitrogen, realizada pela enzima taq 
polimerase da marca Invitrogen em equipamentos chamados de termocicladores, 
utilizou-se termociclador da marca Eppendorf Mastercycler gradient. 
As amostras de DNA foram adicionadas à mistura contendo os seguintes 
reagentes: Tampão 1x, dNTP 1mM, MgCl 1,5mM, Primer 1mM, Taq polimerase 2,5 
u/ L . A reação de amplificação ocorreu no termociclador com sucessivas mudanças 
de temperatura abaixo assinaladas. Quadro 3. 
Ciclos/Repetições Temperatura/Tempo 
Pré-ciclo 1 94ºC - 2 min 
 Ciclo 40 94ºC - 45 seg. 
 
50ºC - 45 seg. 
 
72ºC - 45 seg. 
Pós-ciclo 1 72ºC 7 min 
 
Quadro 3. Número de ciclos, tempo e temperatura da reação de amplificação no 
termociclador. 
3.5.3.5) Detecção dos produtos da PCR 
Após a reação PCR, as amostras foram submetidas a uma separação 
eletroforética (cuba de eletroforese Maxfill) em gel de agarose submerso em tampão 
TBE 1x e corado por brometo de etídio, o material amplificado foi visualizado como 
uma banda e analisado de acordo com o seu peso molecular, (Davis et al 1994). 
 
19
 
3.5.3.6) Preparação do Gel 
Adicionou-se 3g de agarose em 150mL de tampão TBE1x que foi 
completamente dissolvido sobre aquecimento em microondas durante 4 minutos. 
Adicionou-se 2,5 L de brometo de etídio para cada 50mL de solução contendo 
agarose e o tampão TBE. 
3.5.3.7) Preparação das amostras 
Aplicação do gel na cuba de eletroforese, aplicaram-se os pentes para a 
formação dos poços, adicionou-se solução tampão TBE1x, as amostras 
homogeneizadas 1mM e 2 l do Ladder de marca Invitrogen com intervalo para 
identificação de fragmentos de DNA entre 100 e 1500 pares de base foram 
transferidos com o auxilio de uma micropipeta para cada um dos poços do gel. A 
cuba foi conectada à fonte de eletroforese durante 60 min. 
3.5.3.8) Visualização dos produtos da PCR 
Após o termino da eletroforese, o gel de agarose foi retirado da cuba e levado 
para a visualização sobre luz ultravioleta no transiluminador UVP (Upland CA91786 
USA Model, 115 v 60Hg, 60 Amps). As fotos foram obtidas com maquina fotográfica 
digital Canon Power Shot G6 e repassadas ao computador através de cabo de USB, 
as imagens obtidas foram gravadas em formato de arquivo JPEG para 
documentação e os produtos amplificados foram analisados. 
A análise do gel consistiu na visualização das "bandas" dos produtos 
amplificados, comparativamente com os produtos amplificados relativos aos 
controles positivos negativos e os Ladder estipulados em cada PCR realizado. 
3.5.3.9) Controles positivos e negativos 
 Em cada grupo de amplificações foram utilizados como controles positivos 
biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de Leishmaniose Tegumentar 
Americana com moderada ou acentuada quantidade de parasitos visualizados à 
microscopia óptica e culturas de leishmaniose de cepas cedidas peloINPA e como 
controles negativos biópsias de pele com diagnóstico histopatológico de outras 
doenças granulomatosas, a saber: eritema nodoso, hanseníase, doença de Jorge 
Lobo, cromomicose, tuberculose cutânea e micobacteriose atípica. Além desses, 
 
20
 
também foi incluída uma alíquota da mistura de reagentes, sem DNA, para descartar 
contaminações da mesma. 
3.6) Análise estatística 
 Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número 
de linfócitos e plasmócitos das biópsias c/c LTA e PCR positiva, comparando com os 
pacientes com Leishmanias evidenciadas a histopatologia. 
 
21
 
 4 RESULTADOS 
4.1. Resultados do estudo clínico dos pacientes compatíveis com LTA 
4.1. 1 . sexo. 
 O resultado da análise das 90 fichas ambulatoriais colhidas na gerência de 
Leishmaniose da FMTAM dos pacientes c/c LTA cujas biópsias foram examinadas 
na gerência de Anatomia Patológica, mostrou um predomínio do sexo masculino 
com 75 casos (85,2 %) sobre o feminino com 13 casos (14,8%). Figura 3. 
Masculino
85,2%
Feminino
14,8% 
Figura 3. Distribuição dos pacientes c/c LTA a histopatologia quanto ao sexo. Mas = 
masculino, Fem = feminino. N (88). 
4.1.2. Faixa etária. 
A faixa etária mais acometida variou entre 20 e 39 anos de idade com 38 
pacientes (42,69% dos casos), a idade média dos pacientes foi 32,36 anos (de dois 
até 72 anos). Tabela 1. 
 
22
 
 Tabela 1. Distribuição dos pacientes c/c LTA de acordo com a faixa etária. 
Faixa etária Freqüência % 
0-12 
13-19 
20-39 
40-59 
 60 
Total 
 4 
20 
38 
 20 
 7 
 89 
 4,49 
 22,47 
 42,69 
 22,47 
 7,86 
 100 
 
4.1.3. Localização das lesões. 
As lesões dos pacientes c/c LTA localizaram-se mais freqüentemente no 
membro inferior esquerdo com 19 amostras (26,02%) e membro superior esquerdo 
com 15 pacientes (20,54%). Figura 4. 
MSE MSD MIE MID OU
LOCALIZAÇÃO
0
5
10
15
20
25
30
N
 
°
 
D
E 
C
AS
O
S 
 
Figura 4. Principais localizações das lesões ulceradas nos segmentos do corpo. 
MSD = membro superior direito, MID = membro inferior direito, MSE = membro 
superior esquerdo MIE = membro inferior esquerdo, OU = outras localizações. 
 
4.1.4. Número de lesões ulceradas 
Na maioria dos casos, 48 pacientes (75%) apresentavam uma ou duas 
lesões, o número de lesões variou entre um e 20 lesões ulceradas. A média do 
 
23
 
número de lesões foi de 2,5 e em 33(51,56%) dos casos, o paciente apresentava 
apenas uma lesão. Tabela 2. 
Tabela 2. Distribuição do número de lesões ulceradas dos pacientes c/c LTA ( N = 
64). 
Número de lesões Freqüência % 
1 
 2 
 3 
4 
5 
6 
 7 
Total 
33 
 15 
 7 
2 
2 
3 
2 
 64 
51,56 
 23,47 
 10,93 
3,12 
3,12 
4,68 
3,12 
 100 
 
4.1.5. Tempo de evolução das lesões ulceradas. 
O tempo de evolução das lesões ulceradas, correspondente ao período do 
início dos sintomas e a consulta no ambulatório de Leishmaniose, ocorreu 
predominantemente nos primeiros três meses de evolução em 59,32%, em 86,44% 
dos casos o tempo de evolução foi maior que de um mês. Tabela 3. 
Tabela 3. Freqüência de casos de c/c LTA de acordo com o tempo de evolução em 
intervalo de meses. N=59. 
Tempo de lesão 
(meses) 
Freqüência % 
< 3 m 
3-5 m 
6-11 m 
12 m 
 Total 
35 
18 
5 
1 
 59 
59,32 
30,50 
8,47 
1,69 
 100 
 
 
24
 
4.2. Estudo laboratorial. 
4.2.1. Resultados da reavaliação histopatológica 
As 90 biópsias dos pacientes c/c LTA a histopatologia foram revisadas e 
agrupadas de acordo com a classificação histopatológica de Magalhães et al 1986, 
19 amostras (21,11%) foram classificados como do tipo I (reação exsudativa e 
celular), 11 (12,22%) do tipo III (reação exsudativa e necrótica-granulomatosa), 56 
pacientes (62,22%), correspondendo à maioria dos casos, foram classificados como 
do tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa), Figura 5. Um paciente (1,11%) foi 
classificado como do tipo V (reação exsudativa e tuberculóide), nenhum paciente foi 
agrupado como do tipo II (reação exsudativa e necrótica). Entre estes pacientes 
classificados de acordo com Magalhães et al, três demonstraram PCR negativa (dois 
casos classificados como do tipo III e um paciente do tipo IV), Tabela 7. 
Figura 5. Tipo histopatológico mais freqüentemente encontrado no presente estudo. 
Tipo IV de Magalhães et al 1986. 
Tabela 4. Distribuição do número de casos de acordo com o tipo histopatológico 
usando a classificação de (Magalhães et al 1986). 
 
25
 
PCR + % PCR - % TOTAL % 
TIPO I 
TIPO II 
TIPO III 
TIPO IV 
TIPO V 
NÃO CLAS. 
TOTAL 
19 
0 
9 
55 
1 
3 
87 
21,11 
0 
10 
60 
1,11 
3,33 
96,66 
0 
0 
2 
1 
0 
0 
3 
0 
0 
2,22 
1,11 
0 
0 
3,33 
19 
0 
11 
56 
1 
3 
90 
21,11 
0 
12,22 
62,22 
1,11 
4,44 
100 
 
Outros três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com infiltrado 
inflamatório incipiente, constituído por escassos linfócitos, histiócitos e proliferação 
fibrovascular, não evidenciando características suficientes para serem agrupados na 
classificação acima utilizada. 
Numa etapa posterior, 43 dos 90 pacientes c/c LTA, a partir do caso com 
numeração histopatológica mais baixa, foram escolhidos um caso sim e outro não, 
sendo verificadas as seguintes alterações histopatológicas: hiperplasia, ulceração, 
necrose e presença de granulomas. A ulceração foi presente em 11 casos (25,58%) 
e ausente na maioria dos casos 32 (74,41%). A hiperplasia do epitélio de 
revestimento ocorreu em 36 (90 %) dos casos e ausente em quatro (10 %). A 
necrose foi presente em apenas 11 casos (25,58%) e ausente em 32 (74,41%) 
correspondendo a maioria dos casos. Os granulomas foram presentes em 39 dos 43 
casos correspondendo a 90.69% . Tabela 5. 
Tabela 5. Resultado da análise das características histopatológicas das biópsias c/c 
LTA . 
Ausente % Presente Total % 
 Ulceração 
 Hiperplasia 
 Necrose 
 Granuloma 
32 
4 
1. 32 
4 
74,41 
 10 
74,41 
9,3 
11 
36 
11 
39 
43 
40 
43 
43 
25,58 
 90 
25,58 
90,69 
 
Foram avaliadas as mesmas características em 40 biópsias de pacientes com 
LTA comprovada pela visualização das amastigotas a histopatologia, retiradas do 
 
26
 
arquivo da Gerência de Anatomia Patológica dos anos de Janeiro de 2004 a 
Fevereiro de 2007. A ulceração foi positiva em 25(62,5%) casos e negativa em 
15(37,5%). A hiperplasia foi presente em 38 casos (95%) e negativa em dois casos 
(5%). A necrose surgiu em três casos (7,5%) e foi ausente em 37 (92,5%). A 
presença de granuloma foi encontrada em 15 casos (37,5%) e ausente em 25 (62,5 
%). Tabela 6. 
Tabela 6. Distribuição dos casos de LTA a microscopia óptica de acordo com 
características histopatológica. 
AUSENTE % PRESENTE Total % 
ULCERAÇÃO 
HIPERPLASIA 
NECROSE 
GRANULOMA 
15 
2 
37 
25 
37,5 
5 
92,5 
62,5 
25 
38 
3 
15 
40 
40 
40 
40 
62,5 
95 
7,5 
37,5 
 
 Realizou-se o Teste estatístico de Z para comparar as proporções das 
características histopatológicasdescritas, a saber: ulceração, hiperplasia, necrose e 
presença de granuloma dos pacientes compatíveis com LTA e dos pacientes com 
LTA. O resultado demonstrou diferença estatística significativa quando 
correlacionada ulceração, necrose e presença de granuloma e diferença estatística 
não significativa quando analisada a presença de hiperplasia. Os resultados foram 
descritos na tabela 7. 
Tabela 7. Resultado do teste estatístico para proporções (Teste Z) das 
características histopatológicas 
Ulceração 
Hiperplasia 
Necrose 
Granuloma 
c/c LTA 
0,25 
0,90 
0,25 
0,90 
LTA 
0,62 
0,95 
0,07 
0,40 
Valor do P 
p= 0,00 
p= 0,67 
p= 0,02 
p= 0,00 
 
 
27
 
 Foram analisados também o número de linfócitos e plasmócitos em 36 pacientes 
c/c LTA à microscopia óptica e PCR positivo para gênero leishmania e 32 pacientes 
LTA positivos à microscopia óptica. O número médio nos casos c/c LTA foi, linfócitos 
13,35 e plasmócitos 11,72. Nos casos positivos para LTA, a microscopia apresentou 
um número médio de linfócitos de 7,34 e de plasmócitos foi de 7,37. Tabela 7. 
Tabela 8. Distribuição do número médio de linfócitos e plasmócitos nos pacientes c/c 
LTA e PCR positivo e negativo para gênero Leishmania e nos casos positivos para 
LTA a microscopia óptica. 
Nº. médio C/C LTA (PCR+) LTA 
LINFÓCITOS 
 PLASMÓCITOS 
13,35 
11,72 
7,34 
 7,37 
 
 Realizou-se um estudo através do Teste-t entre as médias do total do número 
de linfócitos e plasmócitos das amostras c/c LTA e PCR positiva, escolhidas de 
forma alternada dos 90 casos estudados e 32 amostras com diagnóstico de LTA a 
histopatologia. Evidenciando um p=0,0009 para a diferença do número de linfócitos 
entre os dois grupos e um p=0,017 para a diferença do número de plasmócitos, 
demonstrando assim diferença estatística significativa (p< 0,05). 
4.2. 2. Resultados obtidos pelo estudo utilizando a PCR 
Os resultados obtidos com a PCR para gênero demonstraram a presença de 
DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos estudados. Na figura 6 Observa-se a 
amplificação de bandas de aproximadamente 120 pb, correspondentes a região 
conservada do minicírculo de kDNA, nas amostras 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 , 
sendo a amplificação negativa nas amostras 13 e 14. A amostra 17 corresponde ao 
controle negativo (biópsia de pele com outras patologias granulomatosas) e a 
amostra um apresentou banda fraca sendo posteriormente confirmada como 
positiva. 
 
28
 
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 2, 0% corado pelo brometo de etídio representando os 
produtos de amplificação de DNA de Leishmania através de PCR. Amostras de pacientes c/c LTA 
negativas para a amplificação do DNA de Leishmania sp. L = Ladder, CN = controle negativo. 
 
29
 
5 DISCUSSÃO 
A reação em cadeia de polimerase tem sido grandemente aplicada para a 
detecção de agentes infecciosos, tal como vírus, bactérias e protozoários, (Weigle et 
al 2002). O diagnóstico de Leishmaniose Cutânea através dos métodos diagnósticos 
tradicionais tal como cultura in vitro e o exame histopatológico requerem a presença 
de número relativamente alto de microorganismos morfologicamente intactos, 
porém, na fase crônica da Leishmaniose Cutânea o número de parasitos nas 
biópsias de pele é muito baixo, tornando difícil o diagnóstico nas fases tardias.( 
Laskay et al 1995); (Salman et al 1999). (Gontijo et al 2003). 
 
Neste estudo, na avaliação dos dados clínicos e epidemiológicos, verificou-se 
um predomínio do sexo masculino, em idade produtiva, com uma variação ampla na 
faixa etária, de crianças a idosos, com maior freqüência nos membros inferiores, 
resultados semelhantes são amplamente referidos na literatura. O sexo masculino e 
a idade dentro da faixa produtiva seriam decorrentes de hábitos e profissões que 
manteriam o homem em contato maior com o vetor. Veronesi et al 2004. 
Na literatura, vários trabalhos correlacionam a maior incidência de LTA em 
homens a profissões exercidas predominantemente pelo sexo masculino que 
adentrariam as matas, aproximando, assim, o homem do vetor transmissor da 
doença. Os treinamentos militares na selva amazônica constituem importantes 
fatores na incidência de leishmaniose tegumentar americana, (Guerra et al 2003). 
Basano et al, em 2004 em Rondônia fizeram um estudo abordando histórico, 
epidemiologia e perspectivas de controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, 
correlacionaram os perfis básicos de transmissão da LTA no Brasil: referem um perfil 
puramente silvestre, associado à abertura de estradas, mineração e agricultura, um 
perfil peridomiciliar menos freqüente e um perfil na interface da área peridomiciliar 
com nas áreas das matas relacionado com a agricultura. 
Achados similares ao presente trabalho foram encontrados por Romero et al 
em 2001 que fizeram um estudo comparativo clínico e de achados laboratoriais de 
pacientes do estado da Bahia, Brasil com Leishmania brasiliensis (grupo A) e 
pacientes do estado do Amazonas, Brasil com Leishmania guyanensis (grupo B) 
 
30
 
encontraram uma predomínio no sexo masculino com respectivamente 74% e 81% 
dos casos, a média de idade foi de 23 anos no grupo A (de 11-57 anos) e 25 anos 
no grupo B (de 8-60 anos). Correlacionando a localização das lesões ulceradas, o 
segmento corporal mais freqüentemente comprometido foram os membros 
inferiores, com 60% no grupo A e 47% no grupo B. 
De forma similar ao presente estudo, outro trabalho demonstra o predomínio 
do sexo masculino, com faixa etária, e Ramirez et al em 2000 na Colômbia fizeram 
um estudo clinico e laboratorial da Leishmaniose Cutânea em 115 pacientes, 
encontrando também um predomínio do sexo masculino (81,7%), com lesão única 
(64,5%), mais freqüentemente na faixa etária de 18 a 35 anos (59,1%). 
Nossos resultados aproximam-se também de Passos et al em 2001 que 
fizeram estudo descritivo retrospectivo com 358 pacientes com suspeita clínica de 
LTA, avaliando fatores clínicos, laboratoriais e terapêuticos, encontrando um 
predomínio em homens (65,3%), com idade média entre seis meses e 80 anos 
(mediana = 32 anos). 
Passos et al em 2001 fizeram também referência às localizações das lesões 
ulceradas nos segmentos corporais, encontrando em ordem decrescente de 
freqüência: membro inferior, membro superior, cabeça, tronco, abdome e genitália. O 
predomínio de áreas expostas do corpo e do aspecto ulcerado corresponde à 
descrição mais freqüente das lesões cutâneas da LTA. 
 
A distribuição por gênero e idade sugere a coexistência de dois modelos de 
transmissão da LTA compreendendo o maior grupo de homens, adultos, que sugere 
transmissão extradomiciliar em população economicamente ativa, enquanto que o 
atendimento de mulheres e crianças sugere uma transmissão intra e/ou 
peridomiciliar. Ampuero et al em 2006 na Bahia levantaram está possibilidade da 
transmissão peridomiciliar, fazendo um estudo retrospectivo, analisando 4.640 fichas 
de atendimento ambulatorial de LTA, encontrando 491 crianças de 0 a 5 anos de 
idade. 
Na análise dos nossos dados, de acordo com a classificação histopatológica 
de Magalhães et al 1986, ocorreu um predominou do grupo IV(reação exsudativa e 
 
31
 
granulomatosa) correspondendo à maioria dos casos. Resultado semelhante foi 
encontrado por Andrade-Narvaez et al 2005 que fizeram um estudo histopatológico 
da leishmaniose cutânea na Penísula de Yucatan, no México, os achados foram 
agrupados de acordo com a classificação proposta por Magalhães et al 1986, 
encontrando com maior freqüência o tipo IV (reação exsudativa e granulomatosa)em 43,83% dos casos. As 73 biópsias de Leishmaniose Cutânea apresentaram um 
predomínio do sexo masculino 93,15%, a idade variou entre sete e 69 anos e mais 
comumente com uma única lesão em 82,19% e localizada na orelha em 35% dos 
casos. 
Duarte et al, em 2002 fizeram um estudo em Alagoas de 21 pacientes com 
diagnóstico clínico e epidemiológico de Leishmaniose Cutânea, confirmados pelo 
uso de anticorpo policlonal anti-leishmania. Na análise histopatológica baseada na 
classificação de Magalhães et al 1986, encontraram um predomínio dos grupos I e II. 
No presente estudo os tipos histopatológicos mais encontrados fora o tipo I e IV. 
 O estudo analisou e quantificou através da imunohistoquímica os dendrócitos 
dérmicos, FXIIIa+, as células de Langerhans CD1a+, os macrófagos CD68+, 
linfócitos B CD20 e linfócitos T CD3+, comparando os resultados com a pele 
normal. 
 Safei et al em 2002 no Iran também analisaram a presença de inflamação 
granulomatosa que foi encontrada em 52 dos 54 pacientes com PCR positivo nas 
biópsias de pele com suspeita clínica de LTA . No presente trabalho também 
encontramos a presença de granuloma na maioria dos casos, 83,72% dos pacientes 
compatíveis com leishmaniose cutânea e PCR positivo. 
Medeiros et al em 2005 no estado de São Paulo, Brasil, fizeram um estudo 
com 54 biópsias de pele e mucosa e compararam o resultado da PCR com a 
presença de granulomas detectados a histopatologia. Das 44 amostras com PCR 
positiva, 25 apresentaram granulomas (56,8%) e sete dos 10 casos com PCR 
negativo não apresentavam formação de granulomas. No presente trabalho, os 
granulomas foram encontrados em 90.69% dos casos c/c LTA a histopatologia e 
PCR positiva. 
O achado de reação granulomatosa como característica histopatológica 
importante no presente estudo pode denotar o tempo de evolução da doença, pois a 
 
32
 
maioria dos pacientes (86,44%) apresentava tempo de evolução maior que um mês. 
Alguns autores relatam uma estreita correlação com o tempo de doença e a 
presença de granuloma. 
Azulay 1960 realizou estudo histopatológico descrevendo a inflamação 
exsudativa aguda como modalidade reacional de início na evolução da LTA e a 
formação de granulomas como um processo tardio. Laurenti et al 1990 realizaram 
um estudo dos eventos histopatológicos que ocorrem na formação do granuloma, 
concluindo que na pele a formação do granuloma é usualmente completada dentro 
de 45 dias após a inoculação do parasito. 
No presente estudo, três pacientes apresentaram PCR positiva mesmo com 
granulomas incipientes, linfócitos, histiócitos e proliferação fibrovascular, não 
evidenciando características suficientes para serem agrupadas na classificação 
acima utilizada. Alguns estudos científicos demonstraram que, mesmo após a cura 
clínica, testes moleculares evidenciaram DNA de Leishmania e em alguns casos 
parasitos viáveis através da cultura de amostras de cicatrizes de Leishmaniose 
Cutânea. (Mendonça et al 2004); (Botelho et al 2003). 
 
A PCR pode ser de especial importância para o diagnóstico de Leishmaniose 
Cutânea nas fases crônicas da doença quando outros métodos falham em 
demonstrar o parasito nas lesões granulomatosas, sendo alta a sua sensibilidade. 
Furtado 1980, em seu estudo refere que a chance de encontrar o parasito nas 
lesões ulceradas é inversamente proporcional ao tempo de evolução da doença que 
no caso de LTA causada por Leishmania (V) brasiliensis seria de 100% nos 
primeiros 2 meses, 75% até os 6 meses e 20% acima de 12 meses de evolução. 
 Os resultados obtidos com a PCR para gênero Leishmania no presente 
estudo demonstraram a presença de DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos 
com suspeita clínica e histopatológica de LTA, porém, sem evidências do parasita à 
microscopia, vários estudos na literatura, de forma similar apontam a alta 
sensibilidade do PCR como ferramenta no diagnóstico de Leishmaniose cutânea, 
mesmo em tecidos fixados em formol e emblocados em parafina. 
 
33
 
No presente estudo, a extração de DNA de biópsias fixadas em formol e 
emblocadas em parafina permitiu a amplificação do DNA através da reação em 
cadeia de polimerase em 96,66% das biópsias de pacientes c/c LTA, demonstrando 
assim, alta sensibilidade. Alguns autores como Momeni et al 1996, no entanto, 
alegam uma baixa sensibilidade do método em decorrência da degradação do DNA 
pela fixação em formol e o tempo de emblocamento. Vários outros autores, Laskay 
et al 1995, Rodgers et al 1990. 
 
Weigle em 2002 na Colômbia estudou casos agudos e crônicos de LTA 
através da PCR com primers para fragmentos do minicírculo do kDNA comparando 
com métodos utilizados habitualmente no diagnóstico de Leishmaniose Cutânea. Os 
métodos convencionais apresentaram sensibilidade variável, 4,5% no esfregaço, 
22,7% na cultura de biópsia, 18,2%na cultura do aspirado e 45,5% no PCR. O 
estudo conclui que a PCR nos casos crônicos de LTA foi mais sensível que os 
métodos convencionais e deve ser considerada e incorporada nas estratégias 
diagnósticas de Leishmaniose Cutânea Crônica. 
 No estudo de Weigle os resultados demonstraram baixos índices de detecção 
da parasita da LTA nos exames convencionais e também na PCR, não sendo feito 
referência neste trabalho se os casos foram realizados em ambulatório geral de 
úlcera, o que traduziria estes resultados baixos dos exames realizados. No presente 
estudo os pacientes apresentaram história epidemiológica, achados clínicos e 
histopatológicos altamente sugestivos de leishmaniose cutânea, sendo 
provavelmente o motivo do alto número de pacientes que apresentaram PCR 
positivo. 
 A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para a 
preservação arquitetural do tecido, sendo assim um método largamente utilizado na 
anatomia patológica. Porém, esse tipo de fixação resulta no enovelamento de 
proteínas nucleares na forma de ligações entre proteínas e o DNA e vários estudos 
se propuseram a avaliar a realização de PCR em biópsias fixadas em formol e 
emblocadas em parafina. 
 
34
 
 Isola et al 1993 fez um estudo avaliando a extração de DNA de amostras 
emblocadas em parafina, concluindo que o tempo de amplificação das amostras é 
proporcional ao tempo de fixação do tecido em formol, um tempo de fixação igual ou 
inferior às 4h, teria uma amplificação semelhante aos tecidos a fresco e um tempo 
de fixação superior às 72h amplificariam apenas 25% do DNA de amostras a fresco. 
 Cao et al em 2003 fizeram um estudo em Los Angeles, Estados Unidos, com 
3 métodos de extração de DNA em biópsias de pulmão e bexiga fixadas em 
parafina, comparando com extração de DNA de células bucais e amplificou através 
da PCR com primers de globina. A amplificação ocorreu no tecido fixado em 
parafina em 30/34 casos (88,2%) com extração pelo método boiling , em 29/34 
(85,3%) com extração utilizando fenol-clorofórmio e em 18/34 (52,9%) usando um kit 
de extração. Na amplificação de amostras de esfregaços de células bucais pelo 
método boiling em 2/16 casos (12%), com fenol clorofórmio em 16/17 casos (94,1%) 
e com o Kit em 12/16 (75%). A sensibilidade foi alta tanto nas amostras a fresco de 
esfregaços bucais quanto nas amostras fixadas em formol. 
Libório et al em 2005 no estado de São Paulo, Brasil, verificando eficácia da 
PCR com amostras de biópsias fixadas em formol e emblocadas em parafina, fez um 
estudo em 30 biópsias de hiperplasia fibrosa inflamatória, usando primers da 
globina, verificando a utilização de tecido humano parafinizado e arquivado. O 
estudo mostrou amplificação de DNA genômico extraído de tecido parafinizado, 
mesmo nas amostras arquivadas por um longo período.. Pirmez et al em 1999 fez um estudo no Rio de Janeiro, Brasi, avaliando a PCR 
como ferramenta de rotina para o diagnóstico de leishmaniose. Foram estudados 
230 pacientes, sendo 216 com características clínicas sugestivas de Leishmaniose 
Cutânea e 14 com outras lesões cutâneas não leishmanióticas. Cada espécime foi 
processado para exame histopatológico, cultura, exame direto e identificação de 
DNA (com primers de uma região conservada do minicírculo do kDNA). O uso 
combinado das técnicas convencionais demonstrou ser positivo para leishmania em 
62% dos casos enquanto a PCR foi positiva em 94% dos pacientes. Na 
Leishmaniose de mucosa a sensibilidade foi ainda maior com os testes 
 
35
 
convencionais, demonstrando leishmania em apenas 17% dos casos e a PCR em 
71%. 
Safei et al, em 2002 no Iran realizaram estudo comparativo através da PCR 
em biópsias de pele fixadas em formol e emblocadas em parafina, usando primers 
para Leishmania sp com fragmentos de DNA do minicírculo do cinetoplasto com 120 
pares de base divididas em dois grupos: o grupo 1, constituído por 33 biópsias de 
pele com diagnóstico de LTA com parasitos a histopatologia e o grupo 2, com 29 
biópsias de pacientes com suspeita clínica de LTA, sem evidências do parasito à 
microscopia óptica. O resultado da PCR foi positivo nos 33 casos do grupo 1, e em 
24 dos 29 pacientes do grupo 2 (92% dos casos). O resultado da PCR foi negativo 
nos controles constituídos de 20 biópsias de pacientes com outras patologias 
diferentes de leishmaniose, demonstrando assim alta sensibilidade nas amostras 
fixadas em formol e emblocadas em parafina. 
De forma similar ao presente estudo, Medeiros et al em 2005 no estado 
de São Paulo, Brasil, realizaram estudo através da PCR em 54 biópsias de pele e 
mucosa usando Primers 13A e 13B da região conservada do kDNA do minicírculo . 
A PCR foi positiva em 44 de 54 amostras (81,5%). 
No presente estudo dos pacientes compatíveis com LTA a histopatologia, 
a amplificação de DNA para gênero Leishmania foi realizada com primers obtidos a 
partir de fragmentos de área conservada do minicírculo do kDNA, técnica 
amplamente referida na literatura. Os trabalhos demonstram sua alta sensibilidade 
em estudos comparativos com métodos convencionais de diagnóstico da LTA, (Safei 
et al 2002), (Medeiros et al 2005). 
A utilização do kDNA tem como vantagens o número grande de cópias do 
kDNA , 10.000 cópias, (Rodgers 1990) o tamanho pequeno do fragmento utilizado, 
120 pb - alguns autores como Libório et al 2005 referem que o tamanho do 
fragmento mostra-se inversamente proporcional à capacidade de amplificação -, e 
outra vantagem indicada seria a capacidade de detectar quantidade diminuta de 
DNA 1/10 organismos de Leishmania. (Rodgers et al 1990). 
 
 
36
 
Chargui et al em 2005 também demonstrando a sensibilidade da PCR para 
Leishmaniose Cutânea realizaram um estudo em 430 pacientes da Tunísia 
comparando métodos convencionais de diagnóstico para Leishmaniose Cutânea 
com a PCR. Nos resultados, a microscopia óptica revelou amastigotas em 245 
amostras (57%), na cultura in vitro 88 casos (20,5%) foram positivos, enquanto a 
PCR para gênero detectou Leishmania em 301 amostras (70 %). Este trabalho dá 
ênfase à incorporação do PCR na estratégia diagnóstica para Leishmaniose 
Cutânea. 
Faber et al em 2003 na Holanda fizeram um estudo da sensibilidade da PCR 
para o diagnóstico de Leishmaniose Cutânea comparando-a com testes diagnósticos 
convencionais, apresentando sensibilidade de 100%, enquanto que o esfregaço 
demonstrou sensibilidade de 65%, a cultura 84%, a histopatologia 82% e reação de 
Montenegro 87%. Indicando que a PCR parece ser o melhor teste diagnóstico para 
Leishmaniose Cutânea. 
 
37
 
6. CONCLUSÃO 
1) Os resultados obtidos com a PCR para gênero Leishmania, no presente estudo, 
demonstraram a presença do DNA de leishmania em 87 (96,66%) dos casos. 
2) A PCR pode ser de especial importância para o diagnóstico de Leishmaniose 
Cutânea nas fases crônicas da doença quando outros métodos falham em 
demonstrar o parasito nas lesões granulomatosas, sendo alta a sua sensibilidade. 
3) O PCR tem um valor significativo no diagnóstico diferencial de lesões 
granulomatosas de pele, em material de biópsias emblocadas em parafina nos casos 
de leishmaniose cutânea. 
4) O padrão histopatológico mais comumente encontrado nas biópsias compatíveis 
com LTA e PCR positiva foi caracterizado pela presença de hiperplasia 
pseudoepiteliomatosa, reação exsudativa e granulomatosa desorganizada no seio 
do infiltrado inflamatório de plasmócitos e linfócitos. 
5) Nas biópsias c/c LTA e PCR positiva o granuloma foi encontrado em 90,69% dos 
casos e a hiperplasia pseudoepiteliomatosa em 90% dos pacientes. 
6) O grupo histopatológico de acordo com a classificação proposta por Magalhães et 
al que predominou neste estudo foi o grupo IV. 
 
 
 
38
 
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