ExtracaoDNARNA_Biolmol3

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Professor: Christian Reis
Disciplina: Biologia Molecular
EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
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O que é extração/purificação?
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Quais são os requisitos essenciais para a obtenção dos ácidos nucléicos? 
 quantidade (rendimento) – Que quantidade/concentração foi obtida de ácidos nucléicos na extração?
 pureza – os ácidos nucléicos foram obtidos com alto grau de pureza ou existem contaminantes na amostra?
 integridade – as moléculas de ácidos nucléicos estão integras ou houve degradação?
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Quais são as etapas na extração/obtenção de ácidos nucléicos?
1a Etapa: Ruptura ou lise celular
2a Etapa: Desnaturação ou inativação de proteínas 
3a Etapa: Separação dos ácidos nucléicos
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1a Etapa:
Ruptura ou lise celular
Liberar os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares.
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2a Etapa:
Desnaturação ou inativação de proteínas.
Lisados celulares
Mistura de macromoléculas, incluindo fragmentos de membrana lipídicas e proteínas intracelulares.
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2. Desnaturando proteínas celulares:
Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas:
- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.
Fragmentos de membrana lipídica
Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos
Soluções/reagentes desnaturantes proteínas: Tampão acetato de K pH 4.8, Proteinases, Fenol, Clorofórmio
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3a Etapa:
Separação dos ácidos nucléicos de macromoléculas contaminantes celulares (proteínas)
Solubilização em solventes orgânicos, seguida de precipitação.
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Separação com fenol:
Baseia-se na solubilidade diferencial das proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, no solvente orgânico desproteinizante fenol.
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Extração de ácidos nucléicos com fenol 
DNA
RNA
Camada aquosa (RNA)
Interface (proteínas)
Camada de fenol (DNA)
Fenol pH neutro/alc.
Fenol pH ácido
DNA precipitado
RNA precipitado
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Precipitação com álcool
Precipitação com álcool (Etanol ou Isopropanol)
DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (10mMTris-HCl /
1mM EDTA), até completa dissolução - Armazenar -20º C 
 DNA precipitado 
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Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: 
Extração em baixas temperaturas (gelo)
Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas
Agentes que retardam atividade das nucleases
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Extração de ácidos nucléicos 
Agentes que retardam atividade das nucleases: 
 tampões de extração com agentes quelantes Mg ++ (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) necessários às atividades de nucleases.
Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração
Inibição de RNAses (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato)
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Como fazer a quantificação do DNA?
Princípio – Ác. nucléicos absorvem luz UV num padrão específico. Em um espectrofotômetro a amostra é exposta a luz no comprimento de onda de 260nm e um detector faz a medição da luz que atravessa a amostra. Quanto mais a luz é absorvida, maior será a concentração de ác. nucléico na amostra.
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Espectrofotometria
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Quantificação
		
Leitura da absorbância a 260 e 280 nm
OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL; 
	RNA = 40 µg/mL
Desvantagem: interferência com material para extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL
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Quantificação do DNA
Reagentes e Equipamento - Espectrofotômetro UV, cubetas de quartzo, ddH20 
1	Zerar o aparelho com ddH20 
2	Diluir um volume conhecido de ácido nucléico em água.
3	Realizar a leitura em OD260 e OD280. 
4	Calcular a concentração.
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EXEMPLO
Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,1
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Espectrofotômetro Ac.nucléicos moderno -Nanodrop
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Espectrofotômetro Ac.nucléicos moderno -Nanodrop
104,5ng/l = 0,104g/ l 
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PUREZA
Ácidos nucléicos podem estar contaminados com outras moléculas (ex. proteínas, compostos orgânicos etc). A razão entre a absorbância de 260 e 280nm (A260/280) é usada para acessar a pureza dos ácidos nucléicos.
DNA: Razão A260/A280 ~ 1,8 – puro
< 1,8 contaminação proteínas
RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0 – puro
< 2,0 contaminação proteínas
> 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio
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Determinação da concentração do DNA através de gel de agarose
O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose ( gel de agarose entre 0,8% e 1% )
Com as amostras de DNA, é aplicada também uma amostra cuja concentração e tamanhos é conhecidos.
Após a eletroforese, o gel é corado com intercalante de DNA e visualizado em luz ultravioleta. 
As amostras são comparadas aos padrões, determinando-se dessa maneira as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra.
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Determinação da concentração do DNA através de gel de agarose
1650pb – 40ng
MM 0,1 0,3 0,5 0,1 0,3 0,5 
DNA1 ul
DNA2 ul
DNA 1 – 55 ng/ul
DNA 2 – 150 ng/ul
Análise da imagem – comparação com amostra conhecida
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MATERIAIS EXTRAÇÃO - MICROTUBOS
2 ml
1,5 ml
200 l
MATERIAIS EXTRAÇÃO 
MICROPIPETAS 
PONTEIRAS 
EPI – JALECOS/LUVAS 
LABORATÓRIO - SOLUCÕES 
Escherichia coli 
EXTRAÇÃO 
DNA
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