Meios-de-cultura-usados-no-laboratório-e-colorações

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Preparo de Materiais em microbiologia,Meios 
de cultura usados no laboratório, técnicas de 
semeadura e Colorações
Prof (a) Dr Luciana Debortoli de Carvalho
Preparo de materiais
Meios de Cultura
• O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura
utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É
importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura
e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material
• Agar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise,
nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de
fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de
hemófilos e outros fastidiosos
Meios de Cultura
• Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de
colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactérias,
Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas.
Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N.
meningitidis e N. gonorrhoeae.
Meios de Cultura
• Agar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da 
grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em 
CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se 
observar halos esverdeados com colônias alfa- hemolíticas. À base do 
meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura 
alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, 
compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos 
exigentes.
Meios de Cultura
• ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e 
quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de 
eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus.
• Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram 
negativos e leveduras.
INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: azul claro.
• Colônias lactose positiva: cor amarela.
• Colônias lactose negativa: cor azul.
Meios de Cultura
• Agar MacConkey (MC) – meio seletivo para Gram negativo e diferencial
para a utilização de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de
microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e
estafilococos.
• Lactose positiva – coloração avermelhada
• Lactose negativa – coloração inalterada
• Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e
Bacillus
• Ágar Salmonela-Shigella (SS) – meio seletivo para Salmonela e Shigella e
diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de
H2S (coloração negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante
e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos.
Meios de Cultura
Meio de Rugai
Este meio é utilizado para identificação presuntiva das
principais espécies de Enterobactérias. Sua finalidade
principal é a triagem bioquímica de colônias isoladas nos
meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidase-
negativa. Em um único tubo a leitura é possível verificar 9
reações: motilidade da bactéria indicado pela turvação da
lisina na base, lisina descarboxilase, fermentação da glicose
em profundidade e da sacarose na superfície do meio,
produção de gás sulfídrico (H2S), gás em glicose, utilização
do aminoácido L-triptofano (desaminação), hidrólise da
uréia e no tampão do tubo, um desenvolvimento de
coloração avermelhada que indica a formação de indol.
Meio IAL
(Pessoa e Silva)
Identificação presuntiva
LÖWENSTEIN JENSEN
• A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo
crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste
de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis).
INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: verde claro
• Positivo: Crescimento de colônias amarelas
• Negativo: ausência de crescimento.
TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE 
MICRORGANISMOS
• Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura
(colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros que se encontram no
mesmo material).
• Finalidades do isolamento: Identificação de um microrganismo. A simples observação de
caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos
microrganismos. Para isto, lançamos mão da análise de uma série de características destes,
como: características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas
características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar.
• Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um
material contaminado qualquer.
• Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro.
TÉCNICAS DE SEMEADURA
• Métodos de Isolamento e Identificação
• A identificação da maioria dos microrganismos depende de uma completa 
descrição de suas características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e 
antigênicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado 
faz parte de uma população mista, é indispensável o seu isolamento, no 
sentido de obtenção de cultura pura. 
Métodos de Inoculação
1. Semeadura em Meio Sólidos
• 1.1. Semeadura em Tubos de Ensaio (em 
meios inclinados) – Esgotamento de alça
• 1.1.1. Técnica utilizada para obtenção de 
crescimento bacteriano e/ou para a 
observação de propriedades bioquímicas da 
bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da 
base do meio para a extremidade do mesmo 
(pode também ser chamada de estriamento). 
Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica do esgotamento 
(Ex. meio de cultura: TSI)
Métodos de Inoculação
• 1.1.2. A semeadura também pode ser
realizada da base para a extremidade do
meio, de forma uniforme. Esta técnica é
realizada para que haja crescimento
bacteriano, bem como poderemos utilizá-la
para observar funções metabólicas de
algumas bactérias.
Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica 
supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons)
+ -
Métodos de Inoculação
• 1.1.3. Em Picada: Esta técnica de semeadura é utilizada para que se
possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos
(bactérias) que são submetidas a análise microbiológica.
Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a técnica em picada. No 
tubo à esquerda, observamos o momento da picada que é realizada com o auxílio de uma 
agulha de semeadura e à direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de 
cultura: SIM).
Métodos de Inoculação
• 1.2. Semeadura em Placas de Petri (em superfície): O material a ser
semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o
isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície
de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto
maior o número, menor possibilidade de isolamento e maior
probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a
partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina
estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada.
Métodos de Inoculação
Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a técnica de estrias múltiplas,
onde a alça deverá ser deslizada sobre a região onde há um inóculo bacteriano e logo depois
deve ser passada na superfície da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG,
visando o isolamento bacteriano.
1.2.1. Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em
espalhar o material com o auxílio de uma alça
bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o
esgotamento do material, de modo a obter-se um
perfeito isolamentodas bactérias existentes na
amostra. Quando o material é muito denso, a alça
deverá ser flambada.
Métodos de Inoculação
• 1.2.2. Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou
colônias isoladas (após diluição) utiliza-se o método de “espalhamento” em placa. Consiste em
espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para
obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição),
fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nesta técnica. Deve-se ter
o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura.
Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a
alça em toda a superfície rodando a placa.
Alça de drigalski
Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos): 
• O inóculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluição da cultura em meio
sólido é feito da seguinte maneira:
• Retiramos o inóculo do tubo com a alça já flambada e fria.
• Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa .
• Colocamos o inóculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir através de
estriamento (que poderá ser contínuo ou descontínuo). O estriamento poderá se feito de
maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a alça duas vezes no mesmo
local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na alça.
Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local,
deixando ali mais bactérias, o que dificultará o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento,
após termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a
alça, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a alça na última
estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando-
a a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo.
• Flambar a alça utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.
Técnica para semeadura em meios líquidos: 
• Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar
esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do
operador).
• Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado
(que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA
DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO.
• Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria.
• Flambar novamente a boca do tubo e fechar.
• Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar.
• Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar.
• Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.
Técnica para semeadura em meios semi-sólidos
• Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquido com o auxílio de uma
alça em agulha já flambada e fria.
• Abrir o tubo que contém o meio semi-sólido e semear o microrganismo
através de picada até mais ou menos 1/3 ou ½ do tubo.
• Fechar o tubo, identificar e levar para incubação.
• Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.
Coloração de GRAM
Alça 
Bactérias isolada Esfregaço
Fixação do 
esfregaço pelo 
calor
Passar a lamina c/ 
esfregaço por 3x 
sob a chama.
Proceder a coloração 
de GRAM
1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min.
2. Escorrer excesso do corante e lavar.
3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min.
4. Escorrer excesso do corante e lavar.
5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s.
6. Escorrer excesso do corante e lavar.
7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s.
8 . Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar.
Técnica de GRAM
Fucsina
Coloração de Ziehl-Neelsen
Meio de cultura 
para 
Micobactérias
Colônias de 
Micobactérias
Esfregaço
Fixação do 
esfregaço pelo 
calor
Passar a lamina c/ 
esfregaço por 3x 
sob a chama.
Usar capela de fluxo 
laminar.
Proceder a coloração 
de Ziehl-Neelsen
a) Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer até a emissão de
vapores (Não deixar o corante secar). Esperar 5 minutos;
b) Lavar com água corrente;
c) Descorar com álcool (97%), ácido clorídrico (1%);
d) Lavar em água corrente;
e) Corar com azul de metileno por 1 minuto;
f) Lavar e secar;
g) Observar ao microscópio as lâminas coradas;
h) Como se apresentam os BAAR.
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