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LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB Cap. 12 ABBAS: Ativação de Linfócitos B e produção de Anticorpos A imunidade humoral é mediada por anticorpos secretados, produzidos por células B. Reconhecimento do antígeno e ativação da célula B induzida pelo antígeno. Para iniciar as respostas de anticorpos, os antígenos devem ser capturados e levados aos locais onde se encontram as células B nos órgãos linfoides. Os antígenos então começam a ativar os linfócitos B, o que geralmente envolve a participação de outros sinais desenvolvidos durante as infecções ou adjuvantes de vacinas. Captura do Antígeno e apresentação para a célula B A maior parte das células B virgens maduras são células B foliculares, que recirculam continuamente no sangue e migram de órgão linfoide em órgão linfoide em busca de Antígeno. Essas células entram no órgão linfoide secundário pela corrente sanguínea, passando inicialmente pela zona de célula T e são atraídas então para a zona de célula B, os folículos desses tecidos. Esse processo de migração é mediado pela citocina CXCL13 (secretada pelas células dendríticas foliculares e por outras células estromais), que se liga ao receptor CXCR5 na superfície das células B. Há várias formas e rotas de ativação dos linfócitos B virgens nos órgãos linfoides. • A maior parte dos antígenos provenientes de locais dos tecidos chegam aos linfonodos através dos vasos linfáticos aferentes. Os antígenos solúveis, pequenos, chegam ao folículo após passarem pelos circuitos, que se estendem entre o seio subcapsular e o folículo. • Os macrófagos do seio subcapsular capturam antígenos maiores ou imunocomplexos e os apresentam aos linfócitos B do folículo logo abaixo. • Muitos antígenos que chegam pelos vasos linfáticos aferentes muitas vezes não são aprisionados pelos macrófagos da zona subcapsular, e também são grandes demais para passarem pelos circuitos. Cabe as células dendríticas da zona medular captura-los e transportá-los para os folículos, onde podem apresenta-los para as células B. • Imunocomplexos podem se ligar aos receptores do complemento (principalmente CR2) presente na membrana de células da zona marginal, e essas células podem então transferir esses imunocomplexos para as células B foliculares. • Os imunocomplexos podem se ligar a CR2 presente nas células dendríticas que apresenta esses antígenos para as células B antígeno-específicas. • Patógenos transportados pelo sangue geralmente são capturados por células dendríticas plasmocitóides que migram para o baço e apresentam esses antígenos para as células B da zona marginal. • Antígenos de polissacarídeos podem ser capturados por macrófagos da zona marginal dos folículos linfoides e ser apresentados ou transferidos para as células B dessa área. * em todos esses casos, os antígenos são apresentados para a células B sem antes serem processados, como deve ocorrer na apresentação para as células T. Ativação da célula B por antígeno e outros sinais As células B foliculares imaturas vivem por tempo limitado até que encontrem o antígeno. A sobrevivência dessas células depende de sinais emitidos pelo BCR (receptor de célula B) e por estímulos recebidos de uma citocina da família das TNF, a BAFF, que estimula tanto sobrevivência como maturação através do receptor LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB de BAFF. Quando a BAFF está relacionada com um ligante APRIL, pode estimular outros dois receptores, TACI e BCMA, que participam de estágios mais avançados da ativação e maturação das células B (troca de isotipo para IgA). Esses citocinas são produzidas principalmente por células mieloides da medula óssea e dos folículos linfoides. A ativação dos linfócitos B começa com a ligação do antígeno-especifico com o complexo BCR, que envolve a Ig de membrana associada com as proteínas Ig-alfa e Ig-beta, presente nas células B maduras. O BCR exerce duas funções essenciais na ativação da célula B. A primeira é a liberação de sinais bioquímicos que ativam a célula B após o reconhecimento do antígeno. A segunda é a internalização do antígeno em vesículas endossomais, e caso o antígeno seja de natureza proteica, ele será processado e possivelmente apresentado para as células T via MHC de classe II. Somente o reconhecimento do antígeno pelo BCR é insuficiente para estimular de forma significativa o linfócito B. Para que uma resposta completa seja induzida, outros estímulos são necessários a fim de cooperar com o acoplamento do BCR, como o reconhecimento de proteínas do complemento pelo CR2/CD21, reconhecimento de PAMPs e no caso de antígenos proteicos, estímulos das células T auxiliares. O receptor CR2 reconhece o fragmento C3d do complemento e atua como um correceptor para as células B, aumentando o sinal de ativação. Alguns polissacarídeos não microbianos tb ativam o complemento pela via alternativa ou das lectinas, e esse é um dos porquês tais antígenos são capazes de estimular respostas T independentes. As células B expressam diversos tipos de TLRs (toll-like receptors) que, quando reconhecem PAMPs, fornecem sinais que aumentam ou cooperam com os sinais dos BCRs durante a ativação celular. Além disso, o reconhecimento de PAMPs a partir de células mieloides pode ativar indiretamente os linfócitos B de duas maneiras. As células dendríticas ativadas por meio dos TLRs promovem a ativação das células T helper, que contribuem com a ativação de linfócitos B contra antígenos proteicos. Além disso as células mieloides ativadas por TLRs secretam BAFF e APRIL, citocinas que podem induzir a resposta T-independentes pelos linfócitos B. Respostas funcionais das células B a antígenos. Eventos celulares distintos são induzidos pela ligação do antígeno, a depender se são antígenos multivalentes (T-independentes) ou antígenos proteicos (T-dependentes). Antígenos multivalentes são independentes de células T auxiliares por que são capazes de gerar ligações cruzadas. Isso é, devido a repetição de um mesmo epítopo em cada molécula ou na superfície de uma célula, esse antígeno é capaz de ativar vários BCRs ao mesmo tempo, provocando uma sinalização forte o suficiente para gerar a ativação da célula B, resultando em proliferação e diferenciação. Em resposta a esses antígenos multivalentes, as células B que antes estavam em repouso entram no estagio G1 do ciclo celular, e isso é acompanhado do aumento de tamanho celular, de RNA citoplasmático e na síntese de organelas, como ribossomos. Algumas dessas células B se diferenciam em plasmócitos secretores de anticorpo de vida curta. A sobrevivência dos linfócitos B estimulados aumenta devido ao aumento da expressão de proteínas antiapoptóticas, como Bcl-2. Antígenos proteicos geralmente apresentam somente um mesmo epítopo por molécula, o que o incapacita de estabelecer ligações cruzadas e limita sua capacidade de ativar BCR. Como isso, antígenos proteicos são incapazes de produzir sinais fortes o suficiente para gerar proliferação de diferenciação de células B. No entanto, eles são suficientes para influenciar a sobrevivência, induzir alterações nos receptores de quimiocinas (resultando no tráfico de células B para fora dos folículos) e promover a endocitose do antígeno. Quando o antígeno proteico for internalizado pelo BCR, ele é processado e apresentado por moléculas de MHC classe II aos linfócitos T auxiliares. Vale lembrar que a expressão de moléculas do MHC tb fica aumentada em linfócitos B ativados por antígenos proteicos, assim como a expressão de coestimuladores B7. LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB As células T auxiliares são potentes estimuladoras da proliferação e diferenciação das células B. Assim, nas respostas dependentes de T, umas das principais funçõesdo BCR é facilitar a endocitose do antígeno para apresentação, e não estimular a proliferação e diferenciação. Sequência de Eventos Durante a Resposta de Anticorpo Dependente de Célula T Antígenos proteicos são reconhecidos pelos linfócitos B e T nos órgãos linfoides periféricos, onde as células ativadas pelo mesmo antígeno se encontram para iniciar a resposta imune humoral. Algumas das celulas B retornam para os folículos para formar os centros germinativos, aonde uma resposta de anticorpos mais especializada é montada. Ativação inicial e migração de células B e T auxiliares A ativação das células B e Th pelo mesmo antígeno é essencial para a interação funcional dessas duas celulas, e para que elas se aproximem a fim de aumentar a probabilidade de encontro entre elas. Esse encontro é necessário para gerar uma forte resposta de anticorpos. Isso é alcançado por um movimento regulado das células após o reconhecimento antigênico. Nesse processo, as celulas T auxiliares diminuem a expressão do receptor de quimiocina CCR7 e aumentam a expressão de CXCR5, fazendo com que a célula deixe a zona de célula T e migre em direção ao folículo graças ao gradiente de CXCL13 (ligante de CXCR5), que é secretado pelas células dendríticas foliculares e pelas células estromais do folículo. Além disso, as células B respondem aos mesmos antígenos diminuindo a expressão do receptor CXCR5 e aumentando a expressão de CCR7, fazendo com que as celulas B ativadas migrem em direção à zona de célula T. As células B ativadas tb podem expressar CD69, que bloqueia a expressão dos receptores de superfície para a esfingosina 1-fosfato, causando retenção dessas células nos linfonodos. Como resultado de tudo isso ocorre o encontro entre células B e células T auxiliares ativadas pelo antígeno. Os antígenos proteicos são endocitados pelas células B e apresentados de uma forma que possam ser reconhecidos pelas células T auxiliares. Apresentação de antígeno pelas células B e o efeito carregador de haptenos Os antígenos peptídicos reconhecidos pelas células B são endocitados e processados para gerar peptídeos que se liguem ao MHC classe II e sejam reconhecidos pelas células TCD4. Assim, um antígeno proteico que LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB provoca uma resposta T-dependente utiliza pelo menos dois epítopos específicos para a ativação das celulas B: um epítopo na superfície da proteína nativa é reconhecido pela Ig de membrana, e o outro é um epítopo de peptídeo linear que é posteriormente liberado dessa proteína e ligado a molécula de MHC II, e reconhecido pelas células T auxiliares. Os anticorpos secretados no final são, geralmente, específicos para o epítopo nativo da proteína, pois foi esse epítopo o reconhecido pela Ig de membrana, e a mesma Ig é secretada por plasmócitos derivados das células B. Ou seja, a resposta de anticorpo resultante é sempre especifica a um epítopo da proteína nativa, independente dos epítopos dessa proteína processada aos quais as células T auxiliares tiverem afinidade. Efeito hapteno carregador: Nas respostas aos conjugados hapteno-carreador, o haptenos (o epítopo da célula B) é reconhecido por uma célula B específica, o conjugado é endocitado, a proteína carreadora é processada na célula B e os peptídeos do carreador (os epítopos da célula T) são apresentados para a célula T auxiliar. Assim, dois linfócitos atuam juntos reconhecendo duas porções diferentes (epítopos) do mesmo complexo antigênico. O hapteno é responsável pela internalização eficiente da proteína carregadora, o que explica o porque o hapteno e o carregador devem estar ligados fisicamente. Papel do CD40L: Interação do CD40 na Ativação da Célula B Dependente de T Células T auxiliares, ativadas pelo antígeno apresentado pelo linfócito B, expressam CD40L que interagem com o CD40 na superfície do linfócito B induzindo-o a proliferação e a diferenciação. Nesse momento, as células Th tb secretam citocinas e contribuem para as respostas da célula B. O CD40L induz alteração da conformação de CD40, induzindo-o a associação das proteínas citosólicas TRAFs com o domínio citoplasmático do CD40. Os TRAFs recrutados induzem cascatas de sinalização que levam a ativação dos fatores de transcrição, como o NF-KB e o AP-1, que estimulam a proliferação da célula e o aumento da síntese e secreção de Ig. A indução de transcrição via CD40 tb é importante para alterações nos centros germinativos. As células Th ativadas secretam citocinas cujos papeis mais bem definidos são aqueles relacionados a troca de isotipo. Diversas citocinas estão relacionadas com as etapas iniciais de diferenciação e proliferação dos linfócitos B, mas não está claro se são realmente essenciais para isso. O vírus Epstein-Bars (EBV) pode levar a imortalização de celulas B e causar linfomas. Isso se dá pela atuação de uma proteína de transformação do EBV chamada LMP1 (proteína latente de membrana 1) que se associa a TRAF de modo homólogo a CD40, ativando a TRAF para induzir a proliferação do linfócito B. A interação inicial entre linfócitos Th e linfócitos B ocorre na interface entre o folículo e a zona de célula T. A ativação subsequente pode ocorrer nos centros germinativos no foco extrafolicular, e esses locais determinarão a natureza da resposta da célula B. LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB Ativação de Células B Extrafoliculares A ativação das celulas B nos focos extrafoliculares por antígenos T dependentes produz anticorpos de baixa afinidade que contribuem para uma defesa inicial contra a infecção, geralmente limitando a sua propagação. Essas celulas do foco extrafolicular possuem pouca capacidade de troca de isotipo, são do tipo vida curta e não adquirem capacidade para migrar para locais distantes, como a medula óssea, por exemplo. A resposta extrafolicular auxilia no desenvolvimento de celulas T auxiliares foliculares, que migram para os folículos e são necessárias para a formação do centro germinativo. Algumas células B ativadas pelo antígeno no foco extrafolicular também retornam para o folículo, onde participam da formação do centro germinativo e sofrerão alterações que resultam em uma resposta humoral mais eficiente e de longa duração (diferenciação em plasmócitos). Essa migração acontece porque os anticorpos secretados pelas células B extrafoliculares muitas vezes formam imunocomplexos que contém antígenos, anticorpo e as vezes proteínas do complemento, que ficam aprisionados nas células dendríticas foliculares nos tecidos linfoides. Essas células liberam então quimiocinas que atraem um ou dois linfócitos B ativadas do foco extrafolicular para o folículo, a fim de iniciar a reação do centro germinativo. No baço, focos extrafoliculares se desenvolvem nas porções mais externas da bainha linfoide periarteriolar rica em células T ou entre a zona de célula T e a polpa vermelha. Esses conjuntos são chamados de focos de PALS. Focos similares, também T dependentes, são formados nos cordões medulares dos linfonodos. Reação do centro germinativo É o conjunto de reações que acontecem nos centros germinativos, incluindo o próprio desenvolvimento desses locais, a maturação da afinidade, troca de isotipo e geração de plasmócitos e células B de memória de vida longa, durante as respostas T dependentes. Os centros germinativos se desenvolvem cerca de 4 a 7 dias após o início de uma resposta T-dependente das células B. Nesse momento algumas células B extrafoliculares ativadas migram para esses locais e se proliferam massivamente, formando uma região distinta do folículo, o centro germinativo (C.G). Cada C.G completamente formado contem células de apenas um clone, ou de poucos, de celulas B especificas para oantígeno. Dentro do centro germinativo existe uma zona escura abundante em células B que se proliferam rapidamente, chamadas de centroblastos. Em torno de 5 dias, um único linfócito pode dar origem a uma progênie de cerca de 5 mil células. A progênie dessas células em proliferação é constituída por celulas menores, chamadas centrócitos, que sofrem processo de diferenciação e seleção na zona clara. As celulas B LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB dos centros germinativos expressam um repressor transcricional chamado Bcl-6, que é responsável por permitir a proliferação massiva das células B, entre outras funções. A arquitetura dos folículos linfoides e a reação do centro germinativo depende da presença das células dendríticas foliculares (FDCs). As FDCs expressam receptores do complemento e receptores de Fc (para liberar quimiocinas e atrair linfócitos B extrafoliculares e dar início à reação do centro germinativo). Essas células tb estão envolvidas com a apresentação de antígenos para a seleção de células B do centro germinativo após os processos de maturação da afinidade. As FDCs são diferentes das células dendríticas que expressam MHC classe II e que capturam antígenos nos tecidos e os transportam para os tecidos linfoides para apresentar peptídeos aos linfócitos T. As FDCs não expressam MHC classe II e não são derivadas de células progenitoras na medula óssea (M.O). elas estão presentes na zona clara dos centros germinativos e possuem longos processos citoplasmáticos. A reação do centro germinativo é constituída em etapas sequenciais: 1º. As células B em proliferação acumulam-se na zona escura. Lá elas se proliferam e sofrem troca extensiva de isotipos e hipermutação somática dos genes V de Ig. 2º. A pequena progênie de células B que não estão em divisão migram para a zona clara onde entram em contato com os processos das FDCs e também fazem contato estreito com as células Tfh, e é nesse ponto que ocorrem os eventos de seleção. As células B que sobrevivem, que são as que apresentam alta afinidade ao antígeno, se diferenciam plasmócitos de vida longa, que migram para a M.O, ou se diferenciam em células B de memória, que entram no conjunto de linfócitos recirculantes. A formação dos centros germinativos é dependente de CD40L nos linfócitos Tfh que interagem com CD40 nos linfócitos B, processo necessário para a proliferação dos linfócitos B nos centros germinativos e também para a troca de isotipos e maturação da afinidade. Indução de células T auxiliares foliculares As celulas B extrafoliculares, 4 a 7 dias após o início da resposta humoral ao antígeno T-dependente, induzem as celulas T CD4 previamente ativadas para que se diferenciem em células Tfh. Essa diferenciação da célula T depende do contato do ICOSL na membrana do linfócito B com o ICOS na membrana do LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB linfócito T. As células Tfh expressam altos níveis de CXCR5 que promove a migração para os folículos linfoides pelo gradiente de CXCR13. As células Tfh tb expressam IL-21 e o fator de transcrição Bcl-6. A diferenciação das células Tfh a partir de células T CD4 ocorre em dois passos: ativação inicial pelas células dendríticas que apresentam o antígeno e subsequente ativação pelas células B. O direcionamento para célula Tfh e não Th1, Th2 e Th17 resulta em parte da força de interação inicial entre o complexo MHC Classe II- peptídeo na célula dendrítica e o TCR das células TCD4 imaturas. Essa forte ativação do TCR induz a expressão de Bcl-6 e baixos níveis do receptor de IL-2, o que inibe a aquisição do fenótipo das outras T helpers. Algumas dessas células começam a expressar CXCR5, mas a diferenciação em célula Tfh só se completa após a ativação por células B ativadas. A citocina IL-25 define a diferenciação da célula Tfh, e é importante para a seleção de células B no centro germinativo e induz a diferenciação de células B em plasmoblastos. Além de IL-25, as células Tfh tb secretam IFN-y ou IL-4, que participam do processo de troca de isotipo. Troca de isotipo (classe) da cadeia pesada Em respostas T dependentes, algumas células B que expressam IgM ou IgG sofrem troca de isotipo da cadeia pesada e passam a secretar outras classes de anticorpos. Algumas vezes ocorrem trocas de isotipos em células B que se encontram em focos extrafoliculares devido a ação de células T auxiliares lá presentes. Mas isso ocorre com maior frequência nos centros germinativos sob a influência das células Tfh. Cabe lembrar que a troca de isotipo envolve apenas a mudança das regiões constantes das cadeias pesadas, alterando a função efetora dos Ac. A troca de isotipo em resposta a diferentes microrganismos é regulada por citocinas secretadas por células T auxiliares ativadas por esses microrganismos, ou por outras células mieloides (BAFF e TACI são secretadas por células mieloides e induzem respostas de IgA na ausência de células T). Essa troca de isotipos mediada por citocinas é importante para a plasticidade da resposta de anticorpos nos diferentes locais anatômicos e nas diferentes infecções. Por exemplo, nos tecidos de mucosa as células B mudam para IgA, que é a classe de Ac mais eficientemente transportada através dos epitélios para as secreções mucosas. LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB A interação CD40 induz a enzima AID, que é crucial para a troca de isotipos e também para a maturação da afinidade, pois promove a deaminase de nucleotídeos situados na região de troca entre os segmentos J e C, possibilitando o recorte e a recombinação do DNA da cadeia pesada da Ig. Esse mecanismo é denominado recombinação de troca. A enzima AID (deaminase induzida por ativação) é ativada principalmente por sinais de CD40 de células Tfh. A enzima desamina as citosinas nos moldes de DNA convertendo-as em uracila nas regiões de troca. Uma enzima chamada Uracila N-glicosilase remove os resíduos de U, deixando locais abásicos. A endonuclease Apel cliva esses pontos abásicos, gerando um corte em cada posição. Os cortes gerados nas duas fitas contribuem para as quebras da fita dupla, que são unidas pela maquinaria celular por meio da união entre as terminações não homologas. Nesse processor, o DNA entre as duas regiões de troca é eliminado e o resultado final é que a região V rearranjada original torna-se adjacente a uma nova região constante. LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB Maturação de afinidade: Mutação Somática dos Genes Ig e Seleção de Células B de Alta Afinidade A interação CD40L:CD40 é necessária para o inicio da mutação somática nos genes V das Ig (hipermutação somática), que podem aumentar a afinidade da região determinante de complementariedade ao antígeno. Por isso só há maturação da afinidade em respostas de anticorpos T-dependentes. No início da resposta, há produção de Igs de baixa afinidade. Essa maturação irá ocorrer durante a reação do centro germinativo, e resulta na seleção das células com receptores de antígenos de alta afinidade, que também geram anticorpos de alta afinidade. As mutações podem resultar em até 10 substituições de aminoácidos. Algumas características dessas mutações são dignas de nota. Primeiro, essas mutações estão agrupadas nas regiões V, principalmente nas regiões determinantes de complementariedade do antígeno. Segundo, há muito mais mutações em anticorpos IgG do que em anticorpos IgM. Terceiro, as mutações estão relacionadas com o aumento da afinidade pelo antígeno que induziu a resposta. O papel da AID também é essencial na maturação de afinidade, em um processo semelhante ao da troca de isotipo. A estimulação repetida a um antígeno pode ser benéfica para produzir Igs de alta afinidade pormeio de um no maior de mutações. Porém, muitas mutações podem gerar uma afinidade menor ou até mesmo uma perda de capacidade de ligação ao antígeno, e por isso a seleção de anticorpos de alta afinidade é indispensável. A resposta inicial ao antígeno envolve a produção de anticorpos, os quais podem formar complexos com o antígeno residual e ativar o complemento. As células dendríticas foliculares expressam receptores para as porções Fc dos anticorpos e expõem os antígenos na zona clara do folículo germinativo. As células B que sofreram mutação somática no gene V, que estão na zona escura migram para a zona clara, que é rica em FDCs e estão apresentando os antígenos. As células B na zona clara irão morrer, exceto se reconhecerem o antígeno apresentado pelos processos das FDCs ou terem reconhecido o Ag de forma livre. As células B que se ligam com alta afinidade ao Ag tem preferência de se ligar a ele, quando esse está em baixas concentrações, e isso faz essas células sobreviverem preferencialmente. Isso acontece, primeiramente porque o reconhecimento do Ag por si só induz a expressão de proteínas antiapoptóticas, como Bcl-2. Em segundo lugar, as células B com maior afinidade ao Ag terão preferência para executar a endocitose e a apresentação via MHC classe 2 para as escassas células Tfh presentes no folículo. essas células Tfh podem induzir sinais de sobrevivência para a célula B via interação CD40L:CD40. Em terceiro lugar, as células B de alta afinidade que reconheceram o antígeno ativam inibidores de Fas, enquanto as células que não reconheceram continuam expressando esse receptor de morte, que pode ser reconhecido pelo seu ligante nas celulas Tfh e ser ativado, induzindo a célula B a apoptose. Quanto mais anticorpo é produzido, mais antígeno é eliminado. Com isso, as células B precisam expressar cada vez mais afinidade ao antígeno, o que faz com que a resposta aos anticorpos seja aprimorada com o desenvolvimento da resposta. As células B que estão no centro escuro sofrendo mutação somática se chamam centroblastos, e possuem AID nuclear. Essas celulas podem ciclar entre a zona escura basal e a zona clara apical, onde se diferenciam morfologicamente em células chamadas centrócitos. Os centrócitos de alta afinidade podem ser selecionados pelo antígeno, e sofrer troca de isotipo adicional, com auxílio das células Tfh. As celulas selecionadas diferenciam-se em células B de memória ou em plasmócitos secretores de anticorpos de alta afinidade que deixam o centro germinativo. Muitos linfomas podem se desenvolver a partir do centro germinativo, pois a hipermutação somática pode gerar translocações cromossômicas de vários oncogenes em loci de genes Ig, produzindo tumores de células B. Diferenciação da Célula B em Plasmócitos Secretores de Anticorpos LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB Os plasmócitos são celulas B terminalmente diferenciadas, comprometidas com a produção abundantes de anticorpos. Eles são gerados após a ativação das celulas B por sinais do BCR, CD40, TLRs e receptores de citocinas. Existem dois tipos de plasmócitos, um de vida curta e outro de vida longa. Os plasmócitos de vida curta são formados pela resposta de anticorpos T-independentes e no começo da resposta T-dependente, por células B presentes no foco extrafolicular. Essas celulas são encontradas em órgãos linfoides secundários ou em tecidos não linfoides periféricos. Os plasmócitos de vida longa são formados no centro germinativo em respostas T-dependentes a antígenos proteicos. Os sinais dos receptores de antígeno e da citocina IL-21 contribuem para formar os plasmócitos e seus precursores, os plasmoblastos. Os plasmoblastos são encontrados preferencialmente na corrente sanguínea, onde podem ser identificados como células secretoras de Ac que não expressam CD20 (marcador de celulas B maduras). Esses plasmoblastos são direcionados para a medula óssea, onde se diferenciam em plasmócitos de vida longa. Lá, eles são mantidos vivos por citocinas da família BAFF (produzidas por células mieloides) que se ligam a um receptor de membrana chamado BCMA, o que possibilita que os plasmócitos vivam por longos anos, frequentemente tanto quanto o hospedeiro. A medula óssea se torna o principal local de produção de anticorpos 2 a 3 após a imunização com um antígeno T-dependente. Os anticorpos podem ser secretados por esses plasmócitos durante anos, mesmo que o antígeno não esteja mais presente, oferecendo proteção imediata se o antígeno for encontrado novamente. Esses Ac são direcionados para a circulação e para a secreção de mucosas, já os plasmócitos continuam limitados a medula óssea. A diferenciação de células B em plasmócitos secretores de anticorpos envolvem grandes mudanças estruturais nos componentes do reticulo endoplasmático e da via secretora, além do aumento da produção de Ig e uma alteração na cadeia pesada das Ig da forma de membrana para a forma secretada. A células aumenta notavelmente de tamanho, principalmente a razão entre o tamanho do citoplasma e o núcleo. O núcleo tb aumenta consideravelmente de tamanho. O reticulo endoplasmático se torna bastante proeminente, e a celulas quase não tem semelhança com um linfócito B. A mudança do Ig de membrana para a Ig secretada é resultado de alterações na porção carboxiterminal da cadeia pesada da Ig. Na cadeia de membrana a porção de cauda contém 26 aminoácidos hidrofóbicos seguidos de uma cauda citoplasmática, enquanto na cadeia da Ig secretada, o domínio C𝜇4 é seguido por uma porção de cauda com aminoácidos polares (hidrofílicos). Essa transição de Ig de membrana para Ig secretada é determinada pelo processamento alternativo de RNA do RNA mensageiro. O processamento alternativo do transcrito primário, que é regulado pela clivagem do RNA, e a escolha dos locais de poliadenilação, determina se os éxons para a porção transmembrânica e citoplasmática são incluídas ou não no RNA maduro. Se estiverem incluídos, a cadeia 𝜇 produzida contem domínios transmembrânicos e citoplasmáticos, e, portanto, permanece aderida a bicamada lipídica. Se por outro lado, o domínio transmembrânico for excluído da cadeia 𝜇, a extremidade carboxi-terminal conterá cerca de 20 aminoácidos consistindo na porção da cauda. Como essa proteína não contém uma extensão de aminoácidos hidrofóbicos ou uma cauda citoplasmática, ela não fica aderida a membrana e é, portanto, secretada. A maior parte do RNAm da cadeia pesada de um plasmócito é clivado antes da poliadenilação, resultando em uma maioria de Igs secretados. Todos os genes CH contem éxons semelhantes e todas as cadeias pesadas podem ser potencialmente expressas tanto na forma de membrana como na forma secretada. No entanto, a forma secretada da cadeia pesada δ raramente é feita, de maneira que a IgD geralmente está presente apenas como uma proteína de membrana. Geração de Células B de Memória Algumas células B de memória são geradas na reação do centro germinativo e são rapidamente responsivas a futuras invasões do mesmo antígeno. Essas celulas, que são geradas junto com as celulas T auxiliares de memória, são capazes de viver por longos períodos sem a necessidade de estimulação antigênica, graças a alta expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2. Algumas celulas B podem permanecer no órgão em que foram geradas, ao passo que outras podem recircular pelo sangue e migrar entre os órgãos linfoides. Caracteristicamente, as celulas B de memória expressam receptores de antígenos de alta afinidade e moléculas de Ig que sofreram troca de isotipo recentemente. A produção de anticorpos de alta afinidade pós troca de isotipo é bastante acelerada após a segunda exposição ao antígeno, e isso se dá pela ativação das celulas B de memoria nos centros germinativos.Vacinas contra microrganismos e toxinas bacterianas devem LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB ser capazes de estimular a ação das células T foliculares, a fim de produzir células B de memoria e produção de anticorpos de alta afinidade. Isso vem sendo usado nas vacinas em que o polissacarídeo bacteriano é incapaz de estimular as células T. Esse polissacarídeo é então administrado junto com uma proteína estranha para formar o equivalente a um conjugado hapteno-carregador, capaz de induzir as células T auxiliares. Tais vacinas são denominadas vacinas conjugadas. Papel dos Reguladores Transcricionais na Determinação do Destino das Células B Ativadas O resultado da diferenciação e proliferação das celulas B é mediado por diferentes fatores de transcrição. Bcl-6: Nas células B do centro germinativo, os sinais induzidos pelo CD40 e por citocinas como a IL-21 induzem a alta expressão das proteínas Bcl-6 pelos Linfócitos B, que funciona como um repressor transcricional que permite a proliferação massiva das células B nesse local. Bcl-6 reprime a expressão dos inibidores de quinase dependentes de ciclina e assim coopera com os ativadores transcricionais, como o C- myb, para que o linfócito B adentre o centro germinativo em fase de ciclo celular rápido. Além disso, Bcl-6 também reprime p53, um fator de transcrição que induz a célula à parada do ciclo celular e à apoptose em casos de lesão do DNA. Como resultado, os centroblastos podem tolerar os danos causados ao DNA na hipermutação somática e na troca de isotipo sem entrar em apoptose. Bcl-6 também antagoniza o papel de outro repressor transcricional chamado Blimp-1, que é necessário para o desenvolvimento de plasmócitos, evitando que as células B se diferenciem em plasmócitos durante a proliferação massiva que é característica do centro germinativo. Blimp-1 e IRF4: Blimp-1, um repressor transcricional e IRF4, um ativador de transcrição, são responsáveis por direcionar a célula B para a diferenciação em plasmócito. Blimp-1 reprime a expressão de Bcl-6 e outro fator de transcrição, Pax5, que é necessário para a manutenção de celulas B maduras. Assim, Bilmp-1 é permissivo para o desenvolvimento de plasmócitos. IFR4 contribui para a expressão de XBP-1, que protege o desenvolvimento dos plasmócitos das consequências prejudicais do não dobramento adequado de proteínas, que ocorre devido ao grande aumento da síntese de proteínas, e contribui para a maturação de plasmócitos e para o aumento da síntese de Ig nessas celulas. Os fatores de transcrição que direcionam o desenvolvimento de celulas B de memória ainda não foram descobertos, mas sabe-se que existe um baixo nível de expressão de IFR4 percebido em alguns clones dessas celulas, o que impossibilita a diferenciação da célula B em plasmócito, tornando possível a geração de celulas B de memória. Respostas de anticorpos a antígenos T Independentes Antígenos T independentes são aqueles de natureza não proteica, como polissacarídeos e lipídeos, e que não geram, portanto, a ativação das células T auxiliares para a produção de anticorpos. Esses anticorpos, que são produzidos na ausência da célula T auxiliar, são geralmente de baixa afinidade e que consistem principalmente em IgM, e com pouca ou nenhuma troca de isotipo, limitada a principalmente IgG e IgA. Subpopulações de Células B que Respondem aos Antígenos T- independentes (TI) Enquanto a resposta a antígenos proteicos T-dependentes é mediada principalmente por células B foliculares, células B da zona marginal e células B-1 são as principais mediadoras das respostas de anticorpos a antígenos TI. As células B da zona marginal respondem principalmente a polissacarídeos, que, após a ativação, se diferenciam em plasmócito de vida curta e produzem principalmente IgM. As células B-1, situadas principalmente no peritônio e nas mucosas também respondem prontamente aos antígenos TI. As respostas aos antígenos TI podem acontecer no baço, medula, peritônio e mucosas. Os macrófagos localizados nas zonas marginais aos folículos linfoides no baço são muito eficientes no aprisionamento de LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB polissacarídeos quando esses antígenos chegam pela via endovenosa, prontos para serem reconhecidos por células B específicas. Mecanismos de Respostas de Anticorpos T-independentes Os antígenos TI mais importantes são polissacarídeos, glicolipídios e ácidos nucleicos, que não podem ser apresentados via MHC. A maior parte dos antígenos TI são multivalentes, sendo compostos por epítopos antigênicos idênticos em repetição. Tais antígenos multivalentes podem induzir ligação cruzada máxima do complexo BCR em células B específicas, levando à ativação sem a necessidade de uma célula T auxiliar cognata. Além disso, muitos polissacarídeos ativam o sistema complemento pela via alternativa, gerando C3d, que se liga ao antígeno e é reconhecido por CR2, aumentando assim a ativação de células B. As proteínas de membrana, quando são encontradas em uma alta densidade na superfície microbiana, podem ser funcionalmente multivalentes e funcionarem tanto de uma maneira TI como T-dependente. Além disso, as respostas TI tbm podem ser facilitadas pelo reconhecimento adicional dos PAMPs pelos TLRs nas células B. Embora as respostas TI apresentem pouca troca de isotipo, alguns antígenos não proteicos são capazes de desencadear a produção de Igs diferentes de IgM e IgG. As citocinas produzidas por celulas diferentes de T, como células mieloides (células dendríticas e macrófagos) também são capazes de direcionar a troca de isotipo, ainda mais quando acompanhada da coestimulação, por sinais de TLRs, por exemplo. Essas células mieloides são capazes de secretar BAFF e APRIL, que podem ser reconhecidas pelas células B pelos receptores de BAFF, chamados TACI, ocasionado a síntese de AID. Além disso, o TGF-Beta secretado por várias celulas não linfoides ajudam a mediar a troca de anticorpo para IgA para antígenos não proteicos. Proteção Mediada por Anticorpos T-independentes O significado prático de antígenos TI é que muitos polissacarídeos da parede célula bacteriana pertencem a essa categoria, e a imunidade humoral é o principal mecanismo para deter essas bactérias encapsuladas. Indivíduos com deficiência na imunidade humoral são muito susceptíveis a infecções fatais por essas bactérias encapsuladas, como pneumococo, meningococo e Haemophilus. Antígenos TI tb contribuem para a formação de anticorpos naturais, que estão presentes na circulação de indivíduos saudáveis e são secretados sem a exposição ostensiva a patógenos. A maior parte de anticorpos naturais são anticarboidratos de baixa afinidade e são produzidos por celulas B-1 peritoneais e por celulas da zona marginal do baço estimulados por bactérias que colonizam o trato gastrointestinal. Uma grande proporção de anticorpos naturais encontrados nos humanos é específica para lipídeos oxidados, incluindo grupos de extremidade de lipídeos, que são encontrados na membrana de bactérias e na superfície de células em apoptose, mas não são encontrados na superfície de celulas normais do hospedeiro. Há evidencias de que esses anticorpos naturais ofereçam proteção contra bactérias e facilitem a fagocitose de celulas apoptóticas. Os anticorpos dos grupos sanguíneos ABO são exemplos de anticorpos naturais, que reconhecem certos glicolipídios na superfície de varias celulas. Apesar da sua incapacidade de ativação de células T, muitas vacinas de polissacarídeos oferecem imunidade protetora de duração bastante longa, como a vacina contra pneumococo. Também pode ocorrer respostas secundarias típicas de memória, embora sem muita troca de isotipo ou maturação da afinidade por exposição secundaria a esses antígenos de carboidratos. Retroalimentação de anticorpos: regulação da resposta imunehumoral por receptores Fc LUÍS FELIPE PONSONI – MED UFOB Os anticorpos secretados inibem a continuidade da secreção de anticorpos em um mecanismo de retroalimentação negativa, em que os IgGs formam imunocomplexos com os antígenos e são reconhecidos por receptores de membrana das celulas B especifica para o antígeno. Esse receptor se chama Fcγ RIIB ou CD32, e reconhece a porção Fc de IgG conjugada com antígenos. Os complexos antígeno-anticorpo interagem simultaneamente com o receptor de antígeno (através do antígeno) e com o Fcγ RIIB (através da porção Fc) o que traz fosfatases inibitórias da cauda citoplasmática do Fcγ RIIB para perto dos receptores de antígenos (Ig de membrana/BCR), cuja sinalização é bloqueada. Existe outro receptor inibitório da produção de anticorpos chamado CD22, mas ainda não se conhece o seu ligante. A retroalimentação negativa mediada pelo anticorpo é um mecanismo fisiológico de controle das respostas imunes humorais por que é desencadeado pelo próprio anticorpo secretado e que bloqueia a produção de anticorpos. A produção de anticorpos pode ter retroalimentação positiva na sua fase inicial, em que os anticorpos IgMs são capazes de se ligar a proteínas do complemento e gerar C3d, reconhecida por CR-2 na membrana da célula B. Ao passo que a resposta ao antígeno continua, aumenta-se a produção de IgG, as quais são capazes de gerar a retroalimentação negativa quando foram imunocomplexos com o antígeno. A importância para a retroalimentação negativa é que a ausência dela é responsável pela produção descontrolada de anticorpos, o que pode aumentar a susceptibilidade de doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico.
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