ExtracaoDNARNA_Biolmol3

Prévia do material em texto

Professor:	
  Chris,an	
  Reis	
  
Disciplina:	
  Biologia	
  Molecular	
  
EXTRAÇÃO	
  DE	
  ÁCIDOS	
  
NUCLÉICOS	
  
O	
  	
  que	
  é	
  extração/purificação?	
  
A CÉLULA 
E SEU 
MATERIAL 
GENÉTICO 
ROMPIMENTO 
DAS 
MEMBRANAS 
LIBERAÇÃO 
DO 
MATERIAL 
NO MEIO 
PURIFICA
ÇÃO DO 
MATERIAL 
OBTIDO 
Quais	
  são	
  os	
  requisitos	
  essenciais	
  para	
  a	
  
obtenção	
  dos	
  ácidos	
  nucléicos?	
  	
  
	
  
•  	
  quan&dade	
  (rendimento)	
  –	
  Que	
  quan&dade/
concentração	
  foi	
  ob&da	
  de	
  ácidos	
  nucléicos	
  na	
  
extração?	
  
•  	
   pureza	
   –	
   os	
   ácidos	
   nucléicos	
   foram	
   ob&dos	
  	
  
com	
   alto	
   grau	
   de	
   pureza	
   ou	
   existem	
  
contaminantes	
  na	
  amostra?	
  
•  	
   integridade	
   –	
   as	
   moléculas	
   de	
   ácidos	
  
nuc lé i cos	
   es tão	
   in tegras	
   ou	
   houve	
  
degradação?	
  
	
  
Quais	
  são	
  as	
  etapas	
  na	
  extração/obtenção	
  
de	
  ácidos	
  nucléicos?	
  
	
  
•  1a	
  Etapa:	
  Ruptura	
  ou	
  lise	
  celular	
  
	
  
•  2a	
  Etapa:	
  Desnaturação	
  ou	
  ina&vação	
  de	
  
proteínas	
  	
  
•  3a	
  Etapa:	
  Separação	
  dos	
  ácidos	
  nucléicos	
  
1a	
  Etapa:	
  
•  Ruptura	
  ou	
  lise	
  celular	
  
– Liberar	
  os	
  componentes	
  citoplasmá,cos	
  e/ou	
  
nucleares	
  intracelulares.	
  
Técnica Exemplo Efeito na 
membrana 
Tipo celular 
Baseada em 
enzima 
Lisozima Produz orifícios 
nas membranas 
Bactérias 
Solução Solução salina 
hipotônica 
Produz ambiente 
hipotônico, que 
rompe membrana 
celular 
Bactérias/Geral 
Detergente SDS/NaOH Solubiliza camada 
lipídica 
Células animais / 
Bactérias 
 
Sonicação Ondas sonoras Rompe 
membranas 
através de som de 
alta freqüência 
Bactérias 
Homogenização 
(Nitrogênio 
liquído) 
Ruptura Mecânica Rompe membranas 
por força física 
Técnica de plantas/
Biópsia 
2a	
  Etapa:	
  
•  Desnaturação	
  ou	
  ina,vação	
  de	
  proteínas.	
  
– Lisados	
  celulares	
  
• Mistura	
   de	
   macromoléculas,	
   incluindo	
  
fragmentos	
   de	
   membrana	
   lipídicas	
   e	
  
proteínas	
  intracelulares.	
  
2.	
  Desnaturando	
  proteínas	
  celulares:	
  
	
  
Lisados	
  celulares	
  contêm	
  mistura	
  complexa	
  de	
  
macromoléculas:	
  
-­‐	
  	
  	
  	
  	
  DNA	
  /	
  RNA;	
  proteínas,	
  lipídeos,	
  carboidratos.	
  
-­‐  Fragmentos	
  de	
  membrana	
  lipídica	
  
-­‐  Proteínas	
  intracelulares:	
  enzimas	
  nucleases	
  
degrada&vas	
  –	
  DNAses	
  /	
  RNAses	
  "	
  interferem	
  no	
  
rendimento	
  dos	
  ácidos	
  nucléicos	
  
Soluções/reagentes	
  desnaturantes	
  proteínas:	
  	
  Tampão	
  
acetato	
  de	
  K	
  pH	
  4.8,	
  Proteinases,	
  Fenol,	
  Clorofórmio	
  
3a	
  Etapa:	
  
•  Sepa ra ção	
   do s	
   á c i do s	
   nu c l é i c o s	
   de	
  
macromoléculas	
   contaminantes	
   celulares	
  
(proteínas)	
  
– Solubilização	
   em	
   solventes	
   orgânicos,	
   seguida	
   de	
  
precipitação.	
  
•  Separação	
  com	
  fenol:	
  
– Baseia-­‐se	
   na	
   solubilidade	
   diferencial	
   das	
  
proteínas,	
   lipídeos	
   e	
   ácidos	
   nucléicos,	
   no	
  
solvente	
  orgânico	
  desproteinizante	
  fenol.	
  
Extração	
  de	
  ácidos	
  nucléicos	
  com	
  fenol	
  	
  
DNA RNA 
Camada aquosa (RNA) 
Interface (proteínas) 
Camada de fenol (DNA) 
Fenol pH neutro/alc. Fenol pH ácido 
DNA precipitado RNA precipitado 
Precipitação	
  com	
  álcool	
  
Precipitação	
  	
  com	
  álcool	
  (Etanol	
  ou	
  Isopropanol)	
  
DNA:	
  Ressuspender	
  DNA	
  em	
  TE	
  pH	
  8,0	
  –	
  (10mMTris-­‐HCl	
  /	
  
1mM	
  EDTA),	
  até	
  completa	
  dissolução	
  -­‐	
  Armazenar	
  -­‐20º	
  C	
  	
  
	
  
	
  
 DNA precipitado 
Melhora	
  na	
  recuperação	
  dos	
  ácidos	
  nucléicos:	
  	
  
	
  
-­‐  Extração	
  em	
  baixas	
  temperaturas	
  (gelo)	
  
	
  
-­‐  Incubação	
  dos	
  lisados	
  com	
  reagentes	
  desnaturantes	
  de	
  
proteínas	
  
	
  
-­‐  Agentes	
  que	
  retardam	
  a&vidade	
  das	
  nucleases	
  
Extração	
  de	
  ácidos	
  nucléicos	
  	
  
	
  
Agentes	
  que	
  retardam	
  a,vidade	
  das	
  nucleases:	
  	
  
-­‐  	
   tampões	
   de	
   extração	
   com	
   agentes	
   quelantes	
   Mg	
   ++	
  
(EDTA	
   –	
   ácido	
   e&leno	
   diaminotetracé&co)	
   necessários	
  
às	
  a&vidades	
  de	
  nucleases.	
  
-­‐  Solução	
   de	
   fenol/clorofórmio/álcool	
   isoamílico	
   "	
  
desnaturam	
  nucleases	
  e	
  coagulam	
  proteínas	
  durante	
  a	
  
extração	
  
-­‐  Inibição	
   de	
   RNAses	
   (proteinase	
   K;	
   DEPC	
   –	
   die$l	
  
pirocarbonato)	
  
Como	
  fazer	
  a	
  quan,ficação	
  do	
  
DNA?	
  
•  Princípio	
  –	
  Ác.	
  nucléicos	
  absorvem	
   luz	
  UV	
  num	
  padrão	
  
específico.	
   Em	
   um	
   espectrofotômetro	
   a	
   amostra	
   é	
  
exposta	
  a	
  luz	
  no	
  comprimento	
  de	
  onda	
  de	
  260nm	
  e	
  um	
  
detector	
  faz	
  a	
  medição	
  da	
  luz	
  que	
  atravessa	
  a	
  amostra.	
  
Quanto	
   mais	
   a	
   luz	
   é	
   absorvida,	
   maior	
   será	
   a	
  
concentração	
  de	
  ác.	
  nucléico	
  na	
  amostra.	
  
Espectrofotometria	
  
Quan,ficação	
  
	
   	
  	
  
•  Leitura	
  da	
  absorbância	
  a	
  260	
  e	
  280	
  nm	
  
	
  
	
  
•  OD260	
  =	
  1.0,	
  dsDNA	
  =	
  50	
  µg/mL;	
  	
  
	
  RNA	
  =	
  40	
  µg/mL	
  
	
  
•  Desvantagem:	
   interferência	
   com	
   material	
   para	
  
extração,	
   inabilidade	
   de	
   diferenciar	
   entre	
  DNA	
   e	
  
RNA,	
  sensibilidade:	
  50-­‐250	
  ng	
  DNA/	
  mL	
  
Quan,ficação	
  do	
  DNA	
  
Reagentes e Equipamento - Espectrofotômetro	
  
UV,	
  cubetas	
  de	
  quartzo,	
  ddH20	
  	
  
	
  
1 	
  Zerar	
  o	
  aparelho	
  com	
  ddH20	
  	
  
2 	
  Diluir	
  um	
  volume	
  conhecido	
  de	
  ácido	
  nucléico	
  
em	
  água.	
  
3 	
  Realizar	
  a	
  leitura	
  em	
  OD260	
  e	
  OD280.	
  	
  
4 	
  Calcular	
  a	
  concentração.	
  
EXEMPLO	
  
DNA [ ] (µg/µL) = OD260 x F. D. x 50 (µg/mL) 
1000 
F.D. = fator de diluição 
Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,1 
DNA [ ]= 0,157 x 33,33 x 50 / 1000 = 261,6 ng/ µl 
Espectrofotômetro	
  Ac.nucléicos	
  
moderno	
  -­‐Nanodrop	
  
Espectrofotômetro	
  Ac.nucléicos	
  moderno	
  -­‐
Nanodrop	
  
104,5ng/µl = 0,104µg/ µl 
PUREZA	
  
•  Ácidos	
  nucléicos	
  podem	
  estar	
  contaminados	
  com	
  
outras	
   moléculas	
   (ex.	
   proteínas,	
   compostos	
  
orgânicos	
   etc).	
   A	
   razão	
   entre	
   a	
   absorbância	
   	
   de	
  
260	
   e	
   280nm	
   (A260/280)	
   é	
   usada	
   para	
   acessar	
   a	
  
pureza	
  dos	
  ácidos	
  nucléicos.	
  
DNA: Razão A260/A280 ~ 1,8 – puro 
< 1,8 contaminação proteínas 
RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0 – puro 
< 2,0 contaminação proteínas 
> 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio 
Determinação	
  da	
  concentração	
  do	
  DNA	
  através	
  
de	
  gel	
  de	
  agarose	
  
•  O	
   DNA	
   pode	
   ser	
   quan&ficado	
   e	
   analisado	
   quanto	
   à	
   sua	
  
qualidade,	
   por	
   meioda	
   análise	
   em	
   gel	
   de	
   agarose	
   (	
   gel	
   de	
  
agarose	
  entre	
  0,8%	
  e	
  1%	
  )	
  
•  Com	
   as	
   amostras	
   de	
   DNA,	
   é	
   aplicada	
   também	
   uma	
   amostra	
  
cuja	
  concentração	
  e	
  tamanhos	
  é	
  conhecidos.	
  
•  Após	
  a	
  eletroforese,	
  o	
  gel	
  é	
  corado	
  com	
  intercalante	
  de	
  DNA	
  e	
  
visualizado	
  em	
  luz	
  ultravioleta.	
  	
  
•  As	
   amostras	
   são	
   comparadas	
   aos	
   padrões,	
   determinando-­‐se	
  
dessa	
  maneira	
  as	
  concentrações	
  aproximadas	
  de	
  DNA	
  em	
  cada	
  
amostra.	
  
	
  
Determinação	
  da	
  concentração	
  do	
  DNA	
  através	
  
de	
  gel	
  de	
  agarose	
  
1650pb 
– 40ng 
MM 0,1 0,3 0,5 0,1 0,3 0,5 
DNA1 ul DNA2 ul 
DNA	
  	
  1 –	
  55	
  ng/ul	
  
DNA	
  	
  2	
  –	
  150	
  ng/ul	
  
Aná l i s e	
   da	
  
i m a g e m	
   –	
  
comparação	
  	
  
com	
   amostra	
  
conhecida	
  
MATERIAIS	
  EXTRAÇÃO	
  -­‐	
  MICROTUBOS	
  
2 ml 1,5 ml 200 µl 
MATERIAIS	
  EXTRAÇÃO	
  	
  
	
  
MICROPIPETAS	
  	
  
PONTEIRAS	
  	
   EPI	
  –	
  JALECOS/LUVAS	
  	
  
LABORATÓRIO	
  	
  -­‐	
  SOLUCÕES	
  	
   Escherichia	
  coli	
  	
  
EXTRAÇÃO	
  	
  
DNA