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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA determinação de açúcares redutores e sacarose pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico Aluna: Marina Nunes de Abreu Profa. Dra. Virgínia Farias Alves Turma A01 Trabalho Nº2 como exigência da disciplina de Química e Bioquímica de Alimentos Goiânia, 19 de abril de 2018 REVISÃO Segundo a legislação Brasileira, “Néctar” é uma bebida não fermentada obtida por meio da diluição da parte comestível do vegetal ou de seu extrato (polpa de fruta) em água potável, podendo ser adicionados açúcares, e são bebidas destinada ao consumo direto (Brasil, 2003; BRASIL, 2009). O pêssego, cujo nome científico é Prunus pérsica (L.) Batsch, possui uma composição química, estabelecida de acordo com a Tabela de Composição dos Alimentos (TACO), de: 89,3% de umidade, 0,8% de proteínas, traços de lipídeos, 1,4% de fibra alimentar, 0,5% de cinzas, 9,3% de carboidratos e seu valor energético total é de 36 kcal (SEIXAS, 2011; TACO, 2011). Para ser usada na indústria, a fruta precisa apresentar tamanho uniforme, coloração, aroma, sabor e textura desejáveis para o consumo (BOEIRA et al., 2007). O comércio do pêssego se dá, principalmente, por sua forma em conserva, porém a fruta também é facilmente encontrada na sua forma in natura, como polpa congelada e como suco (ROSSATO, 2009). Apresenta capacidade antioxidante devido à presença de compostos fenólicos, vitamina C e compostos carotenoides (GETTENS, 2016), sendo estes últimos também responsáveis também pela pigmentação natural da fruta, que se apresenta amarelo-alaranjado, a substância predominante dos compostos carotenoides é o β-caroteno e o consumo deste está associado a um menor risco de morte prematura em consequência às doenças coronarianas (Silva et al., 2010). Os compostos fenólicos são as substâncias antioxidantes mais presentes no pêssego, sendo que o ácido clorogênico é o mais abundante, além de sua conhecida capacidade de inibição da ação dos radicais livres no organismo (DOSSIÊ ANTIOXIDANTES, 2009), sua ingestão está relacionada à redução de doenças como diabetes tipo 2 (GARAMBONE & ROSA, 2007). A vitamina C, ou ácido ascórbico, tendo em vista os benefícios do seu consumo, principalmente pelo fato de possuir atividade antioxidante, é importante que se faça a ingestão adequada desta, sendo recomendado o consumo, pela Organização Mundial de Saúde (OMS), de aproximadamente 45mg de vitamina C por dia (FAO/OMS, 2001). A Instrução Normativa n° 12 de 2003, que regulamenta os padrões de identidade e de qualidade gerais para sucos e néctares, determina que o néctar de pêssego deve apresentar um mínimo de 40g de suco ou polpa de pêssego para cada 100g do néctar, 11,0 de sólidos solúveis em °Brix a 20°C, 0,15g de ácido cítrico para cada 100g do néctar (acidez total) e 7g de açúcares totais para cada 100g do néctar, não havendo valores máximos especificados; a bebida deve apresentar, conjuntamente, cor amarelada, sabor característico e aroma próprio (BRASIL, 2003). Tendo em vista estas informações, a aula teve como objetivo realizar a determinação de açúcares redutores, sacarose e açúcares totais pelo método do ácido 3,5 – dinitrossalicílico (ADNS), presentes em uma amostra de néctar de pêssego da marca La fruit. MATERIAIS MATERIAIS APARELHAGEM Espectrofotômetro; Banho-Maria; Balança analítica. VIDRARIAS Tubos de ensaio de 25mL; Suporte de tubo de ensaio; Balão volumétrico de 250mL; Balão volumétrico de 100mL; Pipetas; Béquer; Funil. REAGENTES Solução de ácido dinitrossalicílico 1%; Solução 4,5% de NaOH; Fenol; Tartarato duplo de sódio e potássio; Ácido clorídrico concentrado; Hidróxido de sódio 6N. REATIVO DE ÁCIDO 3,5-DINITROSSALICÍLICO 1% Em 300mL de solução a 4,5% de NaOH adicionou-se 880mL de solução em 1% de ácido dinitrossalicílico e 255g de tartarato duplo de sódio e potássio. Preparou-se a seguinte solução: pesou-se 10g de fenol cristalino e adicionou-se 22mL de NaOH a 10%, completou-se o volume para 100mL. Esta solução e a de ácido dinitrossalicílico foram muito bem misturadas até que o tartarato se dissolveu bem. Fez em torno de 1500mL. Conservou-se em frasco âmbar bem fechado ao abrigo da luz em geladeira. AMOSTRA Néctar de pêssego da marca La fruit. PROCEDIMENTO Preparou-se a amostra que continha de 100 a 540 microgramas de glicose. PADRÃO DE GLICOSE Preparou-se uma solução padrão que continha de 100 a 540 microgramas de glicose. Para se preparar a solução estoque de glicose, pesou-se 54mg (0,054g) de glicose em papel de pesagem, transferiu-se para um balão volumétrico de 100mL e completou-se com água destilada. Posteriormente, retiraram-se alíquotas de 0,3; 0,5; 0,8; e 1,0mL transferindo para tubos de ensaio previamente enumerados, onde, em cada um deles, foram adicionados 2,0mL de ADNS. Finalmente, respectivamente, colocou-se 1,9; 1,7; 1,4; e 1,2mL de água destilada, deixando, assim, todos os tubos contendo um volume final de 4,2mL. Para o preparo do branco, adicionou-se em um quinto tubo de ensaio 2,2mL de água e 2,0mL de ADNS. Enfim, agitaram-se todos os tubos e os colocou em banho-maria fervente por 6 minutos, deixando-os esfriar em água fria após o tempo estabelecido para posterior leitura em espectrofotômetro regulado a 540nm. AMOSTRA SEM HIDRÓLISE pipetou-se 1mL de suco de pêssego e transferiu-se para um balão volumétrico de 100mL e completou-se com água destilada. Deste, retirou-se alíquotas de 0,3; 0,5; 0,8; e 1,0mL e transferiu-se para tubos de ensaio previamente enumerados, onde, em cada um deles, foram adicionados 2,0mL de ADNS. Finalmente, respectivamente, colocou-se 1,9; 1,7; 1,4; e 1,2mL de água destilada, deixando, assim, todos os tubos contendo um volume final de 4,2mL. Para o preparo do branco, adicionou-se em um quinto tubo de ensaio 2,2mL de água e 2,0mL de ADNS. Enfim, agitaram-se todos os tubos e os colocou em banho-maria fervente por 6 minutos, deixando-os esfriar em água fria após o tempo estabelecido para posterior leitura em espectrofotômetro regulado a 540nm. AMOSTRA COM HIDRÓLISE pipetou-se 4mL de suco de pêssego e transferiu-se para um balão volumétrico de 100mL e completou-se com água destilada. Retirou-se uma alíquota de 4mL e transferiu-se para tubo de ensaio, onde foi adicionado, em capela, 0,8mL de HCl e colocou-se em banho-maria a 60°C por 10 minutos, agitando a cada 2 minutos, para a reação de hidrólise. Em seguida, neutralizou-se com 1,6mL de NaOH 6N. Esfriou-se em água para não produzir furfural e hidroximetilfurfural (compostos escuros provenientes da degradação de açúcares). Transferiu-se para balão volumétrico de 50mL e completou-se com água destilada. Deste, retirou-se alíquotas de 0,3; 0,5; 0,8; e 1,0mL e transferiu-se para tubos de ensaio previamente enumerados, onde, em cada um deles, foram adicionados 2,0mL de ADNS. Finalmente, respectivamente, colocou-se 1,9; 1,7; 1,4; e 1,2mL de água destilada, deixando, assim, todos os tubos contendo um volume final de 4,2mL. Para o preparo do branco, adicionou-se em um quinto tubo de ensaio 2,2mL de água e 2,0mL de ADNS. Enfim, agitaram-se todos os tubos e os colocou em banho-maria fervente por 6 minutos, deixando-os esfriar em água fria após o tempo estabelecido para posterior leitura em espectrofotômetro regulado a 540nm. RESULTADOS MÉTODO MATEMÁTICO A tabela 1 mostra os valores encontrados para as absorbâncias obtidas no espectrofotômetro para o padrão de glicose e para a amostra de suco de pêssego com e sem hidrólise. Tabela1. Absorbâncias do padrão de glicose, amostra com e sem hidrólise. Tubo Alíquotas (mL) Quantidade de glicose nas alíquotas padrão (mg) Absorbâncias do padrão Absorbâncias da amostra sem hidrólise Absorbâncias da amostra com hidrólise 1 0,3 0,162 0,181 0,062 0,085 2 0,5 0,270 0,457 0,218 0,240 3 0,8 0,432 1,054 0,517 0,573 4 1,0 0,540 1,458 0,804 0,859 CÁLCULODA CONCENTRAÇÃO DA SOLUÇÃO PADRÃO Para calcular a concentração de glicose utiliza-se uma regra de três simples. Considera-se a massa de glicose sendo 54mg. Tubo 1 (0,3mL): Tubo 2 (0,5mL): Tubo 3 (0,8mL): Tubo 4 (1,0mL): Tabela 2. Concentração e absorbância da solução padrão de glicose. Tubo Alíquotas (mL) Concentração (mg/alíquota) Absorbâncias do padrão 1 0,3 0,162 0,181 2 0,5 0,270 0,457 3 0,8 0,432 1,054 4 1,0 0,540 1,458 CÁLCULO DA INCLINAÇÃO DA RETA (K) Para efetuar os cálculos referentes à inclinação da reta (K), procedeu-se da seguinte forma: Onde: K = inclinação da reta [ ] calculada = concentração de açúcar nos diferentes tubos de ensaio Abs = absorbância obtida pela análise em espectrofotômetro do padrão de glicose Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: CÁLCULO DO K MÉDIO Para o cálculo do K médio fez a média aritmética dos valores de K de cada alíquota. CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO REAL A concentração real de cada alíquota foi determinada conforme a seguinte equação: Onde: [ ] real = concentração = média dos Ks Abs = absorbância Alíquota 0,3mL: Alíquota 0,5mL: Alíquota 0,8mL: Alíquota 1,0mL: Tabela 3. Concentração real do padrão de glicose. Tubo Alíquota (mL) Absorbância Concentração calculada K Concentração real 1 0,3 0,181 0,162 0,895 0,102 2 0,5 0,457 0,270 0,591 0,259 3 0,8 1,054 0,432 0,410 0,597 4 1,0 1,458 0,540 0,370 0,826 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PRESENTE NAS AMOSTRAS SEM HIDRÓLISE Tabela 4. Absorção do padrão de glicose e da amostra sem hidrólise. Tubo Alíquota (mL) Absorbância do padrão Absorbância da amostra sem hidrólise 1 0,3 0,181 0,062 2 0,5 0,457 0,218 3 0,8 1,054 0,517 4 1,0 1,458 0,804 A concentração de açúcares foi calculada segundo o melhor ponto, o cálculo que segue demonstrado abaixo para a alíquota de 1,0mL da amostra sem hidrólise por possuir a absorbância próxima do valor médio da absorbância do padrão de glicose. A densidade da água é a mesma do que a da amostra, ou seja, 1mL equivale a 1g: Utilizou-se a fórmula abaixo para calcular a concentração de açúcar redutor: Onde: [ ]açúcares = porcentagem de açúcares redutores em cada tubo; = média das inclinações da reta; Abs = absorbância da amostra sem hidrólise; Te = Concentração da amostra proveniente de cada diluição. A concentração de açúcares redutores da alíquota de 1,0mL da amostra sem hidrólise foi de 4,55%. Tabela 5. Resultados obtidos para a amostra sem hidrólise. Tubo Alíquota (mL) Absorbância do padrão Absorbância da amostra sem hidrólise K médio Te (mg) [ ] açúcares redutores 4 1,0 1,458 0,804 0,5665 10 4,55 DETERMINAÇÃO DA AMOSTRA COM HIDRÓLISE, CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES E T.E. Tabela 6. Absorção do padrão de glicose e da amostra com hidrólise. Tubo Alíquota (mL) Absorbância do padrão Absorbância da amostra com hidrólise 1 0,3 0,181 0,085 2 0,5 0,457 0,240 3 0,8 1,054 0,573 4 1,0 1,458 0,859 A concentração de açúcares foi calculada segundo o melhor ponto, o cálculo que segue demonstrado abaixo para a alíquota de 1,0mL da amostra com hidrólise por possuir a absorbância próxima do valor médio da absorbância do padrão de glicose. A densidade da água é a mesma do que a da amostra, ou seja, 1mL equivale a 1g: Após a primeira diluição, houve uma segunda, da seguinte forma: Utilizou-se a mesma fórmula utilizada para calcular a concentração de açúcar redutor: A concentração de açúcares redutores da alíquota de 1,0mL da amostra com hidrólise foi de 15,21%. Tabela 7. Resultados obtidos para a amostra com hidrólise. Tubo Alíquota (mL) Absorbância do padrão Absorbância da amostra com hidrólise K médio Te (mg) [ ] açúcares redutores 4 1,0 1,458 0,859 0,5665 3,2 15,21 CÁLCULO DA PORCENTAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES, TOTAIS E SACAROSE Tabela 8. [ ] açúcares sem e com hidrólise das alíquotas localizadas na região central da curva padrão. [ ] açúcares sem hidrólise para alíquota de 1,0mL 4,55% [ ] açúcares com hidrólise para alíquota de 1,0mL 15,21% Cálculo açúcares redutores: % redutores = % sem hidrólise = 4,55% %sacarose = (% com hidrólise - % sem hidrólise) x 0,95 %sacarose = (15,21 – 4,55) x 0,95 %sacarose = 10,66 x 0,95 = 10,13% % totais = %sacarose + % sem hidrólise %totais = 10,13 + 4,55 = 14,68% Tabela 9. % de sacarose e de açúcares totais. % de sacarose 10,13% % açúcares totais 14,68% MÉTODO DE EXCEL TABELA DA CONCENTRAÇÃO E ABSORBÂNCIA DA SOLUÇÃO PADRÃO Tabela 10. Concentração e absorbância. Tubo Alíquotas (mL) Concentração (mg/alíquota) Absorbâncias do padrão 1 0,3 0,162 0,181 2 0,5 0,270 0,457 3 0,8 0,432 1,054 4 1,0 0,540 1,458 GRÁFICO DA CURVA PADRÃO DE GLICOSE Figura 1. Gráfico da concentração do padrão de glicose versus absorbância. A equação da reta obtida foi: Sendo: y = absorbância; x = concentração (mg). Logo, y = 3,4259x – 0,415. CÁLCULO DA AMOSTRA SEM HIDRÓLISE Para a realização deste cálculo, escolheu-se o ponto em que se localizava na região mais próxima da central do gráfico da curva padrão. Os valores escolhidos foram: alíquotas de 1,0mL e absorbância de 0,804: Assim, temos 0,356mg ou 0,000356g de glicose. Logo: CÁLCULO DA AMOSTRA COM HIDRÓLISE Para a realização deste cálculo, escolheu-se o ponto em que se localizava na região mais próxima da central do gráfico da curva padrão. Os valores escolhidos foram: alíquotas de 1,0mL e absorbância de 0,859: Assim, temos 0,372mg ou 0,000372g de glicose. Logo: CÁLCULO DA PORCENTAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES, TOTAIS E SACAROSE % sem hidrólise = 3,56% % com hidrólise = 11,62% Para o cálculo de açúcares redutores, utiliza-se a fórmula: % redutores = % sem hidrólise = 3,56% Para o cálculo de sacarose, utiliza-se a fórmula: %sacarose = (% com hidrólise - % sem hidrólise) x 0,95 %sacarose = (11,62 – 3,56) x 0,95 %sacarose = 8,06 x 0,95 = 7,66% Para o cálculo de açúcares totais (AT), utiliza-se a fórmula: AT = %sacarose + % sem hidrólise AT = 7,66 + 3,56 = 11,22% COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS UTILIZADOS, MATEMÁTICO E EXCEL Tabela 11. Tabela comparativa entre os métodos matemático e excel. % de açúcares Método matemático Métodoexcel Açúcares redutores (sem hidrólise) 4,55 3,56 Com hidrólise 15,21 11,62 Sacarose 10,13 7,66 Açúcares totais 14,68 11,22 DISCUSSÃO A determinação de açúcares redutores e açúcares redutores totais em alimentos são realizados através de diversos métodos químicos não seletivos, estes fornecem resultados confiáveis, quando utilizados corretamente, devendo-se tomar o cuidado de eliminar os interferentes (Silva, 2003). O método do ácido 3,5 – dinitrossalicílico (ADNS) é um método colorimétrico, em que o ADNS na presença de glicose ou frutose se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, apresentando-se detectável por espectrofotometria a 540nm (SILVA et al, 2003; DEONTI; SANTOS e ALVES JÚNIOR, 2013). Conforme representado na figura a seguir: Figura 2. O ácido 3,5 - dinitrosalicílico é reduzido pelo açúcar redutor em meio alcalino a 3-amino-5-nitrosalicílico e ácido aldônico. A leitura do padrão de glicose encontrada, R = 0,9973, encontra-se dentro dos valores referenciais que determinam que o valor de R deve ser maior que 0,995. Conforme explicado na metodologia, foi realizada uma hidrólise ácida para que ocorresse a hidrólise da sacarose, para isso, foi utilizado o ácido clorídrico concentrado, porém após a finalização do processo os tubos foram esfriados, com auxílio de água, de modo a evitar a formação de furfural e hidroximetilfurfural, que são compostos escuros provenientes da degradação de açúcares, que se produzidos na amostra iriam interferir na leitura das absorbâncias, prejudicando, assim, os resultados da concentração de açúcares (BORGES; PARAZZI e PIEDADE, 1987). Foram realizados dois métodos (matemático e pelo Excel) para a determinação de açúcares redutores, sacarose e açúcares totais em uma amostra de néctar de pêssego. Os resultados encontrados foram relativamente próximos, sendo que o método do Excel apresentou valores menores que pelo método matemático, porém devido ao fato de o método do Excel ser mais sensível, por apresentar menos etapas e envolver um menor contato humano na realização dos cálculos, é um método de maior confiabilidade, dado que o ser humano é mais passível de erros. A instrução normativa n° 12 de 2003, preconiza que o néctar de pêssego deve apresentar no mínimo 7g de açúcares totais para cada 100g do néctar, assim, os valores encontrados na aula prática (média entre os métodos de 12,95% de açúcares totais) mostram que a amostra apresentou quantidade de açúcares totais dentro dos padrões estabelecidos. CONCLUSÃO O método do ADNS é de relativamente fácil execução, porém de complexa realização de cálculos a fim de se obter os resultados. Os resultados das diferentes metodologias utilizadas foram próximos e satisfatórios. Durante a aula prática foi dito e está escrito no roteiro que a amostra seria de suco de pêssego, porém, na análise foi utilizado néctar de pêssego, esta mistura gerou dúvidas e deixou a redação deste relatório mais confusa. A professora foi de bastante ajuda explicando mais de uma vez como deveriam ser feitos os cálculos, facilitando o entendimento desta parte. REFERÊNCIA BOEIRA, J.B; STRINGARI, G.B; LAURINDO, J.B. Estudo da desidratação de pêssegos por tratamento osmótico e secagem. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, v. 25, n. 1, p. 77-90, jan.- jun. 2007. BORGES, M.T.M.R.; PARAZZI, C.; PIEDADE, S.M.D.S. Avaliação de Métodos Químicos de Determinação de Açúcares Redutores em Xaropes. Anais do 4° Congresso Nacional de STAB VII Convençaõ da ACTALAC. Olinda – PE, 1987. BRASIL. Decreto n. 6871, de 04 de junho de 2009. Regulamenta a lei no 8.918, de 14 de julho de 1994 que dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a inspeção, a produção e a fiscalização de bebidas. Diário Oficial da União, Brasília, 04 jun. 2009. BRASIL. Instrução Normativa n.12, de 4 de setembro de 2003. Aprova o Regulamento Técnico para Fixação dos Padrões de Identidade e Qualidade Gerais para Suco Tropical; os Padrões de Identidade e Qualidade dos Sucos Tropicais de Abacaxi, Acerola, Cajá, Caju, Goiaba, Graviola, Mamão, Manga, Mangaba, Maracujá e Pitanga; e os Padrões de Identidade e Qualidade dos Néctares de Abacaxi, Acerola, Cajá, Caju, Goiaba, Graviola, Mamão, Manga, Maracujá, Pêssego e Pitanga. 2003. DEOTI, J. R.; SANTOS, A.A.; ALVES JUNIOR, S. L. Nova metodologia de dosagem de açúcares redutores confere maior velocidade à análise de parâmetros de processos fermentativos. Anais do 3º SEPE e 3º Jornada de Iniciação Científica, vol. 3, 2013. DOSSIÊ ANTIOXIDANTES. Revista Food Ingredientes Brasil, n° 6, 2009. FAO/OMS. Human Vitamin and Mineral Requirements. In: Report 7ª Joint FAO/OMS Expert Consultation. Bangkok, Thailand, 2001. GARAMBONE, E.; ROSA, G. Possíveis benefícios do ácido clorogênico à saúde. Alimentos e Nutrição, v.18, n.2, p. 229-235, abr.- jun. 2007. GETTENS, Cristina Soares. Propriedades funcionais, nutricionais e atividade antimicrobiana de subprodutos agroindustriais de pêssego e sua aplicação em cookies. Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Pelotas, 2016. ROSSATO, Simone Bertazzo. Potencial antioxidante e compostos fenólicos de pêssego (Prunus persica L. Batsch). 2009. 61f. Tese (Doutorado em ciências farmacêuticas)- Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do sul, Porto Alegre, 2009. SEIXAS, Rita Helena Moraes. Avaliação da Qualidade de Pêssego em Calda de Marcas Nacionais “Tipo Especial” e Importadas, das safras 1999/2000 e 2010/2011. 2011. 112 f. Dissertação (Mestrado em ciência e Tecnologia Agroindustrial)- Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2011. SILVA, M.L.C; COSTA, R.S.; DOS SANTOS SANTANA, A; KOBLITZ, M.G.B.Compostos fenólicos, carotenóides e atividade antioxidante em produtos vegetais. Semina: Ciências Agrárias, v. 31, n. 3, p. 669-682, jul.- set. 2010. SILVA, R. N.; MONTEIRO, V. N.; ALCANFOR, J. X.; ASSIS, E. M.; ASQUIERI, E. R. Comparação de métodos para a determinação de açúcares redutores e totais em mel. Ciência de Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 23, n. 3, p. 337, 2003. SILVA, R. N.; MONTEIRO, V. N.; ALCANFOR, J. X.; ASSIS, E. M.; ASQUIERI, E. R. Comparação de métodos para a determinação de açúcares redutores e totais em mel. Ciência de Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 23, n. 3, p. 337, 2003. TACO. Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (2011).
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