Técnicas de Análise de Células e Tecidos

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Técnica Básicas para 
Análises de Células e 
Tecidos
Algumas grandezas...
1km  1.000m
1m  100 cm 
1cm  10 mm
1mm  1000 m
1 m  1000 nm
1Å (Angstron)  10-10m
Visão panorâmica da célula
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Visão panorâmica da célula
Aumento e Poder de Resolução
Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam
como objetos separados.
O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 m
Visão panorâmica 
da célula
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Desenvolvimento da Microscopia
-Microscópio Óptico (luz)
-Microscópio Eletrônico (elétrons)
Microscópio óptico – utiliza feixes de luz
Desenvolvimento da Microscopia
Sistemas de lentes (condensador, objetiva e
ocular)
O limite de resolução do MO é de 0,2 m e
depende essencialmente da objetiva.
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Microscópio óptico
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de campo claro
Desenvolvimento da Microscopia
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Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
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Microscópio óptico confocal
Desenvolvimento da Microscopia
Outros tipos de microscópios ópticos
Desenvolvimento da Microscopia
Iluminação direta (sem coloração)
Contraste de fase (refração da luz)
Contraste diferencial de interferência (refração
da luz)
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Microscópio eletrônico
-utiliza feixes de elétrons
-lentes eletromagnéticas
Desenvolvimento da Microscopia
Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.
Material biológico é impregnado com metais pesados 
como ósmio, chumbo e urânio
Microscópio eletrônico de transmissão: 
Desenvolvimento da Microscopia
Estrutura e funcionamento
Alta resolução
Necessita de cortes muito finos 
(0,02 a 0,1 m)
Material biológico é impregnado 
com metais pesados como ósmio, 
chumbo e urânio
 Imagem elétron-densa (escura) e 
elétron-lúcida (clara)
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Microscópio eletrônico de transmissão
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
Alta resolução
 Fragmentos maiores ou tecidos inteiros
Material biológico é recoberto com metais 
como ouro ou platina
Estrutura tridimensional (3D)
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Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Microscópio eletrônico de
varredura
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Centro de Microscopia 
Eletrônica
UNESP - Botucatu
MEV
MET
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Preparação de material para 
análise ao microscópio
As células e tecidos precisam estar perfeitamente 
preservados, apresentando a mesma estrutura e 
composição química que possuíam quando vivas. 
Preparação de material para análise ao microscópio
Fixação – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado 
Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos 
especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio. 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Lavagem
Preparação de material para análise ao microscópio
Desidratação –Retirada da água presente nos tecidos através de 
sucessivos banhos em uma série de etanol (70%80%90%100%). 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Diafanização ou clareamento–Substituição do etanol por líquido miscível 
(geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios. 
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de impregnação –Substituição do líquido 
(xilol) por parafina ou resina sintética. A resina 
sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 m). O 
ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 m) 
e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso 
os cortes são feitos com navalhas de vidro ou 
diamante. 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de inclusão –Suporte para o tecido impregnado. 
Preparação de material para análise ao microscópio
Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico
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Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura). 
Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo automatizado –Permite a obtenção rápida de cortes sem 
passar pelas etapas descritas antes. 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo
Realizando cortes do material 
Preparação de material para análise ao microscópio
Micrótomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura). 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Estufa 60 oC
Derreter e eliminar a parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
Xilol
Retirada da parafina 
Série alcoólica - Rehidratação. 
Hidratação completa 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Coloração 
Preparação de material para análise ao microscópio
Hematoxilina/Eosina (HE)
Coloração freqüentemente utilizada
Coloração –A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.
Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.
Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.
Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros 
tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro. 
Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...
Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...
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Preparação de material para análise ao microscópio
Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados 
em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre 
outras, também podem ser empregados.
...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia
Celular e Molecular
: Radioautografia
: Imunocitoquímica
: Cromatografia
: Eletroforese
: Cristalografia e difração de raio-X
: Hibridação de ácidos nucléicos
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Preparação de material para análise ao microscópio
Montagem das lâminas 
Preparação de material para análise ao microscópio
Análise do Material 
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Preparação de material para análise ao microscópio
Resultados 
Plano de corte