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Roteiro Coloração de ZIEHL

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COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
PROFA. TATIANA ELIAS COLOMBO
Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes (géneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.
O gênero Mycobacterium constitui um grupo que causa doenças no homem e nos animais superiores. No homem essas doenças variam de infecções superficiais até a tuberculose. As micobactérias são microrganismos encontrados com facilidade no meio ambiente, com exceção do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Podem sobreviver por longos períodos no solo, pois produzem esporos. Apresentam-se como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente encurvados, imóveis e aeróbios estritos.
Apresentam crescimento lento e alto conteúdo lipídico (ácidos micólicos) na parede celular. Esses lipídios são os responsáveis pela estabilidade ácida.
A coloração de Zehl-Neelsen foi desenvolvida em 1882 por Franz Ziehl e Friedrich Neelsen. O método permite identificar os microrganismos que possuem paredes celulares, ricas em ácido micólico, capazes de resistir ao descoramento pela mistura álcool-ácido, depois de coradas a quente pela fucsina. Na prática, a coloração de Ziehl-Neelsen é utilizada para diferenciar os dois grupos de bactérias: álcool-ácido resistentes (géneros Mycobacterium e Nocardia) e não álcool-ácido resistentes.
Procedimento:
a. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;
b. Deixar secar a temperatura ambiente;
c. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;
d. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de fucsina de Ziehl concentrada;
e. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando lamparina ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante, caso necessário, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento). Este aquecimento deve ser intermitente, pois é importante manter a solução aquecida durante o tempo previsto; 
OBS: É importante queimar os lipídeos da parede, amolecendo-os, para facilitar a entrada do corante.
f. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pela ponta marcada, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;
g. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;
h. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;
i. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;
j. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;
k. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar a temperatura ambiente ou estufa a 35º C;
l. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x).
TABELA DE INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA BACTERIOSCOPIA PARA BAAR
A leitura deve ser feita no mínimo em cem campos microscópios, o que corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, onde está a numeração, até o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente a mais ou menos 5 minutos de observação. Recomenda-se: um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lâminas lidas e utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o número de bacilos encontrados em cada campo microscópio e o resultado deve ser informado em número de cruzes segundo as normas do Ministério da Saúde em vigor.
Manual de Bacteriologia da Tuberculose – Ministério da Saúde / FNS / CENEPI / CNPS / Centro de Referência Prof. Hélio Fraga – 2ª Edição Revisada e Ampliada – 1994.

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