Relatório Bioquímica 1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC 
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS 
BACHARELADO EM QUÍMICA 
 
 
RELATÓRIO BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
PRÁTICAS 1, 2 e 3: 
 
Crescimento, lise e quantificação das 
proteínas celulares da levedura 
Saccharomyces Cerevisiae 
 
Componentes Do Grupo 2 RA: 
 
 
 
 
 
 
 
Santo André - Outubro/2018 
 
1. RESUMO 
 
Foram realizados três experimentos no decorrer de 3 semanas de maneira sequencial, 
todos referentes à manipulação bioquímica das proteínas celulares da levedura 
Saccharomyces Cerevisiae​, focando principalmente na enzima α-glicosidase, mas, por hora, 
apenas extraindo e avaliando proteínas totais. O objetivo das práticas é compreender e 
desenvolver processos laboratoriais bioquímicos simples e o uso de espectrofotometria. O 
processo foi iniciado com o preparo de um meio de cultura para o crescimento da levedura 
que foram desenvolvidas até a fase logarítmica tardia. Seguiu-se fazendo a lise celular com 
aproximadamente 2g de lisado, o método de rompimento celular empregado foi o mecânico 
de pérolas de vidro carregadas positivamente. Foi usado, também, métodos químicos e 
térmicos, a fim de: diminuir a atuação de proteases, a atividade catalítica e a velocidade de 
desnaturação proteica; e consequentemente obter uma maior quantidade de proteínas íntegras 
ao final do processo. Por fim, realizou-se a quantificação de proteínas na solução utilizando 
espectrofotometria. Leu-se a absorbância da a proteína albumina de concentração conhecida 
com o espectrofotômetro e construi-se uma curva analitica padrao da absorbância em função 
da concentração. As proteínas da levedura foram marcadas seguindo o método de bradford e 
diluídas o cerca de 200 vezes para adequar a leitura com os limites da curva analítica. Ao 
final, foi feito um comparativo entre os dados da curva e a absorbância da proteína desejada 
encontrada e foi determinado que a concentração é aproximadamente de 1,630 mg/mL, 
totalizando uma massa de 17,115 mg, tendo em vista que obtivemos 10,5 mL de lisado. 
 
 
 
 
 
2. INTRODUÇÃO 
As leveduras são fungos assim como os bolores e os cogumelos. Apresentam-se 
caracteristicamente sob a forma unicelular. São seres vivos invisíveis a olho nu, que somente 
podem ser vistos com o auxílio de microscópio, não fazem fotossíntese e, de modo geral, se 
reproduzem de modo assexuado. Esses microrganismos se multiplicam rapidamente e 
realizam respiração anaeróbica, ou fermentação, sendo conhecidas historicamente por sua 
capacidade fermentativa, utilizadas pelas indústrias de alimentos na produção de etanol e de 
dióxido de carbono, os quais são importantes para as indústrias de cerveja, vinho, álcool e 
fermentos. 
A levedura Saccharomyces cerevisiae ​é o foco do estudo em questão. O trabalho 
consiste na análise do crescimento, lise e quantificação de proteínas. ​As proteínas de interesse 
nesse estudo são as α-glicosidases, responsáveis pela clivagem hidrolítica de ligações α ou 
β-glicosídicas. Essas enzimas atuam durante a digestão, degradando alguns tipos de 
sacarídeos provenientes da alimentação e liberando unidades monossacarídicas, que são 
absorvidas pelo organismo como nutrientes participantes da metabolização de açúcares. As 
mesmas serão extraídas a partir de um meio contendo a levedura ​Saccharomyces cerevisiae ​, 
proveniente do gênero de leveduras ​Saccharomyces, que são amplamente utilizadas na 
indústria alimentícia. 
Para estabelecimento das culturas, foi necessário o preparo de um meio de cultura 
para ativação das leveduras. Neste experimento foi utilizado o meio YEP (2% extrato de 
levedura; 4% peptona e 4% glicose, pH = 5), que são insumos necessários para o crescimento 
da levedura (BORTOLI, et al., 2013). Para evitar contaminações químicas e biológicas, é 
importante preparar a mistura em uma cabine de fluxo laminar, pois mantém-se o ambiente 
estéril, a fim de evitar o crescimento de bactérias no meio de cultura. 
A temperatura ótima do crescimento da levedura de ​Saccharomyces cerevisiae está 
entre entre 20° e 30°C, com o pH entre 4,5 e 5,5 (RIGAMONTI, 2014). Sabe-se que fatores 
como temperatura e pH afetam diretamente na forma das proteínas. Logo, o tampão fosfato 
fora colocado a fim de manter o pH do meio neutro, o lisado mantido a baixas temperaturas 
com o intuito de diminuir a velocidade de desnaturação proteica e foi adicionado o inibidor 
enzimático PMSF, de modo a interferir na sua atividade catalítica; garantindo assim, uma 
maior eficiência e rendimento de proteínas íntegras ao final do processo. 
 
Quando as células de leveduras desenvolvem-se em um sistema fechado, pode-se 
confeccionar uma curva de crescimento celular em função do tempo, conforme a Figura 1. 
Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio. O primeiro 
período é chamado de Fase Lag, na qual período variável, ainda não há um aumento 
significativo da população e o número de organismos permanece praticamente inalterado 
podendo se estender por horas ou vários dias. Passado à fase lag, as células iniciam o 
processo de divisão celular, que é o crescimento exponencial do seu número, denominado 
Fase Log. Na fase estacionária os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão 
tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou 
seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem. 
Finalmente ocorre o declínio, onde a maioria das células está em processo de morte. 
 
Figura 1 ​- Curva de crescimento celular em sistema fechado 
Para este estudo as leveduras foram desenvolvidas até a fase logarítmica tardia, 
assegurando a integridade da célula e prosseguindo com o rompimento da parede celular da 
levedura que é composta basicamente de polissacarídeos. A lise celular constitui a primeira 
etapa na separação dos produtos intracelulares e é, portanto, crucial, pois qualquer dano 
causado ao produto, que ocorra nesta fase inicial, compromete e invalida todos os processos 
subseqüentes. Além disso, vale ressaltar que um rompimento de alto rendimento resulta em 
uma maior flexibilidade nos tratamentos subseqüentes dados ao produto (KESHAWARZ et 
al., 1984). 
O processo de rompimento das células de leveduras foi realizado o métodos 
mecânicos com pérolas de vidro que permite atingir aproximadamente 95% de rompimento 
(ASSIS, 1946). ​Essas pérolas foram carregadas positivamente por ácido sulfúrico, pois assim 
 
a atração das leveduras seria maior, aumentando a probabilidade de colisão entre as duas 
partes, resultando em uma maior eficiência do processo. ​O método consiste na agitação uma 
suspensão celular mantida em contato com pérolas de vidro em um vórtice (NEVES, L. C. M, 
2003). Após o rompimento, as pérolas são filtradas e lavadas, enquanto o homogenato foi 
centrifugado e posteriormenterecolhido o sobrenadante para quantificar a concentração de 
proteínas presente no lisado. 
A quantificação das proteínas é um processo de grande importância em análises 
bioquímicas, pois fornece maior precisão para futuros ensaios e facilita o tratamento de 
dados. O método de quantificação utilizado nesse experimento foi o de Bradford, corante que 
apresenta uma coloração azulada na presença de proteínas. O reagente Coomassie Brilliant 
Blue, presente no reagente de Bradford, obtém a coloração azulada ao se ligar à arginina e 
aminoácidos aromáticos das proteínas. ​A partir do complexo proteína-corante, elabora-se 
uma curva padrão com outra proteína de concentração conhecida. 
Neste experimento foi utilizada como padrão a soroalbumina bovina, BSA, ​a 
interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento 
do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm (ZAIA, 
1998), comprimento de onda utilizado no presente experimento. 
A intensidade de absorção nos diferentes comprimentos de onda na faixa do 
microonda e no infravermelho dá informações sobre a estrutura molecular do composto. O 
visível não é tão rico em informações estruturais, mas pode dar informações quantitativas 
sendo, desse modo, a intensidade de cor uma medida da concentração da solução (Apostila - 
CEFET Química-RJ)​. 
O espectrofotômetro foi o aparelho usado para medir concentração de proteínas 
através da absorbância, uma grandeza que relaciona as diferentes molaridades de uma mesma 
solução com os comprimentos de onda ( ​l ) da cor absorvida (NEVES, P. L, 1999). Uma reta 
será ajustada em relação aos dados obtidos e, a partir desta reta, será encontrada a 
concentração da proteína utilizada pelo grupo através da equação conhecida como ​Lei de 
Lambert-Beer ​(Eq. 1): 
 
 ε A = * c * l (Eq. 1) 
 
 
onde ​A​ é a absorbância, é absortividade molar (L cm​-1​.mol​-1​), ​c​ a concentração molar do composto (mol/L​ ​) ε 
e ​l,​ a distância percorrida pela radiação através da solução (cm). 
 
A equação de Lambert-Beer nos permite relacionar a quantidade de matéria presente 
na amostra através da medida de luz absorvida e transmitida pela amostra. (Apostila - CEFET 
Química-RJ). Assim para a obtenção da curva, leram-se as absorbâncias obtidas utilizando as 
várias massas de albumina e diferentes concentrações obtidas por diluição. Efetuou-se a 
leitura das absorbâncias em espectrofotômetro da ​Saccharomyces cerevisiae e assim 
determina-se a concentração de proteínas totais. 
 
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Inicialmente foi adicionado 2 g da levedura ​Saccharomyces Cerevisiae em pó no 
meio de cultura no interior de uma cabine de fluxo laminar para evitar a presença de 
bactérias. Todos os instrumentos utilizados foram esterilizados em autoclave e o meio foi 
preparado pelos técnicos do laboratório dois dias antes do experimento, contendo 10 g de 
extrato de levedura, 20 g de peptona e 20 g de glicose. Após isso, o meio com a levedura foi 
entregue aos técnicos que o mantiveram sob agitação a 30ºC por 24 horas e depois decantado 
por uma hora e armazenado em geladeira sem o sobrenadante. 
A preparação do tampão de lise de fosfato para a próxima etapa do experimento foi 
realizada pelos técnicos de laboratório e possuía pH 7,0, de acordo com as seguintes reações: 
 
1) H​3​PO​4(aq)​ + H​2​O​(aq)​ ​⇌ ​ H​3​O​+​(aq)​ + H ​2​PO ​4​-​(aq)​ com o pKa de 2,1 
2) H​2​PO​4​-​(aq)​ + H​2​O​(aq)​ ​⇌​ H​3​O​+​(aq)​ + HPO​4​2-​(aq)​ com o pKa de 7,2 
3) HPO​4​2-​(aq)​ + H​2​O​(aq)​ ​⇌​ H​3​O​+​(aq)​ + PO​4​3-​(aq)​ com o pKa de 12,6 
 
A preparação do tampão para o pH 7 descrito na apostila segue a segunda reação (2) 
de acordo com o seu pKa, pois este está mais próximo da faixa ideal de tamponamento, 
levando assim a utilização dos íons HPO ​4​2-​ e H ​2​PO ​4​-​ para preparação do tampão. 
Para determinar as concentração, é necessário usar a equação de 
Henderson-Hasselbach: 
H pKa log ( )p = + [base][ácido] (Eq. 2) 
 
, 7, log ( )7 0 = 2 + [base][ácido] (Eq. 3) 
.6309[base][ácido] = 0 (Eq. 4) 
 
Na preparação do tampão, cada 1 mol de HPO ​4​2- deve ser misturado com 0.6309 mol 
de H​2​PO​4​-​. 
Com essa relação é possível concluir que para a concentração de 100 mM em 1 litro 
seriam necessários 0,0613 mol de HPO​4​2- e 0,0387 mol de H​2​PO ​4​- em 1000 mL, que podem 
ser obtidos de 7,356 g de NaH​2​PO​4​ e 5,495 g de Na​2​HPO​4. 
Feito isso, foram adicionados aproximadamente 2 g dessas células de levedura 
crescidas em um tubo de centrífuga, junto com 4mL de solução tampão (previamente 
preparada como explicitado acima) e pérolas de vidro tratadas anteriormente com ácido 
sulfúrico para adquirirem carga elétricamente positiva. No vórtice, as células foram 
ressuspensas e adicionados 4 μL de fluoreto de α-fenilmetilsulfonila (PMSF) 0,1 M em etanol 
e 10 μL de cocktail inibidor de proteases e fosfatases para leveduras. Após isso, a mistura foi 
agitada por um minuto no vórtice e deixada no gelo por mais um minuto, sendo esse ciclo 
repetido quatro vezes. 
A mistura foi levada à centrífuga por dois minutos a 850g. Logo depois, o 
sobrenadante foi retirado e transferido a um tubo falcon e sempre mantido no gelo para inibir 
a ação de proteases, essa porção é chamada “lisado”. O precipitado restante foi ressuspendido 
com a adição de mais 4 mL de tampão. Foi adicionado novamente mais 4 μL de PMSF e 10 
μL de cocktail e todo o procedimento a partir disso foi repetido mais duas vezes. O grupo 
acidentalmente pulou a etapa de adição do tampão de lise durante a segunda extração e, por 
causa disso, só repetiu o procedimento mais uma vez. Por fim, foi medido o valor do volume 
de todas as porções de sobrenadante coletadas e separadas em três tubos falcon e 
armazenados no freezer a -20°C. 
Foi iniciado o processo de análise das proteínas presentes no lisado, e, para isso, foi 
primeiramente calculada a curva analítica de proteína e depois a determinação da 
concentração da proteína ​α-glicosidase nas amostras. 
Para a construção da curva analítica, foram realizados os seguintes procedimentos: 
Em um tubo, foi adicionado determinados volumes de Albumina Bovina 0,2g/L, 
água destilada e reagentes de BradFord (ácido fosfórico 85%, azul de Coomassie G e 
 
metanol), seguindo a Tabela 1. O tubo branco foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro 
que seria utilizado para as outras amostras. Cada tubo foi homogenizado utilizando o vórtice 
e as soluções apresentaram leve aspecto de degradê da cor azul. Cada amostra foi transferida 
para uma cubeta, lavada com água e etanol e seca antes de cada leitura, e levadas para o 
espectrofotômetro para determinação de suas respectivas absorbâncias em 595 nm. Através 
do volume de proteína, foi calculada sua massa e concentração em cada tubo. Com todos 
esses dados coletados, foiconstruído o gráfico de curva analítica de absorbância por 
concentração de proteína (albumina bovina). 
Dessa forma, foram preparadas soluções de lisado (sempre mantido em banho de 
gelo) diluídas 200 vezes e feito três vezes o mesmo procedimento de determinação da 
absorbância no espectrofotômetro. Dos três valores, foram obtidos as respectivas 
concentrações de proteína através da observação do gráfico e realizado o cálculo da média 
desses valores para obtenção da medida mais aproximada para o valor da concentração da 
proteína α-glicosidase nas amostras de lisado. 
 
Tabela 1 - valores inseridos nos tubos para determinação da absorbância e construção da curva analítica 
Tubo Albumina Bovina (​μL​) Água (​μL​) 
Reagentes de 
Bradford (mL) 
Branco 0 100 1 
1 10 90 1 
2 20 80 1 
3 40 60 1 
4 60 40 1 
5 80 20 1 
 
 
4. RESULTADOS 
● Resultados observados sobre o primeiro procedimento: preparação da cultura de 
leveduras 
 
Após uma semana da preparação da cultura, seguindo todos os métodos para se evitar 
contaminações, as leveduras que foram desenvolvidas até a fase logarítmica tardia em teoria, 
foi observada a formação de uma solução líquida de cor marrom com uma fase sólida 
granula. 
● Resultados observados no segundo procedimento: lise celular 
Na segunda etapa, os procedimentos foram realizados de acordo com o que foi 
descrito no procedimento. Ocorreu um pequeno deslize durante a segunda extração (descrito 
no tópico de procedimentos), criando a necessidade de reiniciá-la, como o tempo em que o 
lisado permanecia em 0°C precisava ser limitado o máximo possível em decorrência de 
degradação das proteínas pela atividade das proteases que cresce em temperaturas acima de 
-20 °C, a terceira extração foi cancelada. Foram obtidos aproximadamente 10 mL de lisado, 
que foram divididos em três partes de 3,5 mL. A Figura 2 mostra o lisado dividido em três 
tubos, uma solução de cor laranja levemente pastosa. 
 
Figura 2 - Lisado obtido na segunda semana 
Os três tubos foram levados a refrigeração adequada (-20 °C) para limitar a 
degradação das proteínas até o próximo experimento. 
 
● Resultados observados no terceiro procedimento: quantificação de proteínas 
totais 
 
A quantificação de proteínas totais no lisado foi realizado utilizando albumina como 
padrão de referência com uma curva analítica. 
A Tabela 2 demonstra os dados analíticos para a criação do Gráfico 1 e da função que 
correlaciona absorbância e concentração de albumina, que foi usada como referência para 
determinar concentração de proteínas no lisado. 
 
Tabela 2 - Dados coletados da análise espectrofotométrica com albumina 
A 
 (595 nm) 
Massa de proteína 
(mg) 
Concentração 
 de proteína (mg/mL) 
0,001 0 0 
0,025 0,002 0,0018 
0,039 0,004 0,0036 
0,156 0,008 0,0073 
0,240 0,012 0,0109 
0,272 0,016 0,0145 
 
O Gráfico 1 tem uma linha de tendência estabelecida de acordo com os dados obtidos 
experimentalmente. O ponto zero do branco foi descartado por ter concentração nula de 
albumina e o ponto final também por não apresentar mais a tendência linear. 
 
 
 
 
Gráfico 1 - Análise da proteína Albumina Bovina 
A função obtida foi de que a relação entre absorbância e concentração está definida 
pelo Gráfico 1 em: 
 24, 86C 0, 331A = 7 − 0 (Eq. 5) 
Onde “A” representa a absorbância e “C” a concentração de proteína. 
Partindo para os procedimentos com o lisado, primeiramente foi testado a melhor 
diluição para definir de acordo com a absorbância que melhor se encaixaria com a função de 
tendência. De preferência uma absorbância de um ponto próximo ao ponto médio da reta no 
gráfico. 
A Tabela 3 apresenta testes em diluições de 0, 100, 200 e 1000 vezes maior que a 
original do lisado. 
Tabela 3 - Diluições do lisado e respectivas absorbâncias 
100x dil. Lisado (μl) Água (μl) A (595nm) 
0 100 0,001 
100 0 0,264 
50 50 0,160 
10 90 0,026 
 
A diluição que apresentou o melhor resultado foi a de 200 vezes (0,160 de 
absorbância). Assim, foi realizada em triplicata, chegando a valores de 0,138; 0,160 e 0,210. 
 
Fazendo uma média desses valores: 
 , 693
(0,138+0,160+0,210) = 0 1 (Eq. 6) 
Substituindo o resultado na Eq. 5: 
, 69 24, 86 0, 3310 1 = 7 * C − 0 (Eq. 7) 
Resultando em C = 0,008 mg/mL em diluição, multiplicando pelo fator de diluição (200) 
tem-se: 
sem diluição, 08 00 1, 30 mg/mL0 0 * 2 = 6 (Eq. 8) 
Concluindo que a concentração de proteínas no lisado é de ​1,630 mg/mL e o total de 
proteínas presentes no lisado em massa é de ​17,115 mg ​. 
 
 
 
5. DISCUSSÃO 
 
Esse experimento é passível de erros tanto sistemáticos quanto aleatórios. Um fator a 
ser considerado é a importância do lisado ser mantido constantemente a baixas temperaturas, 
o que por sua vez, pode interferir diretamente na quantificação da proteína, já que as 
proteínas podem vir a se desnaturar. Durante o experimento as amostras ficaram sujeitas a 
grandes variações de temperatura, fato que compromete a quantificação precisa da 
concentração de proteínas. E ainda, deve-se considerar os erros, tanto sistemáticos como o 
dos equipamentos e o manuseio, como por exemplo, erro de pipetagem. 
Apesar de ter-se utilizado inibidores, o PMSF por exemplo, para as enzimas protease, 
os mesmos tinham sua faixa de melhor desempenho em um curto período de tempo. A 
demora entre os procedimentos pode ter acarretado em um desempenho vacilante, fazendo 
com que as enzimas protease realizassem seu mecanismo de ação, onde clivam as ligações 
peptídicas entre os aminoácidos das proteínas. Dessa forma, a proteína do estudo em questão 
seria modificada negativamente. 
O método de Bradford foi eficiente e rápido, mas infelizmente não se mostrou muito 
sensível. O grupo juntamente com a professora, viu necessidade de refazer 2 vezes a 
calibração com a albumina, pois não foi identificado variação gradual significativa de cor, as 
5 amostras aparentavam ter a mesma tonalidade. Outra desvantagem do método de Bradford 
foi na variação da absortividade específica para as mesmas concentrações de proteínas. Ao 
realizar as triplicatas foi notado uma expressiva variação na leitura da absorbância que não 
deveria ocorrer. Logo os resultados obtidos não eram reprodutíveis assertivamente, pois 
obteve-se um desvio padrão alto de 0,0369. Esse desvio pode ser consequência de diferenças 
na coleta de proteína ou também pela baixa solubilidade da amostra, sendo este último um 
agente limitante do método, uma vez que diferenças nas concentrações de albumina 
interferem diretamente na análise, levando a não linearidade do gráfico, bem como resultados 
diferentes de absortividade. 
Como esperado, pode-se ver que a concentração de proteínas é proporcional ao 
resultado de absorbância. Os resultados obtidos afirmam o que prevê a Lei de Lambert-Beer 
 
para o tipo de análise feita em laboratório, uma vez que foi empregado um indicador que 
permitiu a análiseespectrofotométrica. 
 
 
6. REFERÊNCIAS 
 
1. MELO, E.B.de; CARVALHO, I. α e β-glucosidases como alvos moleculares para o 
desenvolvimento de fármacos. ​Quim. Nova​ ​2006​, ​29​, 840-843. 
 
2. ASSIS, Elaine Meire de, Polissacarídeos da parede celular de levedura de cervejaria 
(Saccharomyces cerevisiae), obtida por rompimento mecânico da célula e de processo 
industrial de autolise. Disponível em: 
http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/254189 
 
3. NEVES, Luiz Carlos Martins das, Obtenção da enzima glicose 6-fosfato 
desidrogenase utilizando 'Saccharomyces cerevisiae' W303-181. - (Catálogo USP). 
Disponível em: 
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08102006-175534/pt-br.php 
 
4. Apostila de espectrofotometria molecular - CEFET Química-RJ, Análise Instrumental 
Espectrofotometria. Disponível em: http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/547 
 
5. NEVES, P. L, Espectros de Absorção - 1999. ​Disponivel em: 
http://www.ci.uc.pt/pessoal/ruineves/rn/relatorio16.pdf 
 
6. BORTOLI, Daiane Aline da Silva - Multiplicação de leveduras (Saccharomyces 
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Disponível em: 
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ccharomyces_cerevisiae_cervejeiras_utilizando_meios_de_cultura_a_base_de_acucar
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7. FLEURI, L. F. & SATO, H. H. Ciênc. agrotec., Lavras, v. 32, n. 4, p. 1224-1231, 
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LEVEDURAS E INIBIÇÃO DE FUNGOS 1. Disponível em: 
http://www.scielo.br/pdf/cagro/v32n4/a29v32n4.pdf