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1 TRANSCRIÇÃO DO DNA: Síntese do mRNA •Gene (Unidades transcricionais) •Tipos de RNA •Tipos de RNA polimerase •Tipos de RNA polimerase DNA‐dependente •Transcrição em Procariotos •Transcrição em Eucariotos •Mecanismos de controle da Exp. Gênica 1959/60‐ Jacob Monod e Gross1959/60‐ Jacob, Monod e Gross Isolaram o ácido ribonucleico responsável pelo direcionamento da síntese de proteínas nos ribossomos e propuseram o nome RNA mensageiro (mRNA) para esta molécula. O mRNA representa apenas cerca de 2% do RNA total em relação aos outros tipos de RNA (rRNA e tRNA). 2 DEFINIÇÕES DE GENE Genética – Mendeliana Porção do cromossoma que determina ou afeta um único caráter (fenótipo), como por exemplo a cor dos olhos. Molec lar Beadle e Tat m 1940Molecular – Beadle e Tatum, 1940 Segmento de material genético que determina ou codifica uma enzima (conceito obtido a partir de seus estudos sobre o metabolismo de fungo N.crassa) A B C D E Segundo a proposta de Beadle e Tatum, 1gene codifica uma enzima (proteína). E1 E2 E3 E4 x Segundo a proposta de Beadle e Tatum, 1gene codifica uma enzima (proteína). Este conceito vem sendo atualizado e a definição atual é a seguinte: ‐ Um gene codifica pelo menos uma cadeia polipeptídica (“Splicing alternativo”), um tRNA, ou um rRNA, como produto final em Eucariotos. ‐No entanto, uma cadeia polipeptídica pode ser codificada por dois genes separados, gerada a partir de “Protein splicing” ou “mRNA trans‐splicing” ESTRUTURA GERAL DE UM GENE 5´... ...3´ PROMOTOR CODIFICA RNA ...5´3´... ‐10 +1 10 Downstream Upstream 3 UNIDADES TRANSCRICIONAIS DE: PROCARIOTO (policistrônica) EUCARIOTO (monocistrônica) Figure 9‐1 PROCARIOTOS x EUCARIOTOS: ORGANIZAÇÃO GÊNICA, TRANSCRIÇAO E TRADUÇAO 4 Estrutura do Ácido Ribonucleico ‐ RNA Ligação fosfodiester entre os nucleotídeos. Ligação entre P ligado ao C 5 do nucleotídeo que chega com a OH ligada ao 5’ g g C 3 do nucleotídeo da cadeia. 5’ 3 ‘ 3’ 5 Small nuclear RNA (snRNA) Núcleo Processamento de mRNA TIPOS DE RNA POLIMERASES RNA polimerase DNA dependente: • Envolvida na transcrição do DNA. • Utiliza nucleotídeos tri‐fosfatados (NTP) como substrato e depende de uma fita molde antiparalela. Catalisa o ataque nucleofílico da hidroxila do carbono 3 da ribose p q sobre o fosfato alfa do nucleotídeo a ser incorporado na cadeia de polinucleotídeo. RNA polimerase RNA dependente: • Envolvida na replicação do genoma de alguns vírus RNA. • Catalisa o ataque nucleofílico da hidroxila do carbono 3 da ribose sobre o fosfato alfa do nucleotídeo a ser incorporado na cadeia de polinucleotídeo. • Utiliza NTP como substrato e depende de uma fita molde antiparalela. Polinucleotídeo fosforilase (a primeira nucleotídeo polimerase isolada e caracterizada ‐ descrita por Manago e Ochoa) • Catalisa a seguinte reação reversível: • (NMP)n + NDP (NMP)n+1 + Pi • Não depende de molde e a composição do polinucleotídeo depende da composição de NDP do meio. 6 Tipos de RNAs polimerases – DNA dependente Compostas de subunidades (multiméricas) PROCARIOTOS RNA Polimerase (sintetiza todos os RNAs) EUCARIOTOS RNA Polimerase I (Nucléolo) : Pré rRNAs ‐( ) rRNAs 18S, 5,8S e 28S RNA Polimerase II (Nucloplasma): hnRNAs ‐ mRNA RNA Polimerase III (Nucleoplasma): tRNA e snRNAs Experimento de Volkin e Astrachan, 1957 Experimento de “Pulse‐chase” para marcação das moléculas de RNA: células incubadas com uracila radioativa, seguida de incubação com uracila não‐radioativa Molécula de RNA se move do núcleo para o citoplasma. 7 TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS INÍCIO, ALONGAMENTO E TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO - RESUMO - 8 ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO PROMOTORESPRO CARIOTOS TRANSCRIÇAO EM PROCARIOTOS 9 Procariotos ‐ Iniciação 5’ 3’ (DNA +)5 3 (DNA +) 5’ 5’ 3’ 3’ 10 ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO RNA POLIMERASE ENZIMA RESPONSÁVEL PELA SÍNTESE DE RNA Direção polimerização 5’ → 3’ Substratos: DNA molde antiparalela e NTP Holoenzima Composta de subunidades 11 Procariotos – Alongamento (Parte 1) Procariotos – Alongamento (Parte 2) DNA Toposimerase II DNA Toposimerase I 12 ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO Términação dependente de t í ô (h li )proteína rô (helicase) Proteína rô reconhece sítio rut no RNA e promove o desligamento da RNA Poldesligamento da RNA Pol 13 Procariotos – Terminação independente da proteína Rô Procarioto: ausência de MN (acoplamento Transcrição/Tradução) 14 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS Eucariotos ‐Transcrição Genes interrompidos (introns e exons) Presença de MN (proteção de mRNA) 15 TRANSCRIÇÃO DO DNA PELA RNA‐Pol II ‐ RESUMO ‐ ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM EUOCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾PROCESSAMENTO DO RNA 16 Eucariotos ‐ Iniciação Promotores E ió iEucarióticos Necessidade de FatoresNecessidade de Fatores gerais de início da trasncrição TFI TFII TFIII TATA Binding Protein Atividade Helicase e Proteína QuinaseMontagem do complexo g p de início da transcrição com a RNA‐Pol II 17 Modelo de cooperatividade para o complexo de início da transcrição no promotor TTR em hepatócitos ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾ PROCESSAMENTO DO RNA 18 Eucariotos – Alongamento (Parte 1) Eucariotos – Alongamento (Parte 2) DNA Toposimerases I e II DNA Toposimerase I e II 19 INIBIDORES DA TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS E EUCARIOTOS Agentes intercalantes INIBIDORES DA TRANSCRIÇÃO Amanita phalloides Alfa-Amanitina Inibidor seletivo da RNA pol II eucariótica Rifampicina Inibidor seletivo da RNA Pol procariótica. Composto semi-sintético derivado da Amycolatopsis rifamycinica (também conhecida como Amycolatopsis mediterranei and Streptomyces mediterranei).[ 20 ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNAETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO¾ ALONGAMENTO ¾ PROCESSAMENTO DO RNA Processamento do hnRNA ‐ Resumo 21 ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO RNA ¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5` ¾“SPLICING” ¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons) ¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3` ¾ Eucariotos – Processamento da extremidade 5’ do hnRNA “Heterogenous Nuclear RNA”: Capeamento 22 ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO RNA ¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5` ¾“SPLICING” ¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons) ¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3` ¾ Eucariotos – “Splicing” do hnRNA Remoção dos Íntrons e ligação covalente dos Éxons Spliceossomo (U1,U2,U3,U4,U5) 23 ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO RNA ¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5` ¾“SPLICING” ¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons) ¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3` 24 Eucariotos – Processamento da extremidade 3’ do hnRNA “Heterogenous Nuclear RNA”: Poliadenilação COMPARAÇÃO ENTRE mRNAs PROCARIÓTICOS E EUCARIÓTICOS
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