sequenciamento.alta.performance

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11-May-14 
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Alta Performance 
Sequenciamento de DNA e 
aplicações na pesquisa e 
diagnóstico 
Clayton Luiz Borges 
clbluiz2@gmail.com 
Sequenciamento de DNA 
É a identificação de pares de bases (A, T, C e G) na ordem exata 
de um segmento de DNA. 
O conhecimento da sequência de bases de um gene fornece 
importantes informações sobre sua estrutura, função e relação 
evolutiva com outros genes. 
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Sequenciamento de DNA – Alta performance 
SANGER 
 
» Depende de amplificação 
 
» Reads de ~700 pb 
 
» Clones de fita dupla 
 
» 1 milhão de pb em 24 horas permitem 
sequenciamento em ambas direções 
(facilita orientação e montagem) 
 
 
 
Novas tecnologias 
 
» Não há clonagem 
 
» Reads de 25 a 200 pb 
 
» Milhões de pb em menos de 4 horas 
 
» Fragmentos fita simples não permitem 
sequenciamento em ambas direções. 
Aplicação da técnica de paired-end 
Sequenciamento de DNA – Alta performance 
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Sequenciamento de DNA de alta performance 
Potencialidades 
• Possibilita visualizar todo o transcritoma 
• Avalia de modo global as interações entre DNA-proteínas  várias amostras em uma 
única corrida. 
• Apresenta uma baixa razão de falsos-positivos  elevada acurácia 
• Sensível para descobrir novos transcritos e variedades de splicing 
• Resolução para caracterizar rearranjos estruturais  translocações 
• Habilidade para distinguir expressão de linhagens específicas 
• Dispensa clonagens e seleção de clones 
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http://www3.appliedbiosystems.com 
http://www.454.com 
http://www.illumina.com 
Amostras: 
DNA genômico , produtos de PCR , BACs e cDNA 
 
Para pequenas amostras a fragmentação não é 
requerida (ex.: pequenas regiões não-
codificantes de RNA) 
Mecanismos de funcionamento 
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454 
Preparo da biblioteca: 
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Preparo da biblioteca: 
 
Fosforilação 
Preparo de bibliotecas - Adição de adaptadores: 
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O adaptador permite que o DNA se ligue em nanoesferas (diâmetro de 28 nm). 
Preparo de bibliotecas - Adição de adaptadores: 
Isolamento de fragmentos com adaptadores diferentes 
Magnética 
Preparo de bibliotecas - Adição de adaptadores: 
Isolamento de fragmentos com adaptadores diferentes 
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Preparo de bibliotecas - Adição de adaptadores: 
Isolamento de fragmentos com adaptadores diferentes 
Preparo de bibliotecas - Adição de adaptadores: 
Isolamento de fragmentos com adaptadores diferentes 
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Preparo de amostras para PCR em emulsão 
PCR em emulsão (emPCR): 
Apenas um DNA é ligado em cada grânulo 
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Nanoesferas são capturas por gotículas de uma 
emulsão água-óleo contendo os reagentes para 
a reação de PCR (emPCR). 
emPCR 
10 milhões de cópias numa reação 
emPCR 
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Ruptura das gotículas 
emPCR 
Suporte magnético sólido 
As fitas de DNA são desnaturadas, e as esferas 
contendo clones de DNA fita simples serão 
depositados em poços de um lâmina de fibra ótica 
emPCR 
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Sequenciamento no momento da síntese 
As enzimas necessárias para a reação de 
sequenciamento são adicionadas às nanoesferas 
Nanoesferas são imobilizadas 
e depositadas em cada poço 
Pirosequenciamento 
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A reação de sequenciamento é realizada através da passagem de uma solução 
contendo o tampão de reação e os nucleotídeos independentemente, com uma 
lavagem do sistema após a passagem de cada base. 
Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
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Câmara fotográfica 
O PPi é convertido a ATP através da ATP sulfurilase, o qual fornece energia para 
a luciferase oxidar luciferina e gerar luz. 
Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
Câmara fotográfica 
A luz gerada é capturada e utilizada para geração do pirograma 
Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
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Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
Adição de nucleotídeo único: pirosequenciamento 
Análise de dados - bioinformática 
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http://www.roche-applied-
science.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_multimedia/wbt.htm 
Roche/454 FLX 
Sequenciamento por ligação 
Support Oligonucleotide Ligation Detection 
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- Reação de sequenciamento direcionada pela DNA ligase 
- O adaptador ligado ao DNA e a grânulos magnéticos. Ocorre PCR em 
emulsão e as fitas de DNA são depositadas numa placa. 
 
-Ligação de primer universal n ao adaptador e de oligos degenerados (7 
bases) marcados contendo duas primeiras bases fixas. 
 
-Ocorre detecção do sinal, clivagem das duas últimas bases e adição de 
novos oligos 
 
- Ao fim de n rounds, a fita resultante é liberada e há a ligação de um novo 
primer universal, (agora n-1). Ciclo se repete mais três vezes (até n-4). 
Sequenciamento por ligação 
É realizada uma em PCR e em seguida as esferas são adicionadas a lâminas 
de vidro através de ligação covalente. 
Sequenciamento por ligação 
60-90 bp 
1-10 kp 
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Vantagem de depositar as esferas em lâminas de vidro: 
Maior densidade de esferas por lâmina 
Maior a performance no sequenciamento 
Sequenciamento por ligação 
Sequenciamento por ligação 
Análise em larga escala 
16 bibliotecas por corrida 
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1. Anelamento do primer ao adaptador 
2. Ligação dos oligonucleotídeos (2 nucleotídeos específicos + 5 nucleotídeos degenerados) 
3. Clivagem das extremidades e remoção do fluoróforo  captura a fluorescência 
4. Repetição dos passos 2 e 3 até o final da sequência 
5. Desnaturação do primer (n) 
4. Emprego de um novo primer (n-1) repetindo-se a ciclagem até o primer (n-4) 
Sequenciamento por ligação 
Os dados são analisados pela cor produzida em cada espaço de modo rápido, 
distinguindo-se portanto os erros do sistema e os verdadeiros polimorfismos. 
Sequenciamento por ligação 
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O gráfico gerado apresenta duas possibilidades de nucleotídeos para se determinar 
a sequência. (duas ligações independentes por 2 primers diferentes) 
 
 EX.; base nº 5 na read position? 
primer nº 2 no ciclo de ligação 2 + primer nº 3 no ciclo de ligação 1. 
 
Esta dupla possibilidade é fundamental para que haja a elevada precisão do SOLiD 
System. 
Sequenciamento por ligação 
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http://www.illumina.com/media.ilmn?Title=Sequencing-Workflow-
Video&Cap=&Img=spacer.gif&PageName=illumina%20sequencing%20technology&
PageURL=203&Media=10 
Terminação reversível cíclica 
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Fragmentação do 
DNA e ligação dos 
adaptadores 
Ligação do DNA e 
dos adaptadores na 
placa 
Anelamento e PCR 
com nucleotídeos 
comuns 
Anelamento e PCR 
Desnaturação Repetição do 
anelamento (n) 
Após repetição do 
anelamento x n, 
formam-se os 
clusters idênticos 
Adição de 
nucleotídeos 
marcados emissão do 
laser 
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Emissão do laser nos 
nucleotideos 
marcados 
Faz-se uma foto a 
cada ciclo de 
sequenciamento 
A comparação das 
fotos nos dá a 
sequencia 
Aproximadamente 25-
35 bases 
Fragmentos de DNA + 
adaptadores 
Primers e adaptadores 
Placa com superfície de canais de fluxo 
PCR em ponte 
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Amplificação por proximidade das moléculas (tipo 
ponte). 
PCR em fase sólida 
PCR em ponte 
Terminadores cíclicos 
PCR em ponte 
11-May-1425 
Após a incorporação de 
um nucleotídeo, o 
fluoróforo é detectado e 
depois clivado. 
Adição de: polimerase, primers e nucleotídeos marcados com fluoróforos. 
Sequenciamento por terminadores cíclicos 
Sequenciamento por terminadores cíclicos 
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Sequenciamento por terminadores cíclicos 
Sequenciamento de alta performance 
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Sequenciamento em tempo real