3-Testes sorolgicos parte II

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Sandra Beck 
TESTES SOROLÓGICOS 
parte 2 
CONCEITOS 
Sandra Beck 
PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS 
RECOMBINANTES E ANTICORPOS 
MONOCLONAIS 
Sandra Beck 
Tecnologia DNA 
RECOMBINANTE 
Sandra Beck 
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS 
Formação 
dos 
hibridomas 
Seleção 
De 1 célula 
por 
cavidade 
 
Verificar 
reatividade 
com 
epitopo 
alvo 
Sandra Beck 
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS 
Sandra Beck 
TIPOS DE TESTES 
Com reagentes marcados – 
maior sensibilidade 
 radioativos 
 enzimas 
 fluorocromos 
 quimioluminescentes 
 Competitivos -reagente limitado - radioimunoensaio 
 Não-competitivos - reagente em excesso - ELISA 
Sandra Beck 
 
Sandra Beck 
Sandra Beck 
• Imunofluorescência Direta 
• Imunofluorescência Indireta 
• Pesquisa de Antígenos 
• Pesquisa de Anticorpos 
• Sistema Avidina-Biotina 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
FLUOROCROMOS 
• Substâncias que absorvem luz de um 
comprimento de onda menor e, 
instantaneamente, emitem luz de 
comprimento de onda maior (menor 
energia) 
• Mais comuns: isotiocianato de 
fluoresceína, lisamina-rodamina B 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Imunofluorescência 
 Aumento de 10 a 1000 
vezes na sensibilidade 
 Grande aumento na 
rapidez de detecção 
 Vantagens 
relativamente à RIA: 
 
 Tão sensível 
 Reagentes mais estáveis 
 Mais fácil de implementar 
Sandra Beck 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Sandra Beck 
 Coons e cols - 1942 
 Empregada na pesquisa e 
localização de antígenos em células 
ou tecidos através de um anticorpo 
monoclonal- específico- marcado 
com fluorocromo 
 Chlamydia trachomatis, Treponema 
pallidum, Legionella sp, etc... 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
DIRETA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Luz de 
excitação 
Luz 
emitida 
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
• Empregada na pesquisa de anticorpos 
 
• O antígeno fixado em lâmina reage 
com o anticorpo específico presente no 
soro(amostra) 
 
• O complexo antígeno/anticorpo é 
revelado com conjugado fluorescente 
(anticorpo monoclonal anti imunoglobulina 
humana marcado com fluoresceina) 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
 
Exemplos: 
 
Pesquisa de anticorpos 
 
 T. pallidum, T. cruzi, FAN; HIV. 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck/ DACT 
Doença de Chagas 
2009 
•FLUORESCÊNCIA 
Método indireto 
Antígeno -LAMINA 
(PARASITA) 
Anticorpo 
(soro) 
Anticorpo marcado 
conjugado 
Sandra Beck 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA 
Trypanosoma cruzi 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Imunofluorescência – HIV 
células infectadas + soro paciente 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
AUTOMAÇÃO 
Utilizando fluorescência 
 
CITOMETRIA DE FLUXO 
 
IMUNOENSAIO FLUORESCENTE 
 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
FACS 
Sandra Beck 
CITOMETRIA DE FLUXO 
Sandra Beck 
FACS 
Sandra Beck 
CITOMETRIA DE FLUXO 
Sandra Beck 
Fenotipagem de linfócitos 
Linfócito 
CD4+ 
CD4 F 
F 
F 
TCR 
CD45RA 
CD3 
CD27 
F 
IgG1 
Ig
G
1
 
H
L
A
-D
R
 
CD38 CD25 
CD45RA 
C
D
2
7
 
C
D
9
5
 
Sandra Beck 
Fenotipagem de linfócitos 
Linfócito 
CD4+ 
CD4 F 
F 
F 
TCR 
CD45RA 
CD3 
CD27 
F 
Sandra Beck 
Leucemias 
Sandra Beck 
FACS 
CD4/CD8 
Sandra Beck 
 HIV 
infection 
J. Coffin, XI International Conf. on AIDS, Vancouver, 1996 
Desenvolvimento da AIDS 
Carga viral = Velocidade do trem 
CD4 nÍvel = Distância do abismo 
Sandra Beck 
FACS 
Sandra Beck 
• RADIOIMUNOENSAIO 
MARCADORES RADIOATIVOS 
• Berson, Yalow e cols. – 1956 
• Yalow e Berson – 1960 – insulina 
• Ekins – 1960 – tiroxina 
Sandra Beck 
RADIOIMUNOENSAIO 
anticorpo antígeno marcado+ 
 não marcado (amostra) 
medir 
radioatividade 
Método de competição com 
antígeno marcado 
 
Substituído por EIA 
Sandra Beck 
• Baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos 
marcados com enzimas e permitem a detecção, 
titulação e quantificação de substâncias de 
interesse biológico 
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
• IMUNOPEROXIDASE (TECIDO) 
• ENZIMAIMUNOENSAIO 
• ELISA – Enzyme-Linked Immunossorbent Assay 
• Pesquisa de Anticorpos 
• Método Indireto 
• Captura de IgM 
• Pesquisa de Antígenos 
• Captura 
• Competição com Antígeno Marcado 
• Competição com Anticorpo Marcado 
• Inibição para Haptenos 
• Enzimaimunoensaio Homogêneo 
• EMIT® 
• SLFIA® 
• IMMUNO-DOT 
• WESTERN BLOTTING 
• DETECÇÃO DE IMUNOPRECIPITADOS 
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Enzimas mais utilizadas 
Ensaios heterogêneos 
Peroxidase 
Fosfatase alcalina 
ENZIMAIMUNOENSAIO 
EIA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Miles e Hales – 1968 – ensaio heterogêneo 
Engvall e Perlmann – 1971 – ELISA 
ELISA 
Enzyme-Linked 
ImmunoSorbent Assay 
ALTERNATIVA AO RADIOIMUNOENSAIO 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Princípio Básico 
 
Imobilização de um dos reagentes numa fase 
sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a 
uma enzima, com preservação tanto da atividade 
enzimática como da imunológica do anticorpo 
ELISA 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
Para a pesquisa de anticorpos 
Método indireto 
ELISA 
Anticorpo no soro 
(amostra) 
anti-imunoglobulina 
marcada 
substrato cromogênico 
E E 
Antígeno 
recombinante 
s
o
ro
 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
Anticorpo no soro 
(amostra) 
anti-imunoglobulina 
marcada 
substrato cromogênico 
Antígeno 
recombinante 
s
o
ro
 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
E 
IgG 
IgM 
E E 
E 
Sandra Beck 
Para a pesquisa de antígenos 
Método de captura (P24; HbSAg) 
Anticorpo 
Monoclonal 
(AMC) 
Antígeno no soro 
(amostra) 
E 
E
 
 AMC anti-antígeno 
marcado 
E 
E
 
substrato 
cromogênico 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
ELISA 
Sandra Beck 
Enzima imuno ensaios (EIA) 
ELISA 3ª GERAÇÃO 
IgG + IgM 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELISA 4ª GERAÇÃO 
Sandra Beck 
Sandra Beck 
Método de captura de anticorpos IgM 
ELISA 
s
o
ro
 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
anti-IgM 
Fator reumatóide 
+ Outras IgM especificas 
Substrato 
cromogênico 
anti-IgM IgM (amostra) Antígeno 
Específico marcado 
Substrato 
cromogênico 
E 
E E 
Sandra Beck 
Para a pesquisa de antígenos 
Método de competição com antígeno 
marcado 
anticorpo antígeno marcado 
e não marcado (amostra) 
E E 
substrato 
cromogênico 
la
v
a
g
e
m
 
la
v
a
g
e
m
 
ELISA 
Sandra Beck 
ELISA 
Sandra Beck 
Determinação do Cut-off – Aula prática 
D.O. 
Sandra Beck 
SUBSTRATOS CROMOGÊNICOS 
Substrato da peroxidase: peróxido de hidrogênio (H2O2) 
Cromógenos ou doadores de H mais utilizados são: 
ortofenilenodiamina (OPD) 
tetrametilbenzidina (TMB). 
 
 
Peroxidase reduz a H2O2  oxidação do 2
o substrato  
produto de reação solúvel e colorido 
Sandra Beck 
IMMUNO-DOT 
dot-ELISA, dot-immunobinding assay, dot-blotting 
assay, dot-blot ELISA 
Reagentes marcados 
SandraBeck 
IMMUNO-DOT 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
• MÉTODO DO DIPSTICK 
•Ensaios Imunocromatográficos 
TESTES RÁPIDOS 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
 PAGE: gel de poli-acrilaminda 
 SDS: sodio docecil sulfato 
+ - 
1a etapa: Proteínas são separadas, de acordo com seu tamanho, por 
eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de 
sódio (SDS-PAGE) 
 
WESTERN BLOTTING 
Sandra Beck 
WESTERN BLOTTING 
anodo 
mistura de 
antígenos 
protéicos 
catodo 
migração 
eletroforética 
Reagentes marcados 
Sandra Beck 
WESTERN BLOTTING 
catodo 
anodo 
papel de filtro 
membrana 
gel 
tampão de 
transferência 
Reagentes marcados 
2a etapa: As proteínas separadas 
são transferidas 
eletroforeticamente, do gel para 
uma membrana de nitrocelulose, 
onde ficam imobilizadas, como 
uma réplica do padrão de bandas 
do gel 
 
Sandra Beck 
WESTERN BLOTTING 
reação 
antígeno-
anticorpo 
Y Y 
Y Y 
Y 
Y 
Y 
Y Y 
Y 
A B 
reação com 
conjugado 
revelação com 
substrato 
cromogênico 
Substrato 
cromogênico 
Y Y 
Y Y 
Y 
Y 
Y 
Y Y 
Y 
Y
 E 
Y
 
E
 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
Y
 E 
A B 
conjugado 
A B 
visualização dos 
complexos 
antígeno-anticorpo 
formados 
Reagentes marcados 
3a etapa: A reação imunoenzimática é então processada na membrana 
para identificação das proteínas separadas e transferidas 
Sandra Beck 
SDS-PAGE 
 PAGE: gel de poli-acrilaminda 
 SDS: sodio docecil sulfato 
+ - 
Western-Blot 
Sandra Beck 
Western blotting 
Sandra Beck 
Western blotting –critérios Brasil 
·Amostra não-reagente : ausência de bandas 
·Amostra reagente: presença de, no mínimo, 2 (duas) bandas 
dentre as: gp 160/120; gp 41; p24. 
·Amostra indeterminada: qualquer outro padrão de bandas 
diferente dos descritos anteriormente. 
 
Sandra Beck 
AUTOMAÇÃO 
do EIA 
 
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE 
IMUNOENSAIO FLUORESCENTE 
Sandra Beck 
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE 
Sandra Beck 
QUIMIOLUMINESCÊNCIA 
• Fenômeno em que se obtém energia luminosa a 
partir de uma REAÇÃO QUÍMICA 
 
• A energia química gerada, como resultado da 
dissociação de ligações fracas, produz compostos 
intermediários em um estado eletronicamente 
excitado que, quando retornam ao estado de 
energia inicial, emitem luz 
ENSAIOS 
QUIMIOLUMINESCENTES 
Sandra Beck 
AUTOMAÇÃO 
do EIA 
 
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE 
Sandra Beck 
AUTOMAÇÃO 
do EIA 
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE 
Sandra Beck 
QUIMIOLUMINESCÊNCIA 
• Elevada sensibilidade – 10-18 a 10-21 M 
• Linearidade da curva dose-resposta 
• Rapidez 
• Custo baixo 
• Reagentes não-perigosos 
• Procedimentos simples 
• Reação em cascata – aumenta a sensibilidade 
• Automação 
ENSAIOS 
QUIMIOLUMINESCENTES 
Sandra Beck 
IMUNOENSAIO 
QUIMIOLUMINESCENTE 
ACCESS 
Sandra Beck 
Fluoroimunoensaio 
Permite detecção e quantificação de antígenos 
e anticorpos utilizando conjugados 
fluorescentes, cuja emissão de luz, de um 
determinado comprimento de onda, é medida 
com precisão em fluorômetro 
IMUNOENSAIO FLUORESCENTE 
Sandra Beck 
IMUNOENSAIO MEIA 
Microparticula Enzyme Immune Assay 
Sandra Beck 
VIDAS ®  ELFIA  enzyme-linked fluorescent 
immunoassay 
 
Substrato: fosfato de 4-metil umbeliferil  
fosfatase alcalina  4-metil umbeliferone 
(fluorescente) 
ENZIMAIMUNOENSAIO 
FLUORESCENTE 
Sandra Beck 
VIDAS ® 
ENZIMAIMUNOENSAIO 
FLUORESCENTE 
Fluorescência Polarizada 
FPIA 
Sandra Beck 
Atores!!!!!!!!!! 
Anticorpo monoclonal 
Droga circulante 
paciente 
Droga Marcada 
ensaio 
Sandra Beck 
Competição 
Droga livre –Marcada (ensaio) 
Compete com Droga-livre (amostra) 
Pela ligação a porção Fab do anticorpo 
monoclonal 
 
Preferência de ligação 
Droga não marcada ( Amostra) 
Sandra Beck 
Droga livre não complexada 
gira rápido 
Sandra Beck 
Droga complexada ao 
anticorpo gira lentamente 
Sandra Beck 
Inversamente proporcional 
 Maior quantidade de droga na amostra 
 Menor quantidade de droga marcada ligada ao monoclonal 
 Menor quantidade de droga na amostra 
 Maior quantidade de droga marcada ligada ao 
monoclonal 
Sandra Beck 
 Maior concentração da droga circulante 
 Menor polarização (sobra droga 
marcada livre) 
Sandra Beck 
 Menor concentração da droga circulante 
 Maior polarização (droga marcada 
complexada) 
Sandra Beck 
SENSIBILIDADE DOS DIFERENTES 
IMUNOENSAIOS: 
 
RIA detecta 10-17 moles 
EIA detecta 10-12 moles 
CL detecta 10-17 moles (até 10-21 moles) 
 
Sandra Beck 
SENSIBILIDADE DOS DIFERENTES 
IMUNOENSAIOS: