Expressão de Proteínas Heterólogas

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Professor: Christian Reis 
Disciplina: Biologia Molecular 
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS 
HETEROLÓGAS 
Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma 
proteína produzida em outra célula ou outro organismo. 
 
 Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição. 
Produção de proteínas recombinantes - 
heterólogas 
Para que produzir proteínas recombinantes? 
 
Pesquisa em estrutura e função de proteínas 
 
Imunização 
 
Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação 
 
Diagnóstico: Kits para detecção de doenças. 
 
Por que expressar proteínas recombinantes? 
 
 
 
Dificuldade de se purificar do tecido original 
 
Proteínas do tecido podem estar contaminadas 
 
Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas 
 
Processo completamente controlado 
 
Especificidade 
 
Quantidade 
 Como preparar um sistema recombinante? 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS 
LIGAÇÃO 
 Como preparar um sistema recombinante 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
Vetores de expressão- componentes básicos 
malE 
M13 ORI- 
Marcadores seletivos 
Origem de replicação 
Promotor 
Sítio de 
poliadenilação 
Terminador 
Sítio de ligação do 
ribossomo 
Promotor Região Codificadora Terminador 
DNA 
RNA 
PROTEÍNA 
Ribossomo 
Estrutura de um Gene Expressão de gene em 
procarioto 
10 
Operon lac 
11 
Operon é um conjunto de genes nos procariontes que se encontram funcionalmente 
relacionados, contíguos e controlados coordenadamente, sendo todos expressos em apenas um 
mRNA pela ação de único promotor. O operon lac é conjunto de genes que codificam para 
proteínas envolvidas com o metabolismo da lactose. 
Organização na forma de 
operons 
Terminador Promotor/operador Regiões Codificadoras 
OPERON 
E. coli 
RNA MENSAGEIRO 
POLICISTRÔNICO 
12 
Estrutura do Operon lac 
Operon Lac: ~6000 bp 
13 
Metabolismo da lactose 
PERMEASE 
TRANSACETILASE β-GALACTOSIDADE 
Operon lac - Enzimas 
14 A lactose induz a síntese de enzimas envolvidas no seu próprio metabolismo 
PERMEASE 
CITOPLASMA 
PERIPLASMA 
15 
Transporta lactose 
β-Galactosidase 
16 
Clivagem da lactose 
Ausência de lactose 
Presença de lactose 
Co
nt
ro
le
 n
eg
at
iv
o 
do
 O
pe
ro
n 
la
c 
17 
Características que devem ser avaliadas em cada sistema 
de expressão 
 
Taxa de crescimento celular 
Complexidade do meio de cultura 
Custo do meio de cultura 
Nível de expressão 
Capacidade de expressar extracelularmente 
Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, 
formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação 
Vantagens dos sistemas de 
expressão eucarióticos 
 - Dobramento das proteínas 
eucarióticas mais semelhante. 
- Modificações pós-traducionais. 
- Pode produzir grandes quantidades de 
proteínas com o uso de equipamentos 
próprios (fermentadores). 
Desvantagens dos sistemas de 
expressão eucarióticos 
- Sistemas caros 
- Necessitam equipamentos adequados 
- Poucos vetores disponíveis - Adequado para proteínas ricas em 
cisteínas- pontes dissulfeto. 
- Níveis de expressão mais baixos. 
Escolha do sistema - hospedeiros 
Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter 
Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis 
Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris 
Protozoários – Leishmania tarentolae 
Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma 
Células de inseto 
Células de mamífero 
Células vegetais 
Plantas transgênicas e Animais transgênicos 
 Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento 
 
 Disponibilidades de vários vetores de clonagem 
 
 Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases 
Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa 
 
SISTEMA MAIS UTILIZADO PARA EXPRESSÃO 
PROTEÍNA HETERÓLOGA 
 Como preparar um sistema recombinante 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
 Como preparar um sistema recombinante 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
Seleção Cepa Transformada 
Vetores carregam gene resistência a antibióticos 
 Manutenção 
 Pressão Seletiva 
Meio + antibiótico 
Seleção 
 
Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina, 
Gentamicina,Higromicina, kanamicina 
 
 
 
 Como preparar um sistema recombinante 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
Solubilidade proteína 
Desvantagens 
Sistema procariótico 
Não realiza modificações pós-traducionais 
- Não realiza secreção de proteínas. 
 Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias. 
Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys) 
Codon usage (uso de tRNAs) 
-Tendência a formar corpúsculos de inclusão. 
Degradação proteolítica 
 Como preparar um sistema recombinante 
 
 Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar 
 Escolher o sistema apropriado 
 Transformar hospedeiro 
 Selecionar hospedeiro transformado 
 Checar se a proteína foi expressa 
 Checar se está solúvel 
 Purificar 
 Checar se está ativa 
 Caracterizar a proteína 
PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE – 
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE 
pGEX – Glutationa S-Transferase 
 agarose-glutationa 
 
pET, pRSETA – tag de Histidinas 
 coluna de níquel 
Proteína de interesse GST 
Clivagem com fator Xa 
Sistemas de Purificação pGEX - GE 
Sistemas de Purificação pRSETA - INVITROGEN 
Proteína de interesse 6xHis 
Glutationa 
Sefarose 4B – 
Purificação GST 
Ni-NTA Agarose – 
Purificação His 
↑Eluente 
Proteína de interesse 
Resina - Glutationa Sefarose, Ni-NTA Agarose. 
PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES POR 
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE 
PURIFICAÇÃO PROTEÍNAS RECOMBINANTES 
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