MDA-aminoacidos-separacao

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MATERIAL DE APOIO DIDÁTICO – BIOQUÍMICA I – PROF. GUSTAVO – 20 13 
A M I N O Á C I D O S: Métodos de separação
I. Introdução
Os 20 aminoácidos “primários” são os constituintes fundamentais de
proteínas. As ligações peptídicas (amidas) entre alfa-aminoácidos constituem
todas as estruturas de proteínas achadas na natureza, e os aminoácidos isola-
dos de proteínas têm todos características estruturais comuns. A fórmula ge-
ral de um aminoácido é:
onde reconhecemos um grupo α-amina e um α-carboxila, ambos ligados a um
carbono, denominado carbono alfa. Os demais substituintes são um hidrogênio
e um grupo “R”, denominado “cadeia lateral”. Essa estrutura se aplica a 19
dos 20 aminoácidos, com exceção da Prolina, que é um Iminoácido.
As diferenças observadas entre os aminoácidos são resultado do grupo
R, a cadeia lateral. Os 20 aminoácidos que constituem proteínas diferem na
cadeia lateral, que pode ser hidrofóbica ou polar, aromática ou alifática, car-
regada ou não carregada. A variabilidade de grupos R confere aos aminoáci-
dos diferentes polaridades, solubilidades e comportamento cromatográfico. 
A estrutura e função biológica de uma proteína depende da sua composi-
ção de aminoácidos. É essencial entendermos os métodos práticos usados
para a separação e identificação dos 20 aminoácidos.
II. Propriedades ácido-básicas dos aminoácidos
Os aminoácidos são ANFÓLITOS, ANFIPRÓTICOS ou ANFIPÁTICOS,
porque contêm (pelo menos) um grupo ácido e um básico. O grupo COOH é
ácido, com um pKa em torno de 2,3. Assim, em valores de pH mais ácidos do
que o pKa, o grupo se encontra protonado (COOH), e acima desprotonado
(COO-). Já o grupo amino (NH2) é básico, com pKa entre 9 e 10, de forma tal
que em pH abaixo do pKa se encontra protonado (NH3+) e acima desprotona-
do, como NH2. Lembre, ainda, que algumas cadeias laterais têm grupos ionizá-
veis, e seu pK é denominado pKR ou pK3.
De uma forma geral, reforçando o que vimos acima:
pH < pKa: a maioria das moléculas possui o grupo protonado
pH = pKa: apenas 50% das moléculas têm o grupo protonado
pH > pKa: a maioria das moléculas possui o grupo desprotonado
Em pH neutro ambos os grupos ligados ao carbono alfa (carboxila e ami-
na) se encontram ionizados e o aminoácido existe em uma forma dipolar sem
carga líquida (se não tiver grupos ionizáveis na cadeia lateral), forma denomi-
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nada ZWITTERION1 (ÍON HÍBRIDO). O pH no qual os aminoácidos se encon-
tram nessa forma é chamado de ponto ou pH isoelétrico ou isoiônico (pI).
Para aminoácidos sem cadeia lateral ionizável: pI= ½ (pK1+pK2)
Para aminoácidos ácidos (Asp, Glu): pI = ½ (pK1 + pKR)
Para aminoácidos básicos (Lys, Arg, His): pI = ½ (pK2 + pKR)
Lembrete: pK1, pK2 e pKR são os valores de pKa dos grupos α-carboxílico,
α-amina e cadeia lateral, respectivamente.
A relação entre o pH e o pI do aminoácido dita a condição na qual ele se
encontra, em termos de carga elétrica (veja a figura abaixo):
Ou seja, 
se o pH>pI, a carga líquida será negativa: Aá (-), 
se o pH=pI a carga líquida será nula: Aá (0), e 
se o pH<pI, a carga líquida será positiva: Aá (+). 
Isso é importante para você entender os procedimentos de isolamento
de aminoácidos baseados na carga: cromatografia de troca iônica e
eletroforese.
1 Pronuncia-se “tsvitaion”.
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III.CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA de aminoácidos: separa pela
carga
Existem diferentes tipos de resinas de troca iônica: 
(a) trocadoras de cátions
(b) trocadoras de ânions
Os grupos mostrados acima são ligados covalentemente a um polímero
(em geral denominado resina), e oferecidos na forma de minúsculos grãos es-
féricos. A resina é misturada a um tampão que será usado também para dis-
solver os aminoácidos a serem separados. Lembre: o pH do tampão vai ditar o
comportamento dos aminoácidos, ou seja, terem carga líquida (- ou +) ou ne-
nhuma. A mistura da resina e o tampão é colocada em uma coluna cromato-
gráfica, um cilindro de vidro com duas extremidades ajustáveis.
Agora vamos supor que temos uma mistura de três aminoácidos: um áci-
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do (Aspartato), um polar (Serina) e um básico (Lisina), e aplicamos a solução à
coluna antes citada, em pH neutro. Veja a seguir o que aconteceria, na figura
abaixo. Observe que é representado um grão da resina, com os grupos fixos
carregados negativamente (SO3-), neste exemplo. Ou seja, temos uma resina
“trocadora de cátions”. Observe, na figura, que de fato existe um “contra-íon”
sódio interagindo eletrostaticamente com a resina. Ao adicionarmos a mistura,
a Lys, com carga positiva, desloca o Na+. Ou seja, há uma “troca de íons”, daí
o nome da metodologia.
Figura: Operação de uma coluna de troca iônica para a separação dos aminoácidos Asp, Ser e Lys
(aspartato, serina e lisina):
A carga líquida negativa do Asp faz com que aconteça repulsão eletros-
tática com a carga fixa SO3- da resina, por isso esse aminoácido sai primeiro
da coluna. A Ser não sofre repulsão nem interage favoravelmente, daí termos
ela em segundo lugar na eluição (saída) da coluna. Por último vai sair a Lys,
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que tem carga favorável para ser adsorvida à resina.
Figura: Separação de aminoácidos em uma coluna de troca iônica
Para eluir as espécies químicas adsorvidas à resina, podemos aumentar
a concentração de sal, técnica que funciona para qualquer tipo de resina. Se
optarmos por variar o pH, no caso das resinas de troca aniônica devemos di-
minuir o pH, e no caso das resinas de troca catiônica, aumentar o pH. Sempre
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a variação do pH deve procurar enfraquecer a carga do aminoácido retido, de
tal maneira que ele possa ser eluído.
IV.ELETROFORESE de aminoácidos: separa pela carga
A eletroforese é um método de separação baseado no movimento de íons
sob influência de um campo elétrico. Essa metodologia é usada principalmen-
te para a separação de aminoácidos, peptídios e proteínas de acordo com sua
carga. Todos os aminoácidos têm grupos ionizáveis que os tornam polieletróli-
tos, capazes de migrar em um campo elétrico. Os aminoácidos com carga lí-
quida positiva migrarão para o polo negativo (cátodo), os que têm carga nega-
tiva para o polo positivo (ânodo). 
Um suporte inerte, tal como papel, acetato de celulose ou um gel, é usa-
do como suporte para o líquido (tampão).
Figura: separação de Lisina, Alanina e Aspartato por eletroforese, em pH 6,0. 
Para entender o que acontece acima, calcule o pI de cada aminoácido: 
pILys=1/2 (8,95+10,53)=9,74 ~9,7
pIAla=1/2 (2,36+9,69)=6,03 ~6,0
pIAsp=1/2(2,09+3,86)=2,98 ~3,0
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Ou seja, em pH 6,0 a Lisina terá carga líquida positiva, a Alanina estará
no seu pI e o Aspartato terá carga líquida negativa.Isso fará com que a Lisina
migre para o cátodo (pólo -), a Alanina permaneça no local de aplicação, e o
Aspartato migre para o ânodo (pólo +).
Em adição aos métodos de separação por carga vistos acima, vamos dar
uma olhada em uma metodologia antiga, que se baseia na polaridade do ami-
noácido:
V. CROMATOGRAFIA EM PAPEL de aminoácidos: separa pela 
polaridade
A cromatografia em papel pode separar diferentes aminoácidos com
base nas suas solubilidades em dois solventes diferentes. Neste método, uma
amostra de aminoácidos (puros e/ou em mistura) é aplicada em um pequeno
ponto próximo à margem inferior de um papel cromatográfico. O extremo infe-
rior é então colocado em contato com um pequeno volume de uma mistura de
solventes em uma “cuba cromatográfica”. 
Figura: Cuba cromatográfica usada para a cromatografia em papel
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A fase móvel contém vários componentes, um dos quais é usualmente a
água, e outros, entre os quais um é um solvente apolar. Na medida em que a
fase móvel ascende pelo papel por capilaridade, a água na mistura se liga ao
papel (celulose) e cria uma fase estacionária. O solvente não polar continua
a se movimentar, formando uma fase móvel. 
Na medida em que os aminoácidos têm diferentes cadeias laterais, tam-
bém têm diferentes graus de solubilidade na água em relação ao solvente apo-
lar. Um aminoácido com um R polar será mais solúvel na água do que no sol-
vente apolar, se dissolvendo na fase estacionária. Dessa forma, terá uma me-
nor migração ao longo do papel. O contrário acontece com um aminoácido
com R apolar, migrando mais.
Dependendo da sua solubilidade relativa na água e no solvente apolar,
cada aminoácido migra de forma diferente, permitindo a separação de uma
mistura.
O movimento dos aminoácidos pode ser definido por um valor conhecido
como valor Rf, que mede o deslocamento de um aminoácido em relação ao sol-
vente. No início da cromatografia, o aminoácido é aplicado em um ponto cha-
mado de origem. A cromatografia é feita a seguir, e é detida antes do solvente
atingir o extremo superior do papel. O nível atingido pelo solvente é chamado
de frente do solvente. O valor Rf de um aminoácido é a relação entre a distân-
cia percorrida por ele desde a origem, em relação à distância percorrida pelo
solvente desde a origem.
Uma vez que o valor Rf de um aminoácido é constante para uma dada
condição cromatográfica, um aminoácido desconhecido pode ser identificado
pela comparação do seu Rf com o de aminoácidos conhecidos (padrões).
Alguns aspectos técnicos são importantes em relação à cromatografia
em papel:
1. Primeiro, é necessário fazer a aplicação do aminoácido em um ponto bem
pequeno. A banda tende a se espalhar quando sobe pelo papel, em razão do
que se não tiver cuidado, vai produzir um borrão que tornará difícil de esti-
mar o Rf.
2. Segundo: o papel cromatográfico deve se manter limpo; impressões digitais
e outros tipos de contaminação interferem com a cromatografia e produzem
resultados ruins. 
3. Por último, uma vez que os aminoácidos não têm cor, deve ser feita a reve-
lação por algum método que permita obter uma coloração. O método mais
comum é fazer a reação da ninidrina, o que é feito aplicando um “spray” de
uma solução do reagente sobre o papel. Quando aquecida, a ninidrina pro-
duz uma cor roxa de Ruherman (amarela no caso da Prolina e hidróxi-Proli-
na), tornando os aminoácidos visíveis para análise.
(veja as reações na próxima página):
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Figura abaixo: reações da Ninidrina com um aminoácido (produto de cor roxa)
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Figura a cima : reações da Ninidrina com a Prolina (produto de cor amarela) 
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