Aula 05 – Replicação do DNA (1)

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AULA 05 – REPLICAÇÃO DO DNA Profa. Jéssica Badolato
2018.2
REPLICAÇÃO DO DNA
• Quando a dupla-hélice do DNA foi descoberta, a característica que mais
surpreendeu os pesquisadores foi a relação de complementaridade entre as
bases nas suas cadeias polinucleotídicas entrelaçadas.
• Como inicia a replicação do DNA?
• Como são separadas as fitas entrelaçadas do DNA para que possam ser usadas
como molde?
• O que regula a extensão de replicação para que as células-filhas não acumulem
nem percam cromossomos?
REPLICAÇÃO DO DNA
• A replicação é um processo complexo e de múltiplas etapas que envolve muitas
enzimas.
• A replicação dos cromossomos eucarióticos, lineares e mais extensos é ainda mais
complexa.
• Esses cromossomos necessitam de diversos sítios de inicio de replicação para
sintetizar todo o cromossomo de forma ordenada e o início da replicação deve
ser cuidadosamente coordenado para garantir que todas as sequências sejam
replicadas exatamente uma vez.
REPLICAÇÃO DO DNA
• Para a síntese de DNA é necessário dois substratos fundamentais. Primeiro,
uma nova síntese necessita dos quatro desoxinucleosídeos trifosfatos -
dGTP, dCTP, dATP e dTTP.
• O segundo substrato essencial para a síntese de DNA é um arranjo
particular de DNA fita simples e DNA dupla-fita chamado junção
iniciador:molde.
REPLICAÇÃO DO DNA
• Como o nome sugere, a junção iniciador:molde possui dois componentes
principais. O molde fornece o DNA fita simples que dirige a adição de
cada desoxinucleotídeo complementar. O iniciador é um segmento curto
de DNA complementar ao molde.
INICIADOR E FITA MOLDE
REPLICAÇÃO DO DNA
• As bases químicas da síntese de DNA permitem que a extensão da nova
cadeia ocorra apenas pela extremidade 3' do iniciador. Essa é uma
característica das sínteses de DNA e RNA.
REPLICAÇÃO DO DNA
• A fita molde orienta qual dos quatro nucleosídeos será adicionado. O
nucleosídeo que realizar o pareamento de bases com a fita-molde é
altamente favorecido para ser adicionado à fita do iniciador.
• Deve-se ter em mente que as duas fitas da dupla-hélice apresentam
orientação antiparalela. Essa disposição significa que a fita-molde para a
síntese de DNA tem orientação oposta à fita de DNA que está sendo
sintetizada.
REPLICAÇÃO DO DNA
• A síntese de DNA é catalisada por uma classe de enzimas chamada DNA-
polimerase.
• A DNA-polimerase utiliza um único sítio ativo para catalisar a adição de
qualquer um dos 4 nucleosídeos, isso porque ela explora as geometrias
praticamente idênticas dos pares A:T e G:C.
• Em vez de detectar o nucleotídeo exato que entra no sitio ativo, a DNA
polimerase monitora a capacidade do nucleotídeo a ser incorporado formar um
par de bases A:T ou G:C.
REPLICAÇÃO DO DNA
• Diferentes estudos revelaram que o substrato de DNA se encaixa em uma
grande fenda que se assemelha a uma mão direita parcialmente fechada.
Com base nessa analogia, os três domínios da polimerase são chamados
de polegar, dedos e palma.
REPLICAÇÃO DO DNA
• O domínio da palma verifica a precisão do pareamento entre os
nucleotídeos recém adicionados.
• O polegar tem como objetivo manter a posição correta do iniciador e do
sitio ativo e auxiliar na manutenção da forte associação entre a DNA-
polimerase e seu substrato.
REPLICAÇÃO DO DNA
• O nucleotídeo a ser incorporado pareia com a próxima base disponível
do molde. Essa interação faz os dedos da polimerase se fecharem em
torno do nucleotídeo pareado. Essa conformação da enzima favorece a
formação da próxima ligação fosfodiester.
• A ligação do nucleotídeo pareado ao iniciador leva à reabertura dos
dedos e à movimentação da junção iniciador:molde em um par de bases.
A polimerase está, então, pronta para o próximo ciclo de adição.
REPLICAÇÃO DO DNA
• Um sistema baseado apenas na geometria do pareamento de bases e na
complementaridade entre as bases é incapaz de alcançar o extraordinário nível
de precisão observado na síntese de DNA de uma célula.
• A remoção dos nucleotídeos mal pareados é mediada por um tipo de nuclease
chamada de exonuclease de revisão de leitura, essas enzimas degradam o DNA
a partir da uma extremidade 3' (extremidade crescente de uma nova fita de
DNA).
REPLICAÇÃO DO DNA
• As nucleases capazes de degradar o DNA apenas a partir de uma
extremidade são chamadas exonuclease.
• As nucleases capazes de clivar no meio de uma fita de DNA são
chamadas endonucleases.
REPLICAÇÃO DO DNA
• A exonuclease fornece ao DNA recém sintetizado uma revisão de leitura e
à DNA polimerase uma segunda chance para adicionar um nucleotídeo
correto.
REPLICAÇÃO DO DNA
• Na célula, ambas as fitas da dupla-fita de DNA são replicadas ao mesmo
tempo.
• Isso requer a separação das duas fitas da dupla-hélice, formando dois
moldes de DNA.
• A junção entre as duas fitas-moldes recém-separadas e o duplex de DNA
não replicado é conhecida como forquilha de replicação.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• A forquilha de replicação desloca-se continuamente em direção à região
de fita dupla não replicada do DNA, deixando em seu trajeto dois moldes
de fita simples de DNA, que coordenam, cada um, a síntese de uma fita
de DNA complementar.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• A natureza antiparalela do DNA é uma dificuldade à replicação
simultânea dos dois moldes expostos pela forquilha de replicação. Como o
DNA é sintetizado apenas pelo alongamento da extremidade 3', apenas
um dos moldes expostos pode ser replicado de forma continua à medida
que a forquilha de replicação se movimenta.
• Sobre essa fita-molde, a polimerase simplesmente segue a forquilha de
replicação. A fita originada por esse molde é chamada de fita líder.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• A síntese de nova fita de DNA coordenada pelo outro molde de fita
simples de DNA é mais problemática.
• Esse molde faz a DNA-polimerase se deslocar em direção oposta a
forquilha de replicação.
• A fita de DNA sintetizada a partir desse molde é chamada de fita tardia.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• A síntese da fita tardia precisa esperar o deslocamento da forquilha de
replicação exponha uma extensão considerável do molde antes que este
possa ser replicado.
• Cada vez que a extensão considerável do molde para uma nova fita
tardia é exposta, a síntese de DNA é iniciada e continua até que ela
alcance a extremidade 5" de uma região recém sintetizada de DNA da
fita tardia.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• Os pequenos fragmentos de DNA recem sintetizados, formados na fita
tardia, são chamados fragmentos de Okazaki.
• Logo após a sua síntese, os fragmentos são covalentemente ligados,
produzindo uma nova fita de DNA continua e intacta.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• Embora a fita líder e tardia necessitem da primase para iniciar a síntese
de DNA, a frequência de funcionamento da primase sobre as duas fitas é
bastante diferente.
• Cada fita líder necessita apenas de um único iniciador. Em contrapartida,
a síntese descontinua da fita tardia requer a síntese de um novo iniciador
para cada fragmento de Okazaki.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• A DNA-helicase desenrola o DNA na forquilha de replicação, criando um molde de fita
simples DNA onde a primase pode atuar.
• Para completar a replicação do DNA, os iniciadores devem ser removidos e substituidos
por DNA. Para substituir os iniciadores, uma enzima denominda RNase H reconhece e
remove a maior parte de cada iniciador. A remoção do iniciador deixa uma lacuna no
DNA dupla-fita que funciona como um substrato ideal para a DNA-polimerase. Ela
preenche essa lacuna por meio de pareamento de cada nucleotídeo, deixando uma
molécula de DNA completa exceto por umaquebra na fita reparada.
• Essa quebra no DNA é reparada por uma enzima chamada DNA-ligase.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
• Na forquilha de replicação, uma terceira classe de enzimas, chamadas
DNA-helicases, catalisa a separação das duas fitas da dupla fita de DNA.
Essas enzimas ligam-se a fita dupla e deslocam-se unidirecionalmente
sobre este, utilizando a energia do ATP para deslocar qualquer fita de
DNA que esteja anelada.
DNA POLIMERASE
• A DNA-polimerase III é a principal enzima envolvida na replicação do
cromossomo.
• A DNA-polimerase I é especializada na remoção dos iniciadores de RNA
utilizados para iniciar a síntese de DNA