ELISA 6º PERÍODO

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ELISAELISA
(Enzime‐linked Immunosorbent Assay)
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Aplicação:
Detecção de Ags e Acs, proteínas séricas, hormônios, 
medicamentos, drogas, etc.
‐ Explora a reação Ag‐Ac usando enzimas como marcadores
‐ Sensível e específico
‐ Leitura no espectofotômetrop
‐ Reagentes estáveis
‐ Variedade de enzimas que podem ser usadas
‐ Sem riscos 
‐ Poder ser automatizada
Anticorpos
1. Sandwich de Ac (IgG) 
2. Sandwish de Ac (IgM) 
‐ (Falso negativo      IgG)(Falso negativo      IgG)
‐ (Falso positivo IgG + FR)
3. Captura de IgM
‐ (Falso positivo ‐ FR)
4. Ponte de Ac (Anticorpos totais)
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Anticorpos
1. Sandwich de Ac (IgG) 
2. Sandwish de Ac (IgM) 
‐ (Falso negativo      IgG)(Falso negativo      IgG)
‐ (Falso positivo IgG + FR)
3. Captura de IgM
‐ (Falso positivo ‐ FR)
4. Ponte de Ac (Anticorpos totais)
1
2) (Falso negativo    IgG)
Anticorpos
1. Sandwich de Ac (IgG) 
2. Sandwish de Ac (IgM) 
‐ (Falso negativo      IgG)(Falso negativo      IgG)
‐ (Falso positivo IgG + FR)
3. Captura de IgM
‐ (Falso positivo ‐ FR)
4. Ponte de Ac (Anticorpos totais)
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2) (Falso positivo IgG + FR)
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Anticorpos
1. Sandwich de Ac (IgG) 
2. Sandwish de Ac (IgM) 
‐ (Falso negativo      IgG)
3) (Falso positivo - FR)
(Falso negativo      IgG)
‐ (Falso positivo IgG + FR)
3. Captura de IgM
‐ (Falso positivo ‐ FR)
4. Ponte de Ac (Anticorpos totais)
3
Anticorpos
1. Sandwich de Ac (IgG) 
2. Sandwish de Ac (IgM) 
‐ (Falso negativo      IgG)(Falso negativo      IgG)
‐ (Falso positivo IgG + FR)
3. Captura de IgM
‐ (Falso positivo ‐ FR)
4. Ponte de Ac (Anticorpos totais)
4
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Antígenos
5.Competitiva simultânea ou seqüencial 
6. Sandwish direto ou indireto 
7. Inibição direta ou indireta
Antígenos
5.Competitiva simultânea ou seqüencial 
6. Sandwish direto ou indireto 
7. Inibição direta ou indireta
5) Competitiva  
simultânea                                           seqüencial
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Antígenos
5.Competitiva simultânea ou seqüencial 
6. Sandwish direto ou indireto 
7. Inibição direta ou indireta
6. Sandwish
direto indireto
Antígenos
5.Competitiva simultânea ou seqüencial 
6. Sandwish direto ou indireto 
7. Inibição (direta ou indireta)
7. Inibição direta
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Antígenos
5.Competitiva simultânea ou seqüencial 
6. Sandwish direto ou indireto 
7. Inibição direta ou indireta
7. Inibição Indireta
Anticorpo de baixa avidez
Diagnóstico Sorológico utilizando IgG e IgM
IgG
Infecção 
Aguda
Infecção
Recente
Infecção
Passada
Sem 
Resposta
IgM
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Testes pré‐natais : 
avaliação preventiva e profilática durante uma  gestação
S l i ti ê i d t t é i‐ Sorologias negativas ‐ ausência de contato prévio
(medidas profiláticas e preventivas)
‐ Sorologias IgG positivas para toxoplasma, rubéola ou
citomegalia ‐ exposição prévia ao agente (ausência de
qualquer risco para o feto).
‐ Presença concomitante de IgG e IgM positivas para
toxoplasma rubéola citomegalia ‐ infecção aguda comtoxoplasma, rubéola, citomegalia ‐ infecção aguda com
possível risco para o feto ?
Presença concomitante de IgG e IgM?
‐ Pode ser presença de IgM residual (não é obrigatoriamente
f d )infecção aguda)
‐ Vigência de uma infecção aguda, que pode traduzir risco
para o feto, ou a infecção ocorreu há vários meses atrás???
Pesquisa de Anticorpo de Baixa Avidez
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Avidez e Afinidade
 Afinidade é a força de atração resultante das forças atrativas e repulsivas entre o 
epítopo antigênico e o sítio combinatório do anticorpo.
 Avidez é a medida da força total de ligação Ac-Ag, com muitos determinantes ç g ç g,
antigênicos (Ag multivalente). É influenciada pelas valências do Ag e do Ac. 
Alta avidez = ligação forte
Baixa avidez = ligação fraca
IgM IgG[ ] Ac
Meses3                                                           24
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IgM IgG
[ ] Ac
IgM
?
Meses3                                                    18 ‐ 24
IgG baixa avidez
- Quadro infeccioso agudo recenteg
IgG alta avidez
- Quadro infeccioso pregresso
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The Value of the IgG Avidity
for the Diagnostic of Acute infection by 
Toxoplasma gondii, 2002.
56 soros
Toxo IgG avidez
Toxo IgG
Toxo IgM
Grupo 1
12 soros de pacientes com quadro
infeccioso agudo recente de toxoplasmose,
inferior a três meses de duração, com
anticorpos IgG e IgM presentes.
100% dos soros com baixa avidez
dos anticorpos IgG;
Sujeitos incluídos Resultados
Grupo 2
Grupo 3
29 soros de pacientes sem quadro 
infeccioso agudo de toxoplasmose, em 18 
meses, com anticorpos IgG e IgM presentes.
15 soros de pacientes sem quadro 
infeccioso agudo de toxoplasmose, em 18 
meses, com anticorpos IgG presentes e 
anticorpos IgM ausentes.
93,1% dos soros com alta avidez 
dos anticorpos IgG e 6,9% dos 
soros com avidez intermediária;
100% dos soros com alta avidez 
dos anticorpos IgG.
Uréia 6M
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IgM
IgM
IgG[ ] Ac
A
Meses3                                          24
A B
B
Uréia 6M Índice de 
Avidez
([IA = U+/U- x 100])
DO amostra não tratada = U-
U- = 200
U+ = 180
IA = (180/200).100
IA= 0,9/100 = 90%
U 200DO amostra tratada = U+
Índice de Avidez = IA
U- = 200
U+ = 38
IA = (38/200).100
IA= 0,19/100 = 19%
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PRINCIPLE OF THE ASSAY
The assay is a competitive test based on the use of polystyrene microwells coated with mouse
monoclonal antibody to HAV and an enzyme tracer containing horseradish peroxidase-labelled
mouse monoclonal antibody to HAV.
In the assay procedure, patient specimens or controls and HAV contained in the neutralizing
solution are incubated with incubation buffer in antibody-coated microwells. If anti-HAV is
present in a specimen or control, it competes with the antibody coated on the microwell for thep p , p y
HAV. Excess sample, unbound HAV, and soluble HAV/anti-HAV complexes are removed by a
wash step, and the enzyme tracer is then added to the microwells and allowed to incubate.
The enzyme tracer binds to any antigen-antibody complexes present in the microwells. The
quantity of enzyme tracer that binds to the solid phase via HAV and the consequent enzyme
activity are inversely indicative of the anti-HAV antibodies present in the specimen or control.
Excess enzyme tracer is removed by a wash step, and a chromogen/substrate solution is
added to the microwells and allowed to incubate. If a sample does not contain anti-HAV, the
bound enzyme (horseradish peroxidase) chemically reduces the substrate peroxide, which
concurrently oxidizes the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) to a blue colour (650 nm).
Th bl l ll (4 0 ) f ddi i f h l i If lThe blue colour turns to yellow (450 nm) after addition of the stop solution. If a sample
contains anti-HAV, the microwell will have less colour after the chromogen/substrate solution is
added. The well will remain less coloured after the stop solution is added. Colour intensity,
which is measured spectrophotometrically, is inversely indicative of the presence of anti-HAV.
Absorbance value readings for patient specimens are compared to a cut-off value determined
from the mean of the calibrators.
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PRINCÍPIO DO ENSAIO
Este teste é um ensaio competitivo baseado na utilização de poços de poliestireno revestidos
com anticorpo monoclonal de ratinho anti-HAV e dum conjugado enzimático, constituído por
anticorpo monoclonal de ratinho anti-HAV conjugado com peroxidase de rábano.
No ensaio, as amostras ou os controlos e o HAV contido na solução de neutralização são
incubados com o tampãode incubação nos poços revestidos com anticorpo. Se existirem
anticorpos anti-HAV numa amostra ou num controlo, estes competem com o anticorpo quep , p p q
reveste o poço para o HAV. A amostra em excesso, o HAV livre e os complexos solúveis entre
HAV e anti-HAV são removidos por um ciclo de lavagem e o conjugado enzimático é
adicionado aos poços e deixado a incubar. O conjugado enzimático liga-se a qualquer
complexo antigénio-anticorpo presente nos poços. A quantidade de conjugado enzimático
ligado na fase sólida através do HAV e a consequente actividade enzimática indicam de
maneira inversamente proporcional os anticorpos totais anti-HAV presentes na amostra ou no
controlo. O conjugado enzimático em excesso é removido por um ciclo de lavagem e uma
solução de cromogénio/substrato é adicionada aos poços e deixada a incubar. Se uma
amostra não contiver os anticorpos anti-HAV, a enzima ligada (peroxidase de rábano) reduz
i i b ó id id é i ilb idiquimicamente o substrato peróxido, que, por sua vez, oxida o cromogénio tetrametilbenzidina
(TMB) para uma cor azul (650 nm). A cor azul transforma-se em amarelo (450 nm) depois da
adição da solução de paragem. Se uma amostra contiver os anticorpos anti-HAV, o poço é de
cor menos intensa depois de adicionar a solução de cromogénio/substrato ou a solução de
paragem. A intensidade da coloração, medida por um espectrofotómetro, indica de maneira
inversamente proporcional
a presença de anticorpos anti-HAV. As leituras do valor de absorvância para amostras são
comparadas com um valor limite determinado com base na absorvância média do calibrador.
 COMPOSIÇÃO E PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
 a) REAGENTES ESPECÍFICOS DO DISPOSITIVO
 4.1. Tiras sensibilizadas
 Os poços são revestidos com anticorpo anti‐HAV (monoclonal de ratinho). As tiras estão prontas a usar e devem ser armazenadas a 2‐
8°C.
 Deixe as tiras sensibilizadas à temperatura ambiente antes de abrir a embalagem para evitar condensação de água nos poços. Coloque 
as tiras não utilizadas na embalagem, feche hermeticamente e mantenha a 2‐8°C.
 4.2. Conjugado enzimático (50x)
 O frasco contém 0,5 mL de anticorpo anti‐HAV (monoclonal de ratinho), conjugado com peroxidase de rábano (HRP), tampão, 
albumina sérica bovina, estabilizantes e conservantes. Antes de usar, dilua a solução a 1:50 com o diluente do conjugado (4.6) (ex. 100 
μL de conjugado + 4,9 mL de diluente). O conjugado enzimático diluído é estável durante uma semana útil quando utilizado oito
 horas por dia à temperatura ambiente e conservado durante a noite a 2‐8°C.
 4.3. Calibrador a 20 mUI/mL
 O frasco contém 2 mL de soro/plasma humano contendo anticorpos anti‐HAV, soro bovino fetal e conservantes. A concentração do 
calibrador é de 20 mUI/mL (referenciada ao Segundo Padrão Internacional de Imunoglobulina Anti‐Hepatite A da Organização 
Mundial de Saúde, 1998). O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2‐8°C.
 4.4. Controlo negativo
 O frasco contém 2,5 mL de soro/plasma humano não reactivo para anticorpos anti‐HAV e conservantes. O reagente está pronto a usar
e deve ser armazenado a 2‐8°C. Se foram realizados rotineiramente numerosos testes quantitativos, um frasco de controlo
 negativo pode ser fornecido separadamente a pedido (cód. P001782).
 4.5. Controlo positivo
 O frasco contém 2 mL de soro/plasma humano reactivo para anticorpos anti‐HAV, soro bovino fetal e conservantes. O reagente está p p p g
pronto a usar e deve ser armazenado a 2‐8°C.
 4.6. Diluente do conjugado
 O frasco contém 14,7 mL de soro/plasma humano não reactivo para anticorpos anti‐HAV, soro bovino fetal, tampão e conservantes. O
reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2‐8°C. A solução é utilizada para diluir o conjugado enzimático (4.2).
 4.7. Solução de neutralização (HAV)
 O frasco contém 8 mL de HAV humano inactivado por formaldeído, soro/plasma humano não reactivo para anticorpos anti‐HAV, 
albumina sérica bovina, tampão e estabilizantes. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2‐8°C.
 4.8. Tampão de incubação
 O frasco contém 8 mL de IgG murina não específica, tampão, estabilizantes, conservantes
 e um corante azul inerte. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a
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 Ajuste a temperatura da câmara húmida a 37° ± 1°C.
 1. Distribua 50 μL de tampão de incubação em todos os poços, excepto no branco. Distribua 50 μL de calibrador a 20 
mUI/mL, controlo negativo, controlo positivo e amostras nos respectivos poços. Após a adição de calibradores, controlos 
ou amostras, a cor do tampão de incubação torna‐se verde ou azul‐escura. Distribua 50 μL de solução de neutralização em todos 
os poços, excepto no branco.
 2. Aplique o adesivo autocolante para evitar evaporação. Bata devagarinho nos poços de reacção para eliminar qualquer bolha de ar no 
líquido.
 3. Incube durante duas horas ± 10 min a 37° ± 1°C em câmara húmida.
 4. Prepare a solução de conjugado enzimático diluído (4.2 + 4.6) antes do final da primeira
 incubação.
 5. Quando completar a incubação, remova e elimine o adesivo autocolante e lave as tiras com um equipamento automático ou semi‐
automático adequado: aspire o líquido e lave os poços cinco vezes com um volume de tampão de lavagem variável entre
 0,30 e 0,37 mL. Evite trasbordamentos dos poços de reacção. Independentemente da utilização dum lavador automático ou semi‐
automático, o tempo de espera entre cada ciclo de lavagem deve ser de 30 segundos. Após a lavagem, inverta as tiras sobre um papel 
absorvente e bata devagarinho para remover o excesso de líquido dos poços. Deixe as tiras invertidas sobre o papel até
 à distribuição do reagente seguinte para evitar evaporação.
 6. Distribua 100 μL de conjugado enzimático diluído em todos os poços, excepto no
 branco. Repita a etapa 2.
 7. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C em câmara húmida.
 8. Repita a etapa 5.
 9. Distribua 100 μL de cromogénio/substrato em todos os poços.
 10. Incube durante 30 ± 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz intensa.
 11. Distribua 100 μL de solução de paragem em todos os poços na mesma ordem usada para dispensar o cromogénio/substrato e 
com os mesmos intervalos de tempo.
 12. Meça a absorvância da solução contida em cada poço a 450/630 nm dentro de uma hora após a adição da solução de 
paragem.
 Quando são utilizados os equipamentos adequados, os valores de absorvância são fornecidos em automático, ao seleccionar o 
protocolo correcto. Quando um fotómetro de leitura vertical diferente é utilizado, calibre o instrumento com o poço do branco, leia 
as absorvâncias do conteúdo dos poços com os comprimentos de onda de 450/630 nm e subtraia o valor da absorvância a 630 nm do
valor da absorvância a 450 nm para cada controlo e amostra.