2-Métodos

Prévia do material em texto

TESTES SOROLÓGICOS
CONCEITOS
São técnicas para a detecção e 
quantificação de antígenos e 
anticorpos, ou outras 
substâncias que desempenhem o 
papel de antígeno no ensaio, tais 
como drogas, hormônios, ácidos 
nucléicos, citocinas, receptores 
de células, etc.
O QUÊ SÃO TESTES 
SOROLÓGICOS ? 
SENSIBILIDADE RELATIVA DOS 
MÉTODOS
§ Difícil comparar o desempenho analítico de 
diferentes métodos
§ Qual seria a razão da diferença de sensibilidade?
§ Princípio
§ Antígeno
§ Marcação do anticorpo
§ Uma série de fatores determina a escolha de um 
ensaio
§ diluição da amostra
§ Precisão
§ Facilidade
§ Segurança
§ Condições de laboratório
§ Limites exatos de detecção variam com avidez, 
concentração, lotes de reagentes, temperatura, 
tempo de reação, etc
SENSIBILIDADE RELATIVA DOS 
MÉTODOS
Qual teste escolher?
TESTES SOROLÓGICOS
UM MELHOR CONHECIMENTO 
DOS MÉTODOS E PRINCÍPIOS 
UTILIZADOS NA PESQUISA DE 
ANTÍGENOS E DE ANTICORPOS 
PODE AUXILIAR NA APLICAÇÃO E 
INTERPRETAÇÃO DA GRANDE 
VARIEDADE DE TÉCNICAS 
DISPONÍVEIS
TIPOS DE TESTES
Ø Com reagentes não-marcados
Ø Com partículas
Ø Com reagentes marcados - maior sensibilidade
Ø radioativos
Ø enzimas
Ø fluorocromos
Ø quimioluminescentes
Ø Competitivos -reagente limitado - radioimunoensaio
Ø Não-competitivos - reagente em excesso - ELISA
TIPOS DE TESTES
ØCom reagentes marcados –
Ømaior sensibilidade
Ø radioativos
Ø enzimas
Ø fluorocromos
Ø quimioluminescentes
Ø Competitivos -reagente limitado - radioimunoensaio
Ø Não-competitivos - reagente em excesso - ELISA
TIPOS DE TESTES
Ø Com reagentes não-marcados
Ø Com partículas
MENOS SENSÍVEIS
• IMUNODIFUSÃO
• Simples 
•Radial (Mancini)
• Dupla
•Radial (Ouchterlony)
PRECIPITAÇÃO
Testes sorológicos
Imunodifusão radial simples
Testes sorológicos
Imunodifusão
Dupla
Radial (Ouchterlony)
PRECIPITAÇÃO
PRECIPITAÇÃO
QUAIS SÃO AS PRINCIPAIS 
DESVANTAGENS DESTAS TÉCNICAS ?
Sensibilidade
Tempo de reação
•ELETROFORESE+IMUNODIFUSÃO
• Imunoeletrodifusão unidimensional
• Simples – Laurell
• Dupla – Contraimunoeletroforese
• Imunoeletroforese
• Imunofixação
PRECIPITAÇÃO
PRECIPITAÇÃO
AGLUTINAÇÃO
Caracteriza-se pela formação de 
agregados visíveis como 
resultado da interação de 
anticorpos específicos e 
partículas insolúveis que 
contêm determinantes 
antigênicos em sua superfície
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
Partículas de látex são esferas de 
poliestireno que podem ser utilizadas 
como suportes na adsorção de 
proteína solúvel e antígenos 
polissacarídicos, funcionando como 
sistema indicador da reação 
antígeno-anticorpo
è Fator reumatóide 
è Antígenos polissacarídicos bacterianos
Haemaphilus influenzae, Rickettsia sp, 
estreptococos do grupo B, Staphylococcus 
aureus, Neisseria meningitidis, etc.
Soro, urina ou líquor
è Drogas e hormônios (b-HCG)
è Proteína C reativa
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
AUTOMAÇÃO
Reações com partículas
NEFELOMETRIA
TURBIDIMETRIA
NEFELOMETRIA
Método direto de medida do espalhamento, em um 
determinado ângulo, de uma luz incidente, por partículas 
em suspensão, sendo uma técnica sensível para 
quantificar as reações de precipitação entre antígenos e 
anticorpos
Determinação de drogas, hormônios, peptídeos,
proteínas
NEFELÔMETRO
NEFELOMETRIA
NEFELOMETRIA
TURBIDIMETRIA
Medida da diminuição da intensidade da luz transmitida, 
em relação à incidente, através de uma suspensão de 
partículas, devido à reflexão, absorção e espalhamento
Determinação de drogas, hormônios, peptídeos,
proteínas, lipoproteínas
ESPECTROFOTÔMETRO
 
 
 Equivalência 
 
 
 
 Dissocia 
 
 
 
 (tempo) 
Excesso de Ac leitura Precipita excesso de Ag 
Turbidimetria X
Nefelometria
Turbidimetria e Nefelometria 
 
 
.. .absorve Transmite 
 (TUBIDIMETRIA) 
 
reflete 
 Dispersão (NEFELOMETRIA) 
(Mudança de direção) 
 
 
 
Luz 
Amostras ictéricas ou hemolisadas
Não afetam a nefelometria
Afetam a turbidimetria
AGLUTINAÇÃO DE 
CRISTAIS DE COLESTEROL 
O teste de VDRL (Venereal Disease 
Research Laboratory) emprega 
cristais de colesterol que são 
sensibilizados com lecitina e 
cardiolipina, para a pesquisa de 
anticorpos antilipídios na sífilis
Formação de flóculos (¹ aglutinação??)
AGLUTINAÇÃO DE 
CRISTAIS DE COLESTEROL 
Falsos resultados negativos em soros com 
elevado título de anticorpos aglutinantes
FENÔMENO DE PROZONA
AGLUTINAÇÃO
Esse efeito é eliminado empregando-se 
diluições seriadas do soro
Pró-zona
• 1o estágio: Ligação dos anticorpos aos antígenos 
de superfície, por meio de ligações não-
covalentes (segundos)
• 2o estágio: Resulta das colisões que ocorrem 
entre as partículas, de modo que os anticorpos 
ligados a uma partícula se ligam a determinantes 
antigênicos de outra – pontes – agregados 
visíveis a olho nu (minutos a horas)
AGLUTINAÇÃO
AGLUTINAÇÃO
FATORES QUE INTERFEREM NA 
FORMAÇÃO DE AGREGADOS
ð Tipo do anticorpo (IgM é 750x mais eficiente que IgG)
ð Eletrólitos
ð pH (ideal entre 6,0 e 8,0)
ð Tempo
ð Temperatura
AGLUTINAÇÃO
Ocorre com partículas que 
apresentam determinantes 
antigênicos naturais em sua 
superfície 
Ex: hemácias, bactérias, 
protozoários, fungos
AGLUTINAÇÃO DIRETA
AGLUTINAÇÃO DIRETA
– Hemácias como antígeno: 
ðTipagem de grupos sangüíneos do sistema ABO e 
Rh (antígenos específicos) 
ðReação de Paul-Bunnel-Davidson (antígenos 
heterófilos)
– Antígenos íntegros ou fragmentados de 
bactérias, espiroquetas, protozoários:
ðTeste de Widal (salmoneloses)
ðTeste de Wright (brucelose)
ðTeste de Weil-Felix (rickettsiose)
ðTeste de aglutinação para leptospirose, 
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU 
INDIRETA
• Partículas inertes
• Látex
•Células antigenicamente não relacionadas
• Hemácias
• Hemaglutinação Passiva
• Inibição de Hemaglutinação Passiva
• Aglutinação do Látex
• Aglutinação de Cristais de Colesterol
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU 
INDIRETA
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA 
Hemácias possuem uma 
superfície complexa, o que 
facilita a ligação de muitos 
antígenos
Mais usadas: hemácias de carneiro ou..de
aves
Testes sorológicos
• Hemaglutinação
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU 
INDIRETA
Chagas
Hematoxo+
+
Partícula 
carregadora
antíg
eno
Partícula 
sensibilizada
Partícula 
sensibilizada
antic
orpo
aglutina
ção
INIBIÇÃO DA 
HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA
Baseia-se na capacidade que certos antígenos virais têm 
de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de 
hemácias
Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as 
partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, 
indicando um teste positivo para a presença de 
anticorpos
Ex: anticorpos contra os vírus da rubéola, sarampo, 
influenza e certos enterovírus.
INIBIÇÃO DA 
HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA