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AULA 5 – TÉCNICA PCR Reação em cadeia da Polimerase (PCR Desenvolvida por Kary Mullis em 1983, revolucionou a biologia molecular. Método in vitro rápido, sensível e versátil para amplificação seletiva de sequências definidas de DNA ou RNA a partir de amostras complexas de ácidos nucléicos. Gera quantidades de DNA suficiente para manipulação e análises subseqüentes. Aplicações Sequenciamento de genes Diagnóstico de doenças hereditárias e/ou infecciosas Testes de paternidade e na medicina forense Técnica 1. Extração do material genético 2. O Material genético é colocado em microtubo de ensaio juntamente com a enzima polimerase, nucleotídeos, primers, MG2+ e solução tampão. 3. O tubo de ensaio é colocado em um termociclador que alterna ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos determinados para as reações. No termociclador ocorrerá um ciclo com 3 etapas que será repetido várias vezes com alternância de temperatura: I. Desnaturação: processo em que ocorre a separação da fita dupla de DNA por maio da elevação da temperatura (94-96°, 30s-1min) II. Anelamento: a temperatura é reduzida a 55-70° (30s-1min) e os primers se anelam nas duas fitas simples, servindo de iniciadores paraa enzima polimerase. III. Extensão: Aquece-se novamente o tubo a 72° (temperatura ideal de funcionamento da polimerase) para a duplicação da fita. Após o término do primer, a polimerase adiciona os nucleotídeos livres na fita de DNA, ligando-os por complementaridade e formando assim uma nova fita dupla. Estas 3 etapas (I, II e III) acontecem repetidas vezes, formando várias novas fitas de DNA. Portanto, após cada ciclo, o número de fitas se duplica. TÉCNICA ELETROFORESE EM GEL O objetivo é verificar se o gene foi amplificado e se o tamanho do produto obtido pela técnica de PCR está correta. Se sim, a próxima etapa é a purificação do produto do PCR utilizando o gel de agarose. Procedimento realizado após extração, quantificação ou PCR. Sua função é separar e, às vezes, purificar macromoléculas com diferentes tamanhos. Princípio da Eletroforese: consiste na migração e separação de partículas em uma matriz (ou suporte = papel de filtro, acetato de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida), submetidas a uma diferença de potencial elétrico. A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da diferença de potencial a que foram submetidas. A aletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho. O gel de poliacrilamida é usado em separação de proteínas o0u partículas muito pequenas, já o gel de agarose é utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandes. O Dna contém carga negativa, portanto migra para o polo positivo. Quanto maior o tamanho da partícula, maior dificuldade ela terá em percorrer o gel. A Agarose é um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha. É dissolvido em água fervente e então gelifica quando esfria. É mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA. Procedimento O gel de agarose é utilizado emuma cuba horizontal ligada a uma fonte de energia. Uma solução tampão é adicionada à cuda, que irá manter estáveis as condições do pH do meio. Análise e Registro O método mais usado é por coloração com brometo de etídeo, que é um agente intercalante do DNA e é fluorescente UV, porém é cancerígeno. Outros métodos são nitrato de prata e Gel Red O brometo de etídeo se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. Este corante pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampão da amostra a ser aplicada, ou após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr. Resultados Quando submetido à luz UV, o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de tamanho específico. Gel de Poliacrilamida A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a eletroforese, porém em uma cuba de eletroforese vertical. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas) e sua resolução é melhor do que a eletroforese em gel de agarose. Desvantagem: Neurotóxica Vantagens da Eletroforese: capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA, rápida, baixo custo e segura. Limitações: Necessidade de conhecer a sequência de DNA que será amplificada para que seja utilizado primers específicos; Facilidade de contaminação da amostra; Extensão limitada da sequência a se amplificar; Incorporação errônea de bases durante a replicação.
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