Relatório de Microbiologia Testes Bioquímicos...

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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro Campus Maracanã
Microbiologia – Professora: 
 
 
 
 
 
 
 Quantificação Microbiana e Testes Bioquímicos 
Rio de Janeiro, 28 de Novembro de 2018
Introdução
A quantificação do número de microrganismos constitui uma das análises microbiológicas necessárias na microbiologia alimentar e microbiologia da água. Nas análises de água, quer seja água para consumo ou água para banho, doce ou salgada, para além da análise com meios seletivos para detecção e estimativa dos microrganismos, e faz-se necessário também rotineiramente, a contagem do número de microrganismos presentes em uma dada amostra, como por exemplo, a água. 
 Existem várias condições em que é conveniente quantificar a população microbiana de uma determinada amostra. Na análise da eficiência de agentes antimicrobianos ou a eficácia de práticas higiênico-sanitárias é comum determinar a população sobrevivente ao tratamento e também, em determinadas condições clínicas, como em infecções do trato urinário, quando o número de um determinado organismo é superior a 100 mil/ml considera-se que esse organismo é o agente da infecção. Também é comum empregar técnicas para quantificar a população de microrganismos da água e alimentos para avaliar a qualidade microbiológica dos mesmos.
Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o número de células presentes num determinado material ou superfície, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez, determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA) ou através da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na água, em alimentos como leite, carnes, vegetais, superfícies, ar ou até mesmo em culturas puras.
Os testes bioquímicos servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo.
O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação.
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento, utilizando organismos como controles positivos e negativos para a execução de cada teste.
As características culturais podem ser observadas em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos).
As principais características observadas em meio líquido são:
1.      Tipo de crescimento na superfície - sem crescimento, película, grumosa, membranosa, anel (circular);
2.      Opacidade ou turvação - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitória, persistente;
As principais características observadas em meio sólido inclinado são:
1.      Crescimento - nulo, escasso, abundante;
2.      Pigmentação - cor;
3.      Lustro ou brilho - fosco, luzidio;
4.      Caracteres ópticos - transparência, translúcido ou opaco;
6.      Consistência - butirosa, viscosa, membranácea, quebradiça;
7.      Emulsionabilidade - nula, fácil, difícil;
Objetivos
Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação de espécies microbianas, a fim de executar, interpretar os resultados e as transformações metabólicas ocorridas em algumas provas bioquímicas empregadas para identificação de bactérias. 
Realizar a quantificação microbiana por dois métodos diferentes: o pour plate e o de espalhamento (spread plate), verificando a validade dos métodos Spread-Plate e Pour-Plate para a quantificação células viáveis de microrganismos.
Materiais
1 agulha bacteriológica;
Alça de Platina;
Bico de Bunsen;
Fósforo;
Amostra da bactéria(E.Coli);
1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar citrato de simmons;
1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Ágar TSI – triplo açúcar ferro;
1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Methyl Red (MR);
1 tubo de ensaio contendo meio de cultura Vogel Proskauer (VP);
2 tubos de ensaio contendo OF Sorbitol (SB);
1 tubo de ensaio contendo meio de cultura SIM;
1 tubo de ensaio contendo meio base para aminoácidos com lisina (LIS)
2 tubos de ensaio contendo OF Sacarose;(SAC)
2 tubos de ensaio contendo OF Glicose (GLI)
Indicador de pH vermelho de metila;
Reagente Voges-Proskauer (KOH 40%);
Reagente AlfaNaftol;
Reagente de Kovac;
Placas de Petri;
Pipetas;
Meio com Ágar nutriente;
Pró-pipete;
Béquer com álcool;
Alça de Drigalski.
Procedimentos
Ao iniciar os procedimentos da prática, flambou-se a agulha bacteriológica em um ângulo de 90° com o auxílio do bico de Bunsen. Em seguida, flambou-se três vezes a amostra que continha a bactéria desconhecida e inseriu-se a agulha bacteriológica na amostra, ao inocular a bactéria aos tubos de ensaio que continham os meios de cultura, foi preciso flambar as extremidades de cada tubo três vezes, com a finalidade de não ter contaminação e obter a esterilização do material. Todo o procedimento foi feito próximo e atrás das chamas.
Através das técnicas assépticas descritas, inoculou-se a bactéria com o auxílio da agulha bacteriológica até metade dos tubos de ensaio que continham os meios de cultura Ágar Lisina Ferro e Ágar citrato de simmons, fazendo, em seguida, uma estria nas superfícies das rampas dos respectivos meios. Após isso, os tubos foram devidamente colocados na estante de tubos de ensaio.
Nos métodos de quantificação microbiana, foram utilizados dois métodos de contagem do crescimento microbiano, primeiramente o “Pour Plate” e após isso, o “Spread Plate”. No método “Pour Plate”, foram feitas quatro diluições sucessivas com a solução concentrada de cultura bacteriana (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4), ao qual essa cultura, onde estava presente a bactéria E.coli, foram diluídas em água peptonada.
Essas diluições foram feitas da seguinte forma: com o auxílio de uma pipeta graduada foi adicionado 1mL da solução concentrada de cultura bacteriana ao tubo de ensaio onde a diluição foi de 10-2, tendo-se, posteriormente, homogeneizado bem o tubo. Com outra pipeta graduada, foi adicionado 1mL da solução primeiramente diluída (de concentração 10-2) no tubo de diluição 10-3, posteriormente homogeneizado. Com outra pipeta, retirou-se 0,1mL da solução diluída de 10-3 e colocou-se em duas Placas de Petri anteriormente esterilizadas. E ainda se pegou uma Placa de Petri e colocou-se sobre ela 0,1 mL da diluição de 10-2.
Pegou-se uma outra pipeta graduada e retirou-se, também 0,1mL, da solução diluída de 10-4, e colocou-se em outras duas Placas de Petri, anteriormente esterilizadas. Após ter posto nas placas as culturas bacterianas diluídas, com o auxílio de uma Alça de Drigalsky, anteriormente flambada, espalhou-se a solução contendo a cultura microbiana homogeneamente sobre a superfície do ágar. Completou-se, assim, o método “Spread-Plate”.
No método “Pour-Plate”, utilizou-se as mesmas diluições, do método “Spread Plate”. Pegou-se uma pipeta graduada e retirou-se 0,1´mL de cada tubo (diluições de 10-2, 10-3 e 10-4) e colocou-se cada solução em uma Placa de Petri anteriormente esterilizada e contendo a solução de ágar nutriente. Após ter posto nas placas as culturas bacterianas diluídas, colocou-se sobre ele o ágar nutriente em seu estado líquido, mais ou menos a 50°C, o ágar deve estar em uma temperatura ideal para que não mate a cultura bacteriana. 
Nos testes bioquímicos, posteriormente, a bactéria foi inoculada até metade dos outros tubos de ensaio que continham: Ágar TSI, Methyl Red (MR), Vogel Proskauer (VP), SIM,Glicose (GLI), Sacarose (SAC), Lisina (LIS). Logo depois, os meios foram colados na estante de tubos e incubados a uma temperatura de 37°C. 
Ao realizar a pratica para a visualização dos resultados, foi necessário acrescentar 5 gotas de indicador vermelho de metila, de reagente Voges-Proskauer (KOH 40%) e de reativo kovacs, nos meios de cultura: Methyl Red (MR), Vogel Proskauer (VP) e no meio SIM respectivamente. 
 
Resultados e Discussões 1: Testes Bioquímicos
Os resultados apresentados para o MRVP (tubo da direita na figura 1) foram positivos, pois ele imediatamente após a adição do vermelho de metila ficou vermelho tijolo. O tubo de MRVP (o tubo da esquerda na figura 1) teve resultado negativo pois, depois de 15 minutos de observação, não ficou da cor vermelho tijolo.
 
O tubo SIM, apresentou resultado positivo, ficou com uma cor rosa na superfície.
 
O Citrato (tubo de coloração verde) mostrou resultados negativos pois ficou com sua coloração verde, não alterando sua cor para o azul. O TSI (tubo mais à esquerda de coloração marrom) não teve alteração de cor.
 
 
Os tubos O/F glicose e O/F Sacarose apresentaram resultados positivos para os testes, mudando as cores iniciais (verde) para a coloração amarela mostrada na figura.
 
O meio lisina apresentou resultados positivos mudando de cor de para roxeado
 
O meio de cultura sólido DNase deu um resultado inconclusivo e com contaminação na Placa.
 
O meio líquido de uréia deu resultado negativo não havendo mudança de cor de rosa claro para um rosa muito intenso.
 
Tabela dos resultados:
	Meios 
	O/F com óleo
(Líquido)
	O/F sem óleo (líquido)
	SIM
(Semi sólido)
	Lisina
	Citrato
	TSI
(Semi-sólido)
	MR
(Líquido)
	VP
(Líquido)
	Ureia
(Líquido)
	//
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Meios
	DNASE
(Sólido)
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Tabela 1 Tabela com os resultados obtidos na prática
 - Inconclusivo
 -  Positivo
  - Negativo
Discussão
Teste de Motilidade
A prova de motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova bioquímica e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta o meio semi-sólido SIM. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio.
Produção de Sulfeto (H2S)
Algumas bactérias são capazes de hidrolisar aminoácidos sulfurosos e produzir H2S. Esse produto pode ser evidenciado pela adição de compostos inorgânicos com ferro. A enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Na reação positiva O sulfeto de hidrogênio na presença de sais de ferro (presentes no meio SIM) forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel. Se houver ausência de precipitado negro no tubo o resultado é negativo. 
Fermentação Ácido Mista
Algumas vezes é necessário verificar se a bactéria produz vários ácidos (fermentação ácido mista), comum para E. coli, através do teste chamado de Vermelho de metila (VM) ou Metil Red (MR) que é a prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produção e estabilização de altas concentrações de produtos finais ácidos. Serve para diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. aerogenes. Todas as enterobactérias fermentam glicose. Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando a redução do pH abaixo de 4,4 (viragem do indicador). Porém, algumas durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado, pH 6. Sendo assim, pH abaixo de 4,4 é vermelho, acima de 6 é amarelo.
Fermentação Butileno-glicólica
Há bactérias que utilizam a fermentação butileno-glicólica revelada pela detecção de acetil-metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos, que são produzidos a partir da fermentação da glicose pelas bactérias. Este teste é feito através do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer. Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil, A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo, após 10 a 15 minutos.
Metabolismo Bacteriano
O meio de TSI fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo bacteriano. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio é semeado com agulha na base e estrias na superfície. Após o crescimento da bactéria pode-se observar os seguintes resultados:
1-  A bactéria não fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza os aminoácidos respirando-os com produção de aminas que alcalinizam o meio;
2-  Fermenta somente a glicose de tal sorte que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinação vermelha por utilização dos aminoácidos (por respiração), alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a concentração de glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base ácida);
3-  Fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas, pois os álcalis produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela grande quantidade de ácidos produzidos
Teste da lisina descarboxilase
Consiste em determinar a habilidade enzimática de uma determinada bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina alcalina (cadaverina). O meio utilizado é o meio LIA ou Ágar Lisina Ferro que contém como indicador o Púrpura de bromocresol, podendo ter os seguintes resultados: Positivo, cor púrpura (alcalino), expressa que ocorreu a descarboxilação da lisina e consequente formação de aminas. Negativo, meio amarelo (ácido), não ocorreu a descarboxilação da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.
Meio OF
Permite verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. O que ajuda na diferenciação de bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos. Podendo obter os seguintes resultados:
DnaseTestAgar 
 O teste de DNase é usado para detectar a degradação do Ácido Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por bactérias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsável pela reação. A enzima quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotídeos. 
O teste é útil para diferenciar Serratia do gênero Enterobacter; Staphylococcus aureus de estafilococos coag - neg e Moraxella catarrhalis de espécies de Neisseria. Ao utilizarmos o meio de DNase Test Agar, devemos acrescentar uma quantidade de HCl a 1N para revelar a atividade enzimática. Uma zona clara em volta da colônia indica reação positiva. Caso não haja atividade dessa enzima o HCL reagirá com o ácido nucléico intacto, formando um precipitado. Isso implica na aquisição e/ou preparo da solução de HCl e da pipetagemda solução no meio. 
Limitações:
1N HCL é bactericida. Portanto, se a HCL tiver sido aplicada, o teste deve ser lido dentro de 5 minutos.
O meioverde-metilo é melhor para bastonetes gram-negativos que crescem primeiro no meio e depois demonstram um teste positivo.
Algumas cepas de MRSA não dão resultado positivo e algumas cepas de Staphylococcus coagulase-negativos, como Staphylococcus capitis, apresentam reação positiva fraca.
Para os cocos Moraxella e Gram-positivos com teste TBO, um inóculo baixo pode resultar em um teste falso-negativo, uma vez que estes organismos podem não crescer bem no meio.
Depois de realizados os procedimentos para os testes bioquímicos, pode-se fazer uma análise dos resultados obtidos.
No Teste TSI, um meio sólido com coloração vermelha-cereja antes de ser inoculado. Depois de inoculado, não foi possível observar alteração de cor no tubo.
Se o teste desse positivo seria possível ver uma coloração amarela no tubo, Com isso é possível de dizer que houve fermentação da glicose e da lactose e/ou sacarose (3 açúcares). Também seria possível ver a presença de gás, pelo espaço que se encontra no final do tubo que levantou todo o meio. 
Entende-se que não houve presença do H2S, por não ter tido presença de um precipitado negro, já que o ferro não reagiu com sulfeto. Com base nesses resultados, a interpretação mais provável, se o experimento desse certo, é de ser uma enterobactéria, que se caracterizam por serem fermentadores da glicose, com ou sem produção de gás, oxidase negativas e reduzem nitrato a nitrito. O levantamento do meio pelo gás é uma característica da E. Coli.
 
Ágar Ureia
O ágar ureia serve para detectar a produção da enzima urease por bactérias e fungos.
A ureia presente no meio é degrada pela enzima urease em duas moléculas de amônia. A amônia formada alcaliniza o pH e esta é indicada pelo vermelho de fenol, fazendo com que o meio antes palha torne-se rosa
No teste do Citrato, que foi usado o meio Ágar Citrato de Simmons, um meio sólido com a coloração verde antes de inocular com a bactéria, é usado para observar se a bactéria usa o citrato como única fonte de carbono, o consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Seu resultado foi negativo, pois o meio continuou com a coloração verde, indicando que não houve crescimento microbiano no meio citrato. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo, portanto, crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato.
No teste do Indol, usa-se o meio SIM e o reativo de Kovacs. O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. O resultado desse teste foi positivo após a adição de 5 gotas do reagente de Kovac, por ter formado na porção superior do tubo um anel de cor rósea dentro de 10 segundos após a adição do reativo. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. A reação que ocorreu foi:
triptofanase
Triptofano               →→→        Indol + piruvato e amônia
No teste de MR-VP, (Methyl Red, Voges-Proskauer), meio líquido de cor amarronzada antes de inocular, ele determina a capacidade dos microrganismos de oxidarem a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. No teste MP teve o resultado positivo após a adição de 5 gotas, pois a pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, comprovando a ocorrência de fermentação de glicose. O teste VP deu negativo após a adição de 5 gotas, pois não se obteve uma cor vermelho-tijolo que é alcançada pela produção de acetsina que reage com alfa naftol. Esses resultados são característicos da Escherichia Coli.
O Teste do Meio O/F, teste de oxidação e fermentação de glicose serve, principalmente, para separar os gram-negativos fermentadores de glicose dos gram-positivos que não fermentam a glicose. De maneira geral, esse teste serve para analisar microrganismos quanto a maneira em que eles metabolizam a glicose. São dois tubos com um meio líquido verde que contém glicose e um indicador de pH, um deles possui óleo mineral/vaselina líquida acima do meio líquido para impedir a utilização de oxigênio pela bactéria crescendo em meio líquido. O resultado desse tubo foi positivo, pois os dois tubos ficaram amarelos, indicando que ela é capaz de fermentar e oxidar glicose, característica da E. Coli também.
Para o teste de Motilidade, usou-se o meio SIM.O teste obteve resultado positivo, pois houve formação de turbidez no tubo que parte da linha de inoculação feita com a agulha bacteriológica.
Para o teste de DNase, não pode-se ler na prática os resultados, mas os resultados do teste de DNASE para E. coli após a adição de ácido(HCl) seria esse:
Positivo: Desenvolvimento de halo claro ao redor da colônia.
Negativo: Nenhuma zona clara no meio. Agar permanece verde devido a nenhuma degradação do DNA
A E. coli apresenta um resultado negativo para a produção de DNase.
O teste realizado com a Lisina deu positivo, cor púrpura (alcalino), expressa que ocorreu a descarboxilação da lisina e consequente formação de aminas.
O teste realizado com o Ureia deu negativo, pois não houve mudança de cor de rosa claro para um rosa bem intenso. Isso indica que a bactéria E. Coli não tem a enzima urease que tem como objetivo degradar a ureia mudando a cor para um rosa mais intenso.
Resultados e Discussões 2: Quantificação microbiana
 Uma semana depois foi possível observar os seguintes resultados abaixo
 
 
Discussões:
Método Pour Plate: No método pour plate o inoculo pode ser realizado com um volume de 1 ml ou 0,1 mL da diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em banho-maria a 50 ºC para impedir a solidificação do ágar, é vertido sobre a amostra, que será misturada por agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é incubada na temperatura de crescimento da bactéria. Nesse método o crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do meio de cultivo e na superfície do meio de cultivo.
Método Spread Plate: É o método mais usado. O inóculo de 0,1 mL é adicionado a superfície do meio contendo ágar já solidificado. O inoculo é, então, espalhado uniformemente na superfície com a alça de Drigalski. Esse método não tem as desvantagens do método pour plate porque as colônias crescem somente na superfície do meio e não entram em contato com o ágar a 50°C.
Na placa de 10-2, não foi possível contar o número de colônias, pois estavam acima do limite (entre 30 e 300 colônias). Pode-se perceber que para uma contagem efetiva seria necessário, no mínimo, mais uma diluição.
Na placa 10-3 foi observado um número grande de colônias o que dificulta a sua contagem. Também teve contaminação na placa.
As colônias amarelas, ou seja, placas com diluição de 10-4 foram escolhidas para contagem. Porém, observou-se que o valor ultrapassa aria 300 UFC durante a contagem. Portanto, a contagem não foi finalizada. Caso tivesse sido, a conta a ser realizada seria:
Conclusões
A prática propiciou conhecimentos acerca dos diferentes métodos de contagem e de sua importância. Além disso, mostrou como realizar as técnicas de contagem por plaqueamento. 
Em relação aos testes bioquímicos é muito importante correlacionar os dados experimentais com os dados catalogados para identificar se o microrganismo em questão realiza o teste. Todavia, alguns erros podem ocorrer uma vez que nem sempre os dados teóricos e experimentais vão coincidir. Caso isso ocorra,deve-se averiguar a procedência dos reagentes e dos demais materiais e refazendo o teste para obter alguma conclusão.
Bibliografias:
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia 10. Edição Porto Alegre: ARTMED, 2012. 894p.
 MANDIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; DUNLAP, P.V. Microbiologia de Brock 12 edição. Porto Alegre: ARTMED, 2010. 1160p.
FRANCO, ROBSON MAIA. Atlas de Microbiologia de Alimentos. Rio de Janeiro: Stamppa, 2012. 228p.