RESUMO TRAB FISIO ii

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INFUSÃO CRÔNICA DE ANGIO II PARA EXPRESSÃO DO RECEPTOR AT1 NO OFS E NA RVLM.
 Fabíola C Nunes e Valdir A Braga
INTRODUÇÃO: A ANG II circula pelo sangue, tem efeitos no SNC promovendo sede, regulação da secreção de ADH e modula o fluxo simpático. O sist. renina-angiotensina modula a atividade do nervo simpático em áreas do cérebro envolvidas na geração e modulação do canal de descarga simpática para o sist. cardiovascular. Sendo as áreas responsáveis pelas ações simpato-excitatórias de ang II: o OFS (orgão subfornical - localiz.: exterior da barreira hematoencefálica, o que permite acesso a angio ii da circulação e da intraventricular) e a RVLM (região ventrolateral rostral da medula - contém neurônios bulboespinhais que medeiam série de reflexos simpaticamente, contribuindo para o estado de doenças, como por exemplo a hipertensão). A área do RVLM possui alta densidade de receptores AT1, uma micro injeção de ang II, faz aumentar atividade desses receptores, resultando em aumento da pressão arterial. Além disso, esses receptores aumentam a pressão sanguínea. Relatos indicam que com a alta pressão do sangue, esses receptores são bloqueados. Neste estudo, foi testada a hipótese de que o aumento dos níveis de Ang II em circulação ativa receptores AT1 na OFS, que por sua vez induzem a produção local de Ang II no cérebro, aumentando a sinalização de Ang II no RVLM através de uma super expressão de receptores AT1. 
MATERIAIS E MÉTODOS: Foram utilizados ratos Wistar machos adultos (250-280g), abrigados em uma temperatura ambiente controlada e com um ciclo definido de 12h de claro e 12h de escuro com acesso livre a ração padrão.
 - Realizando o experimento: Foi implantado nos ratos, subcutaneamente duas mini-bombas osmóticas preenchidas com Ang II (150ng/kg/minute), losartan (10mg/kg/dia) ou soro fisiológico, por 14 dias. Os ratos foram divididos em 4 grupos: (a) tratamento: solução soro fisiológico + soro fisiológico. (b) tratamento: solução soro fisiológico+ losartan. (c) tratamento: angiotensina II + soro fisiológico. (d) tratamento: Ang II + losartan. Após a infusão da droga, os ratos foram anestesiados com cetamina e xilazina (75 e 10 mg / kg) e equipado com cateteres venosos e arteriais femorais para injeção de drogas e registros da pressão arterial. No dia do experimento, a pressão arterial média foi registrada durante 1 hr com os ratos conscientes e a após 24 hrs a implantação do cateter foi medida a pressão arterial. 
Após medir as pressões sanguíneas, os ratos receberam uma dose de hexametônio (30 mg / kg) (O hexametônio é utilizado para tratar hipertensão e hemorragias durante cirurgias). Intenção da aplicação do hexametônio: bloquear os gânglios da base, para avaliar a contribuição da atividade simpática à hipertensão.
Em um subgrupo de animais, os ratos foram decapitados e os cérebros rapidamente congelados. O RNA total foi extraído a partir de SFO fresco e RVLM punções usando reagente TRIzol. As espécies de cDNA (DNA complementar) foram sintetizados utilizando Superscript II a partir de 1 ug de RNA total, num volume total de 20 ul com um iniciador aleatório. PCR em tempo real para os receptores AT1 e b-actina foi realizada da seguinte forma: volume total foi de 25 ul, composto de SYBR 1X PCR Master Mix, 300 nM de iniciador direto (primer) 300nM de primer reverso e 25 ng de cDNA. A reação de PCR foi realizada em três exemplares utilizando um ABI 7500 Rápido Real Time PCR System com 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s, cada um a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Os dados foram analisados com Sequence Detection Software v1.4 (Applied Biosystems). A abordagem relativa da expressão ΔCt (expressão relativa = 2-ΔCt, onde ΔCt = Cttarget gene - gene Ctcontrol) foi utilizada para examinar a expressão de mRNA dos receptores AT1a em relação à b-actina.
- Análise estatística: Os resultados foram analisados por uma análise única de medidas repetidas de variância (ANOVA), seguido de um pós-teste de Tukey. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism. Com significância estatística p <0,05.
RESULTADOS
Figura 1: Infusão crônica de angiotensina II induz hipertensão mediada pelo simpático. Os ratos tratados com solução soro fisiológico+ Ang II apresentaram um aumento significativo na pressão sanguínea após os 14 dias de infusão de angiotensina II em comparação com os ratos infundidos com solução soro fisiológico+ solução soro fisiológico, já os ratos tratados com solução soro fisiológico+ losartan não se tornaram hipertensos quando comparados aos do grupo solução soro fisiológico+ solução soro fisiológico. o tratamento com Ang II + losartan impediu a hipertensão.
Para investigar melhor a contribuição do sistema nervoso simpático na hipertensão induzida por Ang II, foi administrado hexametônio. Este produziu uma maior queda na pressão sanguínea em animais tratados com Ang II + soro fisiológico se comparado aos animais tratados com soro fisiológico + soro fisiológico, soro fisiológico + losartan e Ang II + losartan.
Figura 2: Infusão crônica Ang II induz a expressão diferente receptor AT1 na OFS e no RVLM. Alterações nos níveis de mRNA do receptor AT1 em OFS e no RVLM (OFS - importante região reguladora cardiovascular que influencia Ang II em eventos de sinalização no RVLM). Os níveis de mRNA de receptores AT1 na RVLM foram aumentadas significativamente ao 14 ° dia da Ang II + infusão de soro fisiológico (comparando com o grupo de controle de soro fisiológico + soro fisiológico). Em contraste, os níveis de mRNA do receptor AT1 foram significativamente menores no SFO (comparando com uma solução soro fisiológico + soro fisiológico). A infusão de Losartan restaurou os níveis de mRNA do receptor AT1 para o controle soro fisiológico.
DISCUSSÃO: A infusão crônica de Ang II evocou hipertensão mediada simpático, que foi acompanhada por um aumento nos níveis de mRNA dos receptores AT1 na RVLM, enquanto reduzem na OFS (determinado pelo teste PCR em tempo real). Estudos atuais mostram que a expressão do receptor AT1 diferencial no RVLM e SFO como um mecanismo fundamental subjacente aos efeitos pressor e simpato-excitatórios que são implicados por aumento nos níveis circulantes de Ang II. 
 No presente estudo a dose de ang II utilizada foi responsável pelo aumento dos níveis plasmáticos de ang II.