Método de Western Blotting

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Método de Western Blotting
Apresentação feita por: Isadora Frois
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO
EXTRAÇÃO
FRACIONAMENTO
TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
BLOQUEIO
DETECÇÃO
CONCLUSÕES E REFERÊNCIAS
O que é? 
Teste de padrão ouro para detecção de HIV (e outros patógenos)
Detecção de proteínas
O Elisa ainda é mais utilizado (mas não é tão preciso)
1ª Southen blot (detecta DNA)
2ª Northern blot (detecta RNA)
3ª Western blot/Imunoblot (detecta proteínas utilizando anticorpos)
 INTRODUÇÃO
Para realização dos experimentos de Western Blotting é necessário, inicialmente, realizar a extração e a quantificação das proteínas. Diversos métodos espectroscópicos são utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. 
 INTRODUÇÃO
 EXTRAÇÃO
 Amostras podem ser tomadas, tanto de um tecido biológico quanto de uma cultura de células.
Glicoproteínas
 EXTRAÇÃO
EXTRAÇÃO MECÂNICA
SONIFICAÇÃO (ONDAS SONORAS)
DETERGENTES PARA FACILITAR A LISE*
 EXTRAÇÃO
AQUECIMENTO DE AMOSTRA
 FRACIONAMENTO
As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em gel.
Padrão de proteína
Pré determinada
SDS-PAGE
Corrida das
proteínas
Detergente aniônico
voltagem
 TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
Tampão de
 transferência
Nitrocelulose ou PVDF
TRANSFERÊNCIA ELETROSFORÉTICA
Tensor elétrico
Transblot semi-seco 
 TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
 TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNAS
Membrana com proteínas transferidas sem adição de corante
Com corante
 Ponceau S
 BLOQUEIO
PROTEÍNAS BLOQUEADORAS (albumina bovina ou até leite desnatado em pó).
Ocupam os espaços entre as proteínas que devem ser observadas, para que os anticorpos não se liguem. Reduz a chance de um falso positivo.
A proteína bloqueadora reveste a mancha com uma fina camada química que não se liga aos anticorpos, levando a uma menor ligação não específica pelos anticorpos.
 DETECÇÃO
INCUBAÇÃO OVERNIGHT
(até 16:00 horas)
LAVAGEM COM SOLUÇÃO TAMPÃO
Anticorpo que vem marcado
Peroxidase ou 
fosfatase
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
 *Incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada 
soro do paciente
Foto sensor 
 DETECÇÃO
Diferença
LAVAGEM COM SOLUÇÃO TAMPÃO
INCUBAÇÃO OVERNIGHT
(até 16:00 horas)
Onda específica do fluoróforo
FLUORESCÊNCIA
Imagequant G&E
 DETECÇÃO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
Odyssey licor
FLUORESCÊNCIA 
Equipamentos para detecção de anticorpos secundários marcados
Indivíduo com HIV
 DETECÇÃO
O teste de Western Blot é altamente sensível e específico
Porém, altamente custoso e demorado
 CONCLUSÃO
 Referências Bibliográficas
cursobioquimica.iq.usp.br/kfile_arquivo.php?id=776 Acesso em: 20/11/2018
Abbas, Abul K.; LICHTMAN, Andrew H.; PILLAI, Shiv.. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !
E-mail: isaobf@hotmail.com