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Seminario imunogia

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Imunologia
Faculdade Anísio Teixeira – Med. Veterinária
Docente: Tatiane
Discente: Jociclei, Klyvia, Leylisangela, Kleyton.
1
Elisa
2
Introdução
Definição
O teste
Interpretação
Equipamentos
Tipos de Eliza	
Causas
Definição
Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA, do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima).
O Elisa se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno (microrganismo que produz coloração no meio onde se encontra) mude de cor. O produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir do local da formação. Foi inicialmente desenvolvido por Engvall & Perlman e por van Weeman & Schuurse, posteriormente, muito utilizado como teste diagnóstico em varias doenças.
O Teste
Quando o sistema imunológico do corpo encontra um antígeno específico (por exemplo, uma proteína característica na superfície de um vírus ou bactéria), os anticorpos que são específicos para o antígeno interceptam-no com uma ligação física a ele em uma "chave e fechadura", neutralizando assim o antígeno. O ELISA é uma técnica fundamental para avaliações imunológicas e bioquímicas, utilizada para detectar o antígeno ou anticorpo em uma amostra, com base em interações anticorpo-antígeno. Se um antígeno (ou da mesma forma, um anticorpo) é detectada, um sinal é produzido na forma de uma mudança mensurável.
Para avaliar a presença de um antígeno específico, em uma amostra, um "teste de ELISA" pode ser realizado da seguinte maneira: Uma solução de anticorpo, que é específico (isto é, tem reconhecimento exclusivo) ao antígeno putativo, é imobilizado em uma superfície sólida em um poço de uma placa de microtitulação. É aplicado em seguida à amostra a ser analisada condições que permitam o antígeno ligar-se aos anticorpos imobilizados específicos. O material não ligado é lavado, e o antígeno ligado é reconhecida mais uma vez em condições de ligação com a adição de uma solução de um segundo anticorpo específico para o mesmo antígeno, que desta vez é acoplado ou ligados a uma enzima que catalisa a conversão de seu substrato a uma forma detectáveis e possivelmente quantificável.
Esses anticorpos ligados a uma enzima que estão vinculados ao complexo antígeno-anticorpo imobilizado são resistentes a ciclos de lavagem e, finalmente, o substrato é adicionado e incubado de modo que a enzima pode catalisar a conversão do substrato para o sinal de detecção do antígeno específico . ELISAs costumam empregar qualquer um substrato cromogênico ou um fluorogênico, que produz uma cor ou fluorescência, respectivamente, após a conversão pela enzima ligada ao segundo anticorpo.
Conversão do substrato é convenientemente observada ou quantificada em um leitor de placas, por medidas de densidade óptica ou intensidade de fluorescência.
Em resumo, mudar a cor ou a fluorescência sinaliza a atividade da enzima, que sinaliza a presença do segundo anticorpo, que sinaliza a presença do antígeno procurado.
Interpretação 
A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presente no soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro (Leitores de Elisa), permitindo uma análise quantitativa.
Equipamentos
 
Placa de Elisa
Onde a reação é desenvolvida. São microplacas contendo vários poços (wells) onde são depositados os reagentes.
Pipetas Automáticas
Depositar os reagentes
Leitor de Elisa
Permite uma análise quantitativa precisa dos resultados (espectrofotômetro) 
Lavador Automático de Placas
Enzimas
São elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor. A enzima mais comumente utilizada neste teste é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2.
Tipos de Elisa
 
Indireto
O método indireto é utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão.
Existem vários modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples,chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do substrato).
Direto ou sanduíche
O método de sanduíche, ou captura, é indicado para identificação de antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca. Em seguida o antígeno na solução problema é adicionado. Depois o segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão.
Competitivo
O método competitivo é mais usado para identificação de antígenos, mas pode também ser empregado para a detecção de anticorpos. Neste método primeiro se adsorve o anticorpo no poço da micro placa. Após a adsorção do anticorpo, uma solução que possivelmente contém o antígeno é adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O próximo passo é adicionar o antígeno marcado com uma enzima. Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços que possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.
Curva Padrão
Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA.
Causas
 
Dermatoses bolhosas autoimunes são doenças cuja manifestação cutânea primária e fundamental consiste em vesículas e bolhas. Classificam-se conforme a localização da bolha, em intraepidérmica e subepidérmica. Os pacientes produzem autoanticorpos contra estruturas específicas da pele detectáveis por técnicas de imunofluorescência, immunobloting e Elisa. São doenças de baixa incidência, porém de elevada morbidade e por vezes letais. 
O objetivo deste trabalho é revisar e descrever os progressos nos conhecimentos de quatro doenças vésico-bolhosas autoimunes: pênfigo foliáceo endêmico (fogo selvagem), pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso e dermatite herpetiforme.
Fogo Selvagem
Doença autoimune de causa desconhecida, provocada por auto-anticorpos patogênicos antiepiteliais e responsáveis pelo fenômeno da acantólise. Os auto-anticorpos são do tipo imunoglobulina G (IgG), predominando o subtipo IgG4. Os auto-antígenos contra o qual os anticorpos antiepiteliais reagem e a desmogleina 1 (Dsg1), molécula, da família das caderinas, que compõe os desmossomos,