Unidade III (peptídeos e proteínas)

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Disciplina: Introdução à Bioquímica
Professor: Juan Carlos Alvarez-Pizarro 
Unidade III 
Peptídeos e proteínas 
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Peptídeos e proteínas
São polímeros lineares formados por aminoácidos, os quais são ligados por condensação de um grupo carboxila ligado ao Cα de um aminoácido com o grupo amino ligado ao Cα de outro aminoácido.
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Propriedades ácido-básicas de peptídeos
Como os grupamentos amino e carboxílicos e outros presentes na cadeia lateral são ionizáveis , estes conferem carga elétrica as proteínas e condicionam a sua migração em um campo elétrico.
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Funções de peptídeos 
Muitos peptídeos exercem seus efeitos biológicos em concentrações muito baixas. Exemplo:
Ocitocina (9 resíduos), secretada pela hipófise posterior e capaz de estimular concentrações uterinas.
Fator liberador de tirotropina (3 resíduos, Glu-His-Pro), formado no hipotálamo e capaz de estimular a liberação de tirotropina.
Venenos de cogumelo (amanitina) e antibióticos.
Ester metílico de L-aspartil-L-fenilalanina (aspartame).
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Proteínas
Têm uma massa molecular superior a 10.000 Da.
Podem ser constituídas por uma única cadeia polipeptídica (monoméricas) ou por dois ou mais polipeptídeos unidos não covalentemente (proteínas multisubunidade). 
Proteínas oligoméricas, quando duas das cadeias forem idênticas, cada uma sendo chamada de protômeros . Exemplo: a hemoglobina é considerada um tetrâmero ou dímero de protômeros.
Quando as cadeias polipeptídicas são unidas covalentemente (por pontes dissulfeto), os polipeptídeos individuais são considerados simplesmente como cadeias. Exemplo: a insulina.
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Proteínas simples contêm somente resíduos de aminoácidos. Exemplo: ribonuclease A e quimiotripsina.
Proteínas conjugadas contêm grupos químicos associados permanentemente aos aminoácidos:
Grupo prostético é a parte não aminoacídica da proteína e são classificadas com base na sua natureza química, podendo ser: 
			lipoproteínas (lipídeos), 
			glicoproteínas (carboidratos),
			fosfoproteínas (grupos fosfato),
			hemeproteínas (heme, porfirina férica),
			flavoproteínas (nucleotídeos de flavina),
			metaloproteínas (Fe, Zn, Ca, Mo, Cu).
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Métodos para o isolamento e caracterização de proteínas
Os métodos baseiam-se nas propriedades das proteínas tais como tamanho, carga elétrica, propriedades de ligação, solubilidade, entre outros. Estas variam de proteína para proteína.
O primeiro passo para o isolamento de uma proteína específica é a preparação de um extrato bruto.
Este é submetido a tratamentos que separam as proteínas em diferentes frações (fracionamento).
Inicialmente, a purificação de proteínas utiliza as diferenças na solubilidade proteica ( função complexa do pH, [sais], temperatura). 
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Precipitação por sais 
A solubilidade de proteínas é reduzida em elevadas concentrações salinas. A adição de certos sais em concentrações adequadas pode precipitar seletivamente algumas proteínas, enquanto outras permanecem em solução. Ex: ((NH4)2SO4). 
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Diálise
É um processo que separa proteínas de pequenos solutos (como sais), se aproveitando do maior tamanho das proteínas. Pode, por exemplo, ser utilizada após a precipitação com sulfato de amônio. 
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As frações proteicas parcialmente purificadas podem, em seguida, ser utilizadas em métodos de fracionamento que utilizam cromatografia em coluna.
As colunas cromatográficas são preenchidas com um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas (fase estacionária) e pelo qual é percolada uma solução tampão (fase móvel).
Tipos de cromatografia
Exclusão molecular – separa as proteínas de acordo com o seu tamanho.
Troca iônica – explora as diferenças no sinal e magnitude de carga elétrica das proteínas.
Afinidade – tem como base a afinidade de ligação. 
Cromatografia de coluna
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Cromatografia de exclusão molecular
A fase solida consiste em grânulos de polímeros que apresentam ligações cruzadas, com poros e cavidades que variam com o tipo de matriz.
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Cromatografia de troca iônica
Existem resinas de troca catiônica (contendo grupos aniônicos) e de troca aniônica (contendo grupos catiônicos).
A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH, que determina o estado de ionização da molécula e pela concentração de íons livres.
A separação é otimizada pela mudança gradual no pH ou concentração de sais. 
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Cromatografia de afinidade
Os grânulos na coluna têm um grupo químico covalentemente ligado, chamado ligante. Qualquer proteína na mistura com afinidade pelo ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada. 
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É um método analítico que permite verificar o grau de purificação de uma proteína e fornece informação sobre sua massa molecular, ponto isoelétrico e número de sub-unidades.
O método eletroforético baseia-se na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico a uma velocidade determinada pela sua relação carga massa.
	Se duas moléculas têm a mesma massa e forma, aquela com uma carga liquida superior migrara mais rápido para um dos eletrodos.
A eletroforese de proteínas é realizada em géis de poliacrilamida que possuem poros de dimensões moleculares, cujos tamanhos podem ser ajustados , de acordo com a concentração dos monômeros.
Comunmente, os métodos usados para estimar a pureza e a massa molecular das proteínas empregam o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) 
Eletroforese
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Eletroforese
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Estimativa da massa molecular de uma proteína
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É um tipo de eletroforese empregado para a determinação do ponto isoelétrico (pI) de uma proteína.
Focalização isoelétrica
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Eletroforese bidimensional (2D)
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Tabela de purificação de uma proteína
Para a purificação de uma proteína é essencial conhecer um método que permita sua detecção e quantificação específica em cada uma das etapas do processo.
Ex.: para enzimas, sua quantidade em uma dada solução ou extrato de tecido pode ser medida ou testada em termos do efeito catalítico que a enzima produz. 
	1 unidade de atividade = quantidade de enzima que promove a transformação de 1,0 mmol de substrato por minuto a 25°C. 
	atividade – refere ao total de unidades de uma enzima em solução.
	Atividade específica = refere-se ao número total de unidades da enzima por miligrama de proteína.
A atividade específica é uma medida da pureza da enzima, aumenta durante a purificação de uma enzima e torna-se máxima e constante quando a enzima está pura. 
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Tabela de purificação para uma enzima hipotética
A atividade e o total de proteína decrescem a cada passo de purificação. A atividade decresce porque há perda devido a inativação ou a interações não ideais com materiais cromatográficos. O total de proteína decresce porque o objetivo é a remoção do máximo possível de proteínas não específicas.
Uma proteína é geralmente considerada pura quando etapas de purificação adicionais não levam ao aumento da AE e quando somente uma única espécie proteica pode ser detectada por eletroforese.