Aula 2 - TDR

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Profa. Claudia Dantas Comandolli Wyrepkowski 
ATTGCTAGTCATGACTAGCAAT 
TAACGATCAGTACTGATCGTTA 
 DNA isolado: viscoso em pH 
próximo a 7,0 e temperatura 
de 25 oC; 
 Em pH extremo ou 
temperatura acima de 80 oC 
decai a viscosidade; 
 Quebra das pontes de 
hidrogênio entre os pares de 
bases; 
 Cada DNA tem sua 
temperatura média de 
desnaturação 
 
 
ATTGCTAGTCATGA 
TAACGATCAGTACT 
Exercício – Calcular a Tm da sequencia: 
Temperatura de Desnaturação média (15 a 35 nucleotídeos) 
Tm (oC) = 2 (A + T) + 4 (G + C) 
Temperatura de Desnaturação média (15 a 50 nucleotídeos) 
Tm (oC) = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41 (%G+C) – 600/N 
 
Onde 
 
[Na+] = concentração molar de NaCl 
N = número de nucleotídeos em uma fita 
ATTGCTAGTCATGA 
TAACGATCAGTACT 
Exercício 
 
Calcular a Tm da sequencia em 0,1 mol de NaCl: 
Síntese de ácidos nucleicos 
Síntese de ácidos nucleicos 
O mecanismo catalítico depende de 2 
íons de Mg2+ 
Resíduos de Asp são altamente 
conservados em DNA polimerases 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
 
 Início em 1972 - corte in vitro de DNA e ligação de moléculas de 
diferentes origens. 
 30 anos antes - restrição à infecção de E. coli por fagos. 
 Definição em TDR - enzimas capazes de cortar a dupla fita de DNA em 
regiões específicas 
 Restrição - sítio-específica, número de bases e frequência de corte. 
 Seqüência palindrômica - leitura nos dois sentidos. 
 Isoesquizômeros - diferentes enzimas que reconhecem a mesma 
seqüência. 
 Tipos de extremidades geradas - abruptas e coesivas 
 Produto da digestão - grupo P (5´) e OH (3´) 
 São bloqueadas por meilação 
Complexo Enzima de Restrição - DNA 
Ligação de fragmentos de DNA 
 
 Ligases - T4 DNA ligase + ATP, catalisa a formação 
da ligação. 
 
 Fosfodiéster, diferença entre abrupto e coesivo. 
 
 Re-anelamento e formação de concatâmeros - 
moléculas compatíveis. 
 
 Se ligam na presença de ligase. 
 
 Fosfatase alcalina - retira o P (5´) impossibilita a 
ligação.