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VIROLOGÍA VETERINARIA In: A Concise Review of Veterinary Virology, Carter G.R., Wise D.J. and Flores E.F. (Eds.). International Veterinary Information Service, Ithaca NY (www.ivis.org), Last updated: 8-Feb-2005; A3404.0205.ES Prefacio G.R. Carter1, D.J. Wise2 and E. F. Flores3 1Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA.2Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA.3Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. Traducido por: I. Revah, International Veterinary Information Service, Ithaca NY, USA . (15-Mar-2005). El objetivo de este libro es el proporcionar un tratado general y conciso sobre virología para los estudiantes veterinarios y los veterinarios. Se ha puesto particular énfasis en las características que son relevantes cada día en la clínica del veterinario. Los asistentes y técnicos veterinarios también encontrarán el libro accesible y útil. El origen de este libro es la sección de virología preparada por A. Wayne Roberts, en la quinta edición del libro "Essentials of Veterinary Microbiology". Este libro fue escogido por ser conciso y por hacer énfasis en la virología clínica. En este nuevo libro se mantiene lo conciso y el énfasis práctico, sin embargo, las enfermedades virales son presentadas por familias virales en vez de hacerlo por "huésped/sistema". Este enfoque taxonómico tiene la ventaja de incluir juntas a aquellas enfermedades que tienen un número de características básicas y patogénicas similares. Un ejemplo es la semejanza de las enfermedades causadas por algunos parvovirus. La parte introductoria del libro presenta todo el conocimiento significativo clásico, así como el más reciente, sobre la virología básica, incluyendo la taxonomía y las técnicas biológicas moleculares más recientes. El uso de estas últimas se destaca particularmente en la sección de patogenia bajo diagnóstico de laboratorio. Se ha intentado incluir información epidemiológica, clínica y patológica suficiente, más no excesiva, para proporcionar un recuento integral e interesante de enfermedades importantes. Para evitar el posible tedio de la recitación de hechos necesarios, además de ejercicios de laboratorio, los instructores pueden incluir casos clínicos para estudio e informes reales sobre los brotes de enfermedades virales. En el interés de mantener la brevedad hemos omitido todas las referencias. La disponibilidad de innumerables referencias en el Internet hace la inclusión de referencias en libros de esta clase innecesaria. Estamos muy agradecidos con A. Wayne Roberts, de la Universidad de Georgia, que generosamente nos permitió usar libremente su material de la 5ta edición del libro Essentials of Veterinary Microbiology. Esto nos facilitó mucho la preparación de este volumen. G.R. Carter D.J. Wise E. Furtado Flores Características generales, estructura y taxonomía viral D.J. Wise1, G.R. Carter2 and E. F. Flores3 1Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA.2Virginia- Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA.3Department of Veterinary Preventive Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS Brazil. Traducido por: A. T. Pérez Méndez, Biotecnología Veterinaria de Puebla, S.A de C.V., Tehuacán, Puebla, Mexico. (15-Mar-2005). Indice • Generalidades • Estructura viral • Taxonomía viral • Glosario Generalidades • Los virus son mucho más pequeños que las células procariontes o eucariontes • En general, a diferencia de las células, los virus tienen una estructura simple y estática • No tienen un sistema metabólico propio. • Dependen de la maquinaria de la célula hospedera para su replicación (parásitos intracelulares estrictos) • Tienen genomas de ADN o ARN , pero carecen de ribosomas y otros factores necesarios para la traducción de proteínas. Así pues, dependen de la célula hospedera para la producción de proteínas virales. • Sus genomas codifican información mínima para asegurar lo siguiente: 1) replicación del genoma y empaquetamiento; 2) producción de proteínas virales; y 3) subvertir funciones celulares para permitir la producción de viriones. • Algunos virus (bacteriófagos) infectan células procariontes, mientras que otros infectan células eucariontes. • Algunos virus destruyen las células, produciendo enfermedad; otros persisten en estado latente o persistente en la célula infectada; y otros pueden causar transformación maligna de las células a las que infecta. Estructura viral Los virus se componen, al menos, de un genoma de ácido nucleico ADN o ARN y una cubierta de proteínas. Muchos virus tienen además una membrana externa llamada envoltura. • La cubierta proteica o cápside de un virión (virus completamente ensamblado o partícula viral) está compuesta de múltiples copias de uno o más tipos de proteínas. Estas proteínas se ensamblan, formando unidades estructurales llamadas capsómeros. • Al ácido nucleico más la cubierta o cápside de una partícula viral es frecuentemente llamada nucleocápside • Los virus más simples son aquellos que carecen de envoltura y tienen ADN o ARN de cadena sencilla (Fig. 1.1). • Los virus envueltos contienen una membrana externa que rodea a la nucleocápside (Fig.1.2). La envoltura viral se deriva de membranas de la célula hospedera (nuclear, de aparato de Golgi, de retículo endoplásmico o membrana plasmática). Tal como estas membranas, la envoltura viral se compone de una bicapa lipídica con proteínas insertadas en ella, proteínas que son codificadas por el virus. • Algunos virus, como los bacteriófagos, tienen colas proteicas complejas que se requieren para el anclaje y/o la penetración del ADN viral en la célula hospedera susceptible. Figura 1-1. Virión no envuelto con cápside icosahédrica. El ácido nucleico está en el interior de la cápside. Ilustración cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Figura 1-2. Virión envuelto con cápside helicoidal. El ácido nucleico se localiza en el interior del virión como indica la línea punteada en forma de espiral. Las líneas en la superficie exterior de la envoltura representan espículas glicoprotéicas. Ilustración cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Genoma viral El genoma viral está compuesto por ADN o ARN. Un virus no contienen ADN y ARN simultáneamente. El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus siglas en inglés) (parvovirus y circovirus), de doble cadena (ds por sus siglas en inglés) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos covalentemente ligados el uno al otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus, herpesvirus, parvovirus). El genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssADN cuyos extremos están covalentemente unidos uno al otro. Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayoría de estos son cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La mayoría de los virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza (monopartita) mientras que otros lo tienen dividido en 10 segmentos (reovirus), 7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos segmentos (arenavirus). En cuanto a ssARNs, hay dos posibilidades importantes de secuencia: • Si el ssARN funciona como mensajero para la traducción de proteínas (tiene la misma orientación que el mARN), se le llama sentido positivo. • En contraste, si el ARN viral es antisense (o complementario) a ese mARN - y entonces no puede ser traducido directamente - se dice que es sentido negativo.• En algunos virus (Arenavirus y Bunyavirus) se transcriben porciones del genoma de ARN, generando ARNs mensajeros que son entonces traducidos. La copia de estos mARNs (complementaria, supuestamente ARNs sentido negativo) puede ser también traducida. Este arreglo es único entre los virus, y se dice que es ambos sentidos (ambisense). Los genes contenidos dentro del genoma pueden codificar desde unos pocos productos génicos diferentes (Polyomavirus, 6 - 7 genes, 5000 nucleótidos de longitud) hasta más de 70 - 100 productos génicos diferentes (Herpesviridae, 60 a 120 genes, 120,000- 220,000 pares de bases de nucleótidos de longitud). En general, los genomas de los virus ARN son más pequeños, con un tamaño máximo de 30,000 nucleótidos como se ve en los Coronavirus. Una hipótesis para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer más errores que las polimerasas ADN. Así, la fidelidad de la replicación puede limitar el tamaño. En contraste, los genomas de virus de ADN pueden alcanzar un tamaño de hasta 300,000 nucleótidos, como se ve en algunas especies de Herpesvirus. La cápside La función de la cápside es proteger el genoma viral durante su transferencia de célula a célula. La cápside puede estar hecha de múltiples copias de una sola proteína o de una asociación de varias proteínas diferentes. Las cápsides hechas de múltiples copias de una sola proteína representan un buen ejemplo de economía, ya que un solo gene puede codificar los productos necesarios para cubrir con la cápside el genoma completo. • La cápside de un virus puede tener diferentes formas geométricas que son características de varias familias virales. Estas incluyen: o icosaédrico desnudo (picornavirus, polyomavirus); o envuelto (herpesvirus). Esta figura geométrica tiene varias caras triangulares y esquinas (ver Fig. 1.1); el número de caras y esquinas puede variar de acuerdo al número y tipo de asociación entre las proteínas estructurales (unidades). o estructura helicoidal, desnudo (virus del mosaico del tabaco) o envuelto (virus de la rabia), (ver Fig. 1.1 y Fig. 1.2). o complejos, que tienen una mezcla de arreglos (por ejemplo, bacteriófagos, virus de viruela). • Los virus varían en tamaño, desde los circovirus con 17 - 22 nm de diámetro, hasta los virus de viruela o poxvirus que alcanzan los 300 nm. Estos virus tienen forma de ladrillo u ovoide y son suficientemente grandes como para ser vistos con microscopio óptico, no como los otros virus para cuya visualización es necesario el uso de microscopio electrónico. • Se han utilizado varias técnicas para la visualización de los virus. La cristalografía de rayos X es un medio para determinar su estructura física, así como las dimensiones de las proteínas individuales y componentes virales. La información obtenida por esta técnica se usa luego para "construir" (un modelo) de la estructura total de la partícula viral. La microscopía electrónica se usa para generar información en torno a la forma general de los virus, y se usa también con fines diagnósticos a través de la detección de partículas virales en especimenes o muestras clínicas. En el capítulo 2 se describen con detalle los métodos para la visualización de viriones. Cinco formas estructurales básicas De acuerdo a su morfología básica, y tal como se mencionó anteriormente, hay cinco estructuras virales básicas diferentes. Estas formas, con ejemplos, se enlistan a continuación: • icosaédrico desnudo - adenovirus y picornavirus. • helicoidal desnudo - virus del mosaico del tabaco; no se conocen virus de humanos o de animales que tengan esta estructura. • icosaédrico envuelto - togavirus y flavivirus. • helicoidal envuelto - rhabdovirus y paramyxovirus. • complejos - bacteriófagos y virus de viruela. Envolturas virales La envoltura viral, característica de algunas familias virales, se deriva de membranas de la célula hospedera por protrusión de yemas, lo cual ocurre durante la liberación de viriones de la célula (infectada). Esta membrana es frecuentemente una porción de la membrana plasmática, sin embargo puede ser parte del aparato de Golgi, del retículo endoplásmico o de la membrana nuclear, dependiendo del tipo de virus y del compartimiento celular donde la replicación se lleva a cabo. Independientemente de su origen, la membrana se compone de una bicapa lipídica - de origen celular - con proteínas asociadas. Estas proteínas asociadas con la bicapa lipídica son principalmente de origen viral (codificadas por el virus) y son en su mayoría glicoproteínas. El número de proteínas virales en la envoltura puede variar desde una hasta más de diez, dependiendo del virus. Las glicoproteínas de la envoltura viral llevan a cabo varias funciones, incluyendo el anclaje inicial del virión a la célula blanco, penetración, fusión y diseminación de una célula a otra, entre otros. El anclaje del virión a la superficie celular requiere que la envoltura esté intacta y las glicoproteínas tengan su conformación nativa. Los fármacos antivirales están dirigidos contra las proteínas de la envoltura y pueden disminuir la habilidad del virus para anclarse e iniciar la infección, disminuyendo así la infectividad. El proceso de protrusión de yemas, y la consecuente adquisición de la envoltura por los viriones recién formados, puede o puede no resultar en la muerte de la célula hospedera. Si son liberados muchos viriones simultáneamente, la integridad de la membrana celular puede estar suficientemente comprometida como para conducir a la muerte celular. De manera alternativa, la liberación de los viriones puede ser lenta, resultando en una excreción crónica e infecciones persistentes. De hecho, a diferencia de la liberación de virus no envueltos, que se lleva a cabo principalmente a través de la lisis y muerte celular; el egreso de virus envueltos frecuentemente es compatible con la supervivencia de la célula. Por tanto, el fenómeno de protrusión de yemas provee de un medio de liberación viral sin conducir a la muerte celular. Proteínas Virales Hay dos tipos básicos de proteínas codificadas por los virus: estructurales y no estructurales. Las proteínas estructurales son aquellas que son parte de la estructura física del virión (cápside, envoltura) , mientras que las proteínas no estructurales se producen dentro de la célula infectada y juegan diferentes papeles en los pasos de replicación viral. El número de proteínas codificadas por los genomas virales varía enormemente, desde tan pocas como dos proteínas, hasta cientos de ellas. Típicamente las proteínas estructurales son aquellas que componen la cápside y que empaquetan el ácido nucleico del genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la cápside y la envoltura (el tegumento). Las proteínas que forman el tegumento también son proteínas estructurales. Las proteínas de la estructura externa de la cápside o envoltura son ligandos, que interactúan con receptores en la superficie de la célula blanco. Algunas de estas proteínas (glicoproteínas) se procesan en el lumen del retículo endoplásmico rugoso, donde se añaden oligosacáridos a la cadena polipeptídica. Estas proteínas son enviadas al aparato de Golgi, a las vesículas secretoras, y finalmente se fusionan con la membrana plasmática haciéndose presentes sobre la superficie de la célula infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las glicoproteínas de la envoltura juegan papeles en la mediación de la interacción entre los viriones y las células (anclaje, penetración, fusión, diseminación de una célula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos neutralizantes. Las proteínas no estructurales son principalmente, pero no exclusivamente, enzimas como aquellas asociadas con el proceso de transcripción del genoma, replicación yprocesamiento de proteínas. Un ejemplo de proteínas no estructurales es la trancriptasa reversa de los retrovirus, que hace copias de ADN a partir de un molde de ARN. Este paso es una característica importante de los retrovirus cuyo ARN necesita ser convertido a ADN para ser incorporado al cromosoma del hospedero. Algunos virus codifican varias proteínas no estructurales que juegan diversos papeles accesorios en la regulación de la expresión genética celular y viral, regulación de diferentes pasos del ciclo viral, neutralización de la defensa del hospedero, transformación celular, etcétera. Otros componentes virales Lípidos Los lípidos de los virus se derivan de las membranas celulares de la célula hospedera. Éstos son en su mayoría fosfolípidos (50 - 60%) y el resto es colesterol. Como consecuencia de que se derivan de la célula hospedera, su composición lipídica varía. La bicapa lipídica de la membrana de la célula hospedera que rodea al virión de los virus envueltos, también posee proteínas virales y glicoproteínas, como las espículas características de algunos virus envueltos. La composición lipídica global de los virus envueltos representa aproximadamente el 25 - 30% de su peso seco. El resto se divide entre la porción del ácido nucleico y la porción proteica. Carbohidratos Los carbohidratos virales están presentes típicamente como los residuos de oligosacáridos de las glicoproteínas, glicolípidos y mucopolisacáridos. La composición de los carbohidratos corresponde a aquella de la célula hospedera. Sin embargo las glicoproteínas frecuentemente tienen un enlace N- u O- glucosídico. Los carbohidratos virales se encuentran principalmente en la envoltura. Algunos de los virus más grandes y complejos contienen glicoproteínas internas o proteínas glicosiladas en la cápside. Taxonomía viral Los virus constituyen un grupo numeroso y heterogéneo. Se clasifican en categorías taxonómicas jerárquicas basadas en muchas características. La clasificación es dinámica ya que continuamente se van descubriendo nuevos virus y se acumula nueva información sobre virus ya conocidos. La clasificación y nomenclatura usadas en este libro estaba actualizada hasta el momento de ser escrito. Los cambios más recientes aparecen en informes del Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV por sus siglas en inglés) , séptima edición (Disponible en amazon.com). El esquema básico de clasificación jerárquica es: Orden - Familia - Subfamilia -Género - Especie - Cepa / Tipo. Ciertas características virales, referidas más adelante, definen cada una de estas categorías taxonómicas. Las Órdenes tienen el sufijo -virales, las familias tienen el sufijo -viridae, mientras que los géneros contienen el sufijo -virus. Una especie viral está constituida por un linaje replicante que ocupa un nicho ecológico, por ejemplo una enfermedad en particular. Los virus se clasifican en familias con base en muchas características. Una característica básica es el tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) y la morfología, esto es, el tamaño y forma del virión así como la presencia o ausencia de una envoltura. También se usan el rango de hospederos y las propiedades inmunológicas del virus (serotipos). También se usan en la clasificación las propiedades físicas y fisicoquímicas como masa molecular, densidad de flotación, inactivación térmica, estabilidad al pH y sensibilidad a varios solventes. Algunos aspectos importantes de la taxonomía actual de los virus son si su material genético es ADNA o ARN, si es de cadena sencilla o doble, la organización de su genoma y la presencia de ciertos genes. Todo lo anterior se utiliza para ubicar a los virus en órdenes o familias particulares. Por ejemplo, el orden Mononegavirales está compuesto por aquellos virus que poseen genoma de cadena sencilla de ARN con orientación negativa. Finalmente, la clasificación se basa en las macromoléculas producidas (proteínas estructurales y enzimas), propiedades antigénicas y propiedades biológicas (por ejemplo, acumulación de viriones en las células, infectividad, hemoaglutinación). Las Familias virales se enlistan en la tabla de contenidos bajo varias categorías de sus ácidos nucleicos. Las familias se presentan en el libro usando el mismo orden en el que aparecen en esta lista. La Tabla 1.1 proporciona información básica acerca de cada una de las principales categorías taxonómicas virales. Tabla 1.1. Clasificación y algunas características básicas de virus de vertebrados. Virus de ADN de cadena sencilla Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Circovirus Virus de la enfermedad del pico y la pluma Circoviridae Icosahédrica; 17-25 Gyrovirus Anemia infecciosa de los pollos Parvovirus Parvovirus canino y felino Erythrovirus Virus B19 Dependovirus Virus 2 Adeno-asociado Virus ADMV- like Virus de la enfermedad del visón de las Aleutianas Parvoviridae Icosahédrica; 18-26 Parvovirinae Virus BPV-like Parvovirus bovino Virus de ADN de cadena doble Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Orthopoxvirus Virus de la vacuna de la viruela Parapoxvirus Orf virus Avipoxvirus Virus de la viruela aviar Capripoxvirus Virus de la viruela de la oveja Leporipoxvirus Virus del myxoma Suipoxvirus Virus de la viruela del cerdo Molluscipox-virus Virus del molusco contagioso Poxviridae Compleja; 140-260 a 220-450 Cordopoxvirinae Yatapoxvirus Virus tumoral del mono de Yaba Simplexvirus Herpesvirus humano 1 Varicellovirus Herpesvirus humano 3 Herpesviridae Icosaédrica; 120-200 Alfaherpes-virinae Marek’s disease-like Gallid herpesvirus 2 Virus de ADN de cadena doble Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas viruses Infectious laryngo- tracheitis-like viruses Gallid herpesvirus 1 Cytomegalovirus Herpesvirus humano 5 Muromegalovirus Cytomegalovirus murino 1 Betaherpesvirinae Roseolovirus Herpesvirus humano 6 Lymphocryptovirus Virus Epstein-Barr Gammaherpesvirinae Rhadinovirus Herpesvirus ovino 2 Polyomaviridae Icosaédrica; 40-45 Polyomavirus Virus SV 40 Papillomaviridae Icosaédrica; 52-55 Papillomavirus Papilomavirus bovino 1 Mastadenovirus Adenovirus bovino Aviadenovirus Adenovirus aviar A Atadenovirus Adenovirus ovino D Adenoviridae Icosaédrica; 80- 110 Siadenovirus Virus de la enteritis hemorrágica del pavo Asfarviridae Compleja; 175-215 Asfivirus Virus de la fiebre africana de los cerdos Ranavirus Virus de las ranas 3 Iridoviridae Icosaédrica; 125-300 Lymphocystisvirus Virus de la enfermedad linfocistica 1 Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Orthohepadnavirus Virus de la hepatitis B Hepadnaviridae Icosaédrica; 42-47 Avihepadnavirus Virus de la hepatitis B de los patos Alpharetrovirus Virus de la leucosis aviar Betaretrovirus Virus del adenocarcinoma pulmonar ovino Retroviridae Icosaédrica; 80-100 Gammaretrovirus Virus de la leucemia Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas felina Deltaretrovirus Virus de la leucemia bovina Epsilonretrovirus Virus del sarcoma dérmico de Walley Lentivirus Virus de la inmunodeficiencia felina Spumavirus Virus espumoso de los bóvidos Virus de ARN de cadena doble Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Orthoreovirus Ortoreovirus de los mamíferosObivirus Virus de la (enfermedad de) la lengua azul Rotavirus Rotavirus A Coltivirus Virus de la fiebre de garrapatas de Colorado Reoviridae Icosaédrica; 60-80 Aquareovirus Aquareovirus A Aquabirnavirus Virus de la necrosis pancreática infecciosa Birnaviridae Icosaédrica; 60-70 Avibirnavirus Virus de la infección de la bolsa de Fabricio Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Respirovirus Virus de la influenza bovina 3 Rubulavirus Rubulavirus porcino; Virus de las paperas Morbillivirus Virus del moquillo canino; virus del sarampión Henipavirus Virus Hendra Paramyxovirinae Avulavirus Virus de la enfermedad de Newcastle Paramyxoviridae Helicoidal; 150-200 a 1000-10,000 Pneumovirinae Pneumovirus Virus sincitial respiratorio bovina Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Metapneumovirus Pneumovirus aviar Vesiculovirus Virus de la estomatitis vesicular de Indiana Lyssavirus Virus de la rabia Ephemerovirus Virus de la fiebre efímera bovina Rhabdoviridae Helicoidal; 45-100 a 100-430 Novirhabdovirus Virus de la hematopoyesis necrótica infecciosa Influenzavirus A Virus de la influenza tipo A Influenzavirus B Virus de la influenza tipo B Influenzavirus C Virus de la influenza tipo C Thogotovirus Virus Thogoto Orthomyxoviridae Helicoidal; 80-129 hasta 2000 Isavirus Virus de la anemia infecciosa del salmón Orthobunyavirus Virus de Akabane Hantavirus Virus Hantaan Nairovirus Virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi Bunyaviridae Helicoidal; 80-100 Phlebovirus Virus de la fiebre del valle de Rift Bornaviridae Icosaédrica; 100-130 Bornavirus Virus de la enfermedad de Borna Arenavirus Virus de la coriomeningitis linfocítica Arenaviridae Helicoidal; 50-300 Deltavirus Virus de la hepatitis humana D Marburg-like viruses Virus de Marburg Filoviridae Helicoidal; 80 a 1400 Ebola-like viruses Virus del Ébola Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Enterovirus Virus de la polio Picornaviridae Icosaédrica; 22-30 Rhinovirus Rinovirus humano A Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo Familia Simetría de la cápside y tamaño del virión (nm) Subfamilia Géneros Especies representativas Cardiovirus Virus de la encefalomiocarditis Aphthovirus Virus de la fiebre aftosa Hepatovirus Virus de la hepatitis A Parechovirus Parechovirus humano Erbovirus Virus de la rinitis equina B Kobuvirus Virus Aichi Teschovirus Teschovirus porcino Lagovirus Virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos Norovirus Virus Norwalk Sapovirus Calicivirus porcino Calciviridae Icosaédrica; 35-39 Vesivirus Virus del exantema vesicular porcino Mamastrovirus Astrovirus humano Astroviridae Icosaédrica; 27-30 Avastrovirus Astrovirus del pavo Coronavirus Virus de la bronquitis infecciosa Coronaviridae Helicoidal; 60-220 Torovirus Torovirus equino Arteriviridae Icosaédrica; 40-60 Arterivirus Virus de la arteritis equina Alphavirus Virus Sindibis Togaviridae Icosaédrica; 70 Rubivirus Virus de la rubeola Flavivirus Virus de la fiebre amarilla Pestivirus Virus de la diarrea viral bovina 1 Flaviviridae Icosaédrica; 40-60 Hepacivirus Virus de la hepatitis C Nodaviridae Icosaédrica; 29-32 Betanodavirus Virus nervioso de la necrosis del gato rayado Partículas atípicas asociadas con infecciones Virus defectuosos Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes específicos, debido a mutación o deleción. Como resultado de lo anterior, los virus defectuosos no son capaces de llevar a cabo un ciclo de vida productivo en las células. Sin embargo, si la célula infectada con el virus defectuoso está co-infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus defectuoso es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso puede replicarse. Es interesante que, para algunos virus, durante la infección se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de viriones infecciosos (tanto como 100:1). La producción de partículas defectuosas es característica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad de la infección/enfermedad in vivo. Los virusoides, que son ejemplo de virus defectuosos, se discutirán más adelante en esta sección. Pseudoviriones Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicación viral cuando el genoma del hospedero se fragmenta. Como resultado de este proceso algunos fragmentos del ADN del hospedero se incorporan en la cápside en lugar del ADN viral. Entonces, los pseudoviriones poseen la cápside viral a la cual los anticuerpos pueden unirse y facilitar el anclaje y penetración en la célula hospedera, pero no pueden replicarse una vez que logran el acceso a la célula, debido a que no tienen ninguno de los genes virales esenciales para el proceso de replicación. Priones Aunque no son virales, los priones son partículas proteicas infecciosas asociadas con encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE por sus siglas en inglés) de humanos y de animales. TSE incluye la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en humanos, "scrapie" en ovejas y encefalopatía espongiforme bovina. Priones y TSEs en animales se discuten detalladamente en el capítulo 29. En el análisis a la necropsia, el cerebro presenta grandes vacuolas en las regiones de la corteza y del cerebelo, por lo que la enfermedad causada por priones se llaman "encefalopatías espongiformes". Una examinación más detallada del tejido cerebral revela la acumulación de fibrillas y placas amiloideas asociadas con proteínas de priones. Estas enfermedades se caracterizan por la pérdida del control motor, demencia, parálisis, desgaste y eventualmente la muerte. Los detalles de la patogenia son en su mayoría desconocidos. Viroides Los viroides son ácidos nucleicos de bajo peso molecular, desnudos, extremadamente resistentes al calor, a la radiación ultravioleta y la radiación ionizante. Estas partículas se componen exclusivamente de una pieza de ARN circular de cadena sencilla, con algunas regiones de cadena doble. Los viroides causan en su mayoría enfermedades de plantas, como la enfermedad del tubérculo ahusado de la papa. Virusoides Los virusoides (también llamados ARN satélites) son similares a los viroides en el sentido de que son ácidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular, extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas y ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicación. Los virusoides se replican en el citoplasma de la célula a través de una polimerasa ARN dependiente de ARN. Nueva familia viral - Mimiviridae Mimiviridae es una familia viral que contiene un miembro, Mimivirus. El nombre de Mimivirus se deriva de "microbio imitador". Fue descubierto en 1992 dentro de un protozoario y, a la fecha, es el virus conocido de mayor tamaño, alrededor de 400 nm de diámetro. La cápside es de forma icosahédrica, el virión carece de envoltura y su genoma es de ADN circular de cadena doble (dsADN), de 1.2 Mb de longitud y con 1,260 genes. La secuencia del genoma de Mimivirus fue publicada en el año 2004. Glosario Bacteriófago: Un virus que infecta células procariontes y tiene muchos de los atributos de los virus de plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar a cabo su ciclo reproductivo. Protrusión de yemas: A través de este procesolos virus envueltos adquieren su envoltura. Es precedido por la inserción de glicoproteínas virus-específicas en la membrana celular del hospedero. Este proceso ocurre más frecuentemente en la membrana plasmática y confiere infectividad. Mucopolisacárido: Una clase de polisacárido (glucoaminoglicanos) como heparina, ácido hialurónico y sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un material espeso mucoide, gelatinoso. Oligosacárido: Una azúcar que contiene un número pequeño y conocido de unidades de monosacáridos. Derechos Reservados. Este documento está disponible en www.ivis.org. Documento No. A3401.1204.ES Cultivo y caracterización de virus D.J. Wise1 and G.R. Carter2 1Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA.2Virginia- Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. Traducido por: A. T. Pérez Méndez, Biotecnología Veterinaria de Puebla, S.A de C.V., Tehuacán, Puebla, Mexico. (21-Apr-2005). Indice • Métodos de propagación viral • Concentración y purificación de virus • Infectividad y almacenamiento • Visualización de virus • Cuantificación directa de virus • Cuantificación indirecta de virus • Métodos misceláneos usados para caracterización • Glosario Se han desarrollado métodos para el almacenamiento, visualización, cuantificación (directa e indirecta) y propagación de virus. También hay métodos para el diagnóstico de laboratorio de enfermedades virales, muchos de los cuales son métodos serológicos, basados en la detección de la respuesta del hospedero a la infección. Estos métodos diagnósticos serán discutidos en el capítulo 7. A lo largo del tiempo, fue posible observar que el contagio de ciertas enfermedades era capaz de pasar a través de filtros que las bacterias no podían pasar. Los filtrados obtenidos no eran capaces de crecer en medios de cultivos para bacterias, y eventualmente se demostró experimentalmente que eran infectivos y que contenían virus. A excepción de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados con microscopio óptico. Eventualmente los virus fueron observados con microscopio electrónico. Algunos de los métodos importantes usados en los estudios básicos de virus se describen a continuación. Tal como se mencionó en el capítulo anterior, los virus animales presentan una considerable diversidad en sus características físicas. La característica que más refleja las propiedades del virión es la presencia o ausencia de la envoltura viral. Como se señala en la tabla 2.1, los virus no envueltos son, en general, sensibles a la radiación ultravioleta, relativamente termoestables y susceptibles al daño por los cristales de hielo. Debido principalmente a la presencia de la envoltura de membrana, los virus envueltos se inactivan con solventes lipídicos (como cloroformo y éter) y detergentes (como el desoxicolato), son sensibles a la radiación gama y ultravioleta, relativamente termolábiles y el daño que les produce la formación de cristales de hielo es más extenso que el que se produce en los virus no envueltos o desnudos. Tabla 2.1. Principales propiedades fisicoquímicas y biológicas de viriones envueltos y desnudos Características Virus desnudos Virus envueltos Radiación ultravioleta Sensible Sensible Radiación gama Sensible Sensible Termoestabilidad Termoestable Termolábil Susceptibilidad a daño por cristales de hielo Si Extenso Inactivación por solventes lipídicos y detergentes No Si Métodos de propagación viral Para aislar, caracterizar e identificar virus, así como para producir vacunas virales, se necesita una cantidad considerable de partículas virales. Esto se logra a través de diferentes métodos de propagación, los cuales se enlistan a continuación: Hospederos animales En el pasado, la propagación de virus en organismos hospederos susceptibles no infectados era la única manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el uso de animales experimentales como hospederos para propagación viral está limitado por razones éticas. La propagación viral en animales es más útil para aquellos virus que no crecen fácilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales del virus de la enteritis hemorrágica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas) parecen ser más usados que los propagados en cultivo. Para fines diagnósticos la inoculación de animales es un medio para detectar virus en muestras clínicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes. Huevos embrionados Antes del desarrollo de las técnicas de cultivo de células y de tejidos, el uso de huevo embrionado para propagación viral fue una de las primeras alternativas al uso de organismos animales hospederos. El huevo embrionado es aún el método preferido para la propagación de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. El huevo embrionado también es útil en la diferenciación de algunos virus que producen lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo viruela de la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un virus de mamíferos, se replica bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se usa para propagación viral con fines diagnósticos y de investigación. Cuando se usa huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos (IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible obtener huevo embrionado de parvadas libres de patógenos específicos (SPF). El dar pases en embrión de pollos es útil en la atenuación de ciertos virus para vacunas de virus vivo modificado. Cultivo de células/tejidos El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de células de tejidos vivos in vitro. Hay básicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de células. Los explantes son pequeños fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el cultivo de células se obtiene mediante de la disgregación de diferentes tejidos del hospedero en células individuales. La mayoría de los sistemas usados en virología son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos términos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos. Figura 2-1. Cultivo celular normal. Cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Cultivo de explantes Estos son cultivos de pequeños fragmentos de tejidos específicos, tomados directamente del hospedero animal. Los cultivos de explantes son útiles para el aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostración de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigémino). Cultivos celulares primarios Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimáticamente con tripsina u otras proteasas, para liberar células individuales. Como resultado, con frecuencia los cultivos primarios están compuestos de muchos tipos celulares diferentes. En condiciones in vitro las células de los cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un tiempo de vida limitado, conocido como límite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven más allá del vigésimo pase in vitro. Cultivos semi-continuos Son también conocidos como líneas celulares diploides, debido a que contienen el cromosoma diploide normal característicode la especie de la que ellos se derivan. Los cultivos semi-continuos son cultivos primarios que tienen algunas células que pueden ser cuidadas para sobrevivir más allá del límite de Hayflick. Los cultivos semi- continuos tienden a morir entre el 30° y el 50° pase in vitro. A pesar de esta limitante, los cultivos semi-continuos son útiles en la propagación de una gran variedad de virus. Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos. Cultivos celulares continuos Se les conoce también como líneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un número anormal de cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplásicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. De manera general, las líneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagación viral. Sin embargo, facilitan la propagación a gran escala de algunos virus para vacunas e investigación. Muchas líneas continuas están disponibles de proveedores como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC por sus siglas en inglés). La mayoría de los laboratorios de virología almacenan en congelación alícuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las líneas celulares que están continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus características celulares. Las causas de estos cambios pueden ser infección por Micoplasma spp., o virus contaminantes (por ejemplo, circovirus porcino y virus de la diarrea viral bovina). Concentración y purificación de virus Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las células hospederas y los restos de éstas, y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran centrifugación diferencial (a diferentes velocidades), diálisis, precipitación, cromatografía y gradientes de densidad. El paso inicial de este proceso es la centrifugación diferencial; se usa una velocidad baja (~2,000 x g) para quitar restos celulares y a para concentrar se usa a continuación, en el caso de volúmenes pequeños, una velocidad alta de centrifugación (40K a 80K x g) y en el caso de volúmenes mayores, se usa diálisis y precipitación o precipitación con metanol frío (-70°C) o con polietilenglicol. La purificación se lleva a cabo mediante cromatografía o centrifugación usando gradientes de densidad. Los virus envueltos pueden ser purificados aprovechando su velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa. Los virus desnudos pueden ser purificados por centrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio. Infectividad y almacenamiento Infectividad La infectividad es la habilidad de la partícula viral para infectar una célula hospedera. La temperatura en el exterior de la célula hospedera afecta fácilmente la capacidad del virus para conservar su infectividad, particularmente en el caso de los virus envueltos. Debido a que los virus no tienen actividad metabólica propia, la infectividad es el mejor medio para evaluar la integridad de la partícula viral después de que se ha expuesto a cierta temperatura. Las siguientes son consideraciones importantes al respecto: • A 60°C, la infectividad del virus disminuirá rápidamente, en segundos. • A 37°C, la infectividad disminuirá dramáticamente, en minutos. • A 20°C, la infectividad disminuirá, en cuestión de horas. • La infectividad en las temperaturas antes mencionadas influyen en la transmisión del virus por contacto directo (a 37°C) y por fomites (a 20°C). • A 4°C, la infectividad en tejidos se pierde en cuestión de días. Los clínicos deben tener esto en cuenta al considerar los especímenes clínicos. Con frecuencia se usan temperaturas abajo del punto de congelación para almacenamientos por periodos largos. Lo importante a considerar es mantener al mínimo la formación de cristales de hielo. Debe mantenerse en mente el hecho de que los virus presentan gran diversidad en su resistencia y labilidad Algunos son capaces de sobrevivir por horas, días, o incluso meses bajo condiciones ambientales, mientras que otros se inactivan en pocos minutos bajo las mismas condiciones. Los tres métodos principales para almacenar virus son: • Congelación a -70°C, con o sin criopreservante. • Para almacenamiento por largos periodos: congelamiento en nitrógeno líquido (- 196°C). • Liofilización con almacenamiento en congelación o a temperatura ambiente. Visualización de los virus Los dos métodos principales usados para visualizar la estructura / morfología de los virus son: la microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. Otros tipos de microscopía se usan para observar cambios inducidos por la replicación viral en las células infectadas. Sin un medio para visualizar los virus es difícil obtener información acerca de la estructura o las interacciones célula-virus. Más aún, el visualizar las partículas virales le permite a uno estimar directamente el número de partículas (virales) presentes en una suspensión. Hay otros métodos que le permiten a uno estimar el número de virus indirectamente. En cualquier caso, la cuantificación directa o indirecta es siempre un estimado. Este estimado numérico es importante al preparar vacunas, al determinar el número mínimo de viriones necesarios para producir una enfermedad y en procedimientos virales de investigación. Microscopía óptica Si bien la microscopía óptica no es útil para la examinación directa de los virus (con excepción de los virus de la viruela), es útil para observar los efectos de la infección viral en la célula hospedera. El daño celular o la destrucción causada por el virus es conocida como efecto citopático (CPE por sus siglas en inglés). Los efectos citopáticos que pueden observarse incluyen: 1. Células redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus; 2. Células redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa con los enterovirus; 3. Células agrandadas y redondeadas en áreas focales, como con herpesvirus; y 4. Fusión de células que se convierten en células multinucleadas (sinsicios) como en el caso de paramyxovirus. Además es posible observar cuerpos de inclusión, característicos de algunos virus. Figura 2-2. Efecto citopático del herpes virus "lento" equino. Cortesía de A. Wayne Roberts. Para ver oprima la figura Microscopía de fluorescencia La microscopía de fluorescencia puede ser usada para visualizar células o tejidos infectados por virus, usando anticuerpos antígeno-específicos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une específicamente a los antígenos virales presentes dentro de las células o tejidos y los marca con la molécula fluorescente (generalmente fluoresceína). La marca fluorescente se observa posteriormente con un microscopio de luz ultravioleta que excita a la molécula del fluorocromo, lo que uno observa como una zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la visualización puede llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca (como los de sueros convalecientes) seguidos de la aplicación de anticuerpos marcados con fluoresceína que se unen al primer anticuerpo. Los ensayos basados en el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comúnmente en el diagnóstico viral y la investigación. Microscopía electrónica La microscopía electrónica involucra la aceleración de electrones a un estado de alta energía y el enfoque magnético de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta energía tienen longitudes de onda muy cortas, proporcionando así una mejor resolución de estructuras muy pequeñas. La microscopía electrónica tiene suficiente poder de resolución para observar polímeros grandes como ADN y ARN, así como proteínas grandes. Para facilitar la visualización,las muestras pueden ser cubiertas con metales pesados como osmio, antes de la examinación con el microscopio electrónico. Los electrones impactan el metal pesado y posteriormente son visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopía electrónica proporciona imágenes tridimensionales de viriones y de su localización (nuclear o citoplasmática) dentro de la célula hospedera en un momento dado durante la infección. La observación de viriones en células vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados. Microscopía de fuerza atómica La microscopía de fuerza atómica trabaja a través de la medición de una propiedad local (tal como altura, absorción óptica, magnetismo, etc.) de una sonda puesta muy cerca de la muestra. Esto hace posible tomar mediciones en un área muy pequeña de la muestra. Los electrones son capaces de "atravesar por túnel" entre los átomos, provocando una fuerza pequeña pero cuantificable. El resultado de estas mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura. La ventaja de la microscopía de fuerza atómica es que la preparación de la muestra es mínima y pueden usarse especímenes vivos. Este método ha sido útil para obtener imágenes detalladas de estructuras de cápsides y de interacciones virus-célula. Microscopía inmunoelectrónica Esta técnica permite la visualización de complejos antígeno / anticuerpo que son específicos para un virus en particular. En este método se obtienen cortes ultra finos (de la muestra) y se incuban con un anticuerpo específico para el virus. Después de un paso de lavado, el corte se incuba con Proteína A conjugada con partículas de oro (de un rango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porción Fc del anticuerpo y se detecta por microscopía electrónica. Enumeración directa de virus Estimar el número de virus tiene una cantidad importante de usos, incluyendo producción de vacunas e investigación. La microscopía electrónica se usa para cuantificar las partículas virales en una solución libre de células. Se examina un volumen conocido de la muestra y se cuenta el número de viriones. Este número se usa para calcular el número de virus. Una limitante es que las cápsides vacías, es decir, partículas no infectantes, también son contadas. En investigación, se compara el número de partículas infectantes y el número total, y se establece una relación de partículas totales / partículas infecciosas para un virus dado. Enumeración indirecta de virus Los métodos indirectos de cuantificación viral son aquellos que usan factores asociados con la infectividad (actividad biológica). Los tres métodos principales usados para determinar indirectamente concentraciones virales son: ensayos de hemoaglutinación, ensayos de formación de placas y el método de la dilución limitante. Hemoaglutinación Este ensayo se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar glóbulos rojos (RBCs) o (GR). El ensayo se lleva a cabo en una microplaca, añadiendo glóbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando posteriormente la hemoaglutinación. Son necesarias muchas partículas virales para cubrir los glóbulos rojos y producir hemoaglutinación. Por ejemplo: se necesitan aproximadamente 104 viriones de influenza por unidad hemoaglutinante (1 unidad de HA). Una unidad de HA se define como la máxima dilución de la muestra viral que causa hemoaglutinación completa. La hemoaglutinación es útil en la concentración y purificación de algunos virus, y como prueba presuntiva rápida para la presencia de este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo. Es especialmente útil para probar actividad viral en cultivos celulares infectados con virus hemoaglutinantes que producen un efecto citopático (CPE) mínimo o no detectable. También pueden ser examinados directamente especímenes clínicos como heces, para buscar actividad hemoaglutinante de partículas virales (se discutirá posteriormente en el capítulo 7). Otros ensayos del mismo tipo, en los que se prueba una actividad enzimática de un virus en particular (como aquellos que producen transcriptasa reversa), pueden ser llevados a cabo de manera similar. Ensayo de formación de placas Este ensayo involucra la inoculación de células hospederas susceptibles con un virus, y usar su actividad biológica para estimar el número de viriones presentes. En este procedimiento se usan diluciones decimales seriadas del virus para inocular monocapas de células hospederas. Después de un periodo de incubación en el que se permite la adsorción del virus a la superficie de las células hospederas, la monocapa es cubierta por una capa de un gel compuesto por medio de cultivo para células hospederas y agarosa. La presencia del agar evita la diseminación a gran escala del virus en el cultivo celular, pero permite la diseminación localizada de célula a célula. Con los virus citopáticos la destrucción de las células lleva a la formación de zonas desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72 horas de incubación. Un cálculo que involucra el número de placas observadas, el factor de dilución de la muestra y el volumen de muestra diluida utilizada, da como resultado las unidades formadoras de placa (PFU) por mililitro de muestra. El método de dilución limitante Este ensayo basado en titulación mide un efecto in vitro sobre las células, como el CPE, cuando éstas se expone a varias diluciones de la solución que contiene el virus. Si es posible, se usa una concentración conocida de un virus de referencia como control positivo. Dependiendo del virus, se hacen diluciones seriadas dobles o diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las células. El título infectivo (el recíproco de la dilución más alta que provoca el 50% de CPE en el cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo puede usarse con células en cultivo, embriones de pollo o incluso con animales de laboratorio. Métodos misceláneos usados para caracterización Hay algunos métodos en virología que son útiles en la identificación y clasificación de virus desconocidos. Algunas de esas técnicas serán mencionadas brevemente aquí, pero si se usan en el diagnóstico de laboratorio de un virus en particular, se explicarán con detalle posteriormente. Sensibilidad a solventes lipídicos La sensibilidad de los virus a solventes lipídicos como cloroformo y éter es útil en la taxonomía de ciertos virus. Cualquier virus que posea envoltura es susceptible a solventes lipídicos. Todos los virus envueltos de animales, excepto algunos virus de la viruela, son sensibles al éter. Identificación del tipo de ácido nucleico Esto se lleva a cabo examinando la síntesis de ácido nucleico en la célula, en presencia de inhibidores de la síntesis de ADN, como la 5-bromo-2-desoxiuridina (BRU). Si se inhibe la síntesis viral como consecuencia disminuirá la multiplicación viral. En el caso de que el crecimiento viral no sea inhibido se presume que al virus contiene ARN. Análisis con enzimas de restricción Las enzimas de restricción (RE) son endonucleasas que cortan el ADN de doble cadena en sitios de reconocimiento específicos que son secuencias palindrómicas que van desde cuatro hasta ocho pares de bases de longitud. El análisis con enzimas de restricción es particularmente útil en la clasificación de "subserotipos" virales, en la diferenciación de virus vivos modificados vacunales de virus virulentos y en el rastreo epidemiológico de brotes de enfermedades. Metodológicamente esta técnica consiste en tratar el ADN viral con una o varias enzimas de restricción y luego separar los fragmentos resultantes por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida.Los virus de ARN pueden ser analizados de una manera similar haciendo primero el ADN complementario (ADNc) al ARN viral usando la enzima transcriptasa reversa, y luego amplificando este ADNc por el método de PCR descrito en el capítulo 7. Hemoadsorción Virus envueltos como los ortomixovirus y paramixovirus adquieren su envoltura externa por protrusión de yemas a través de la membrana celular. Antes de la protrusión, se incorporan a la membrana celular proteínas codificadas por el virus (hemoaglutininas). Esas células (aquellas a las se incorporaron hemoaglutininas a su membrana) adsorben eritrocitos a su superficie, lo que trae como consecuencia la formación de focos de hemoadsorción que pueden ser detectados microscópicamente. Métodos inmunológicos Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos específicos. La detección y cuantificación de estos anticuerpos, que reflejan el estado de la enfermedad, son útiles en la planeación de programas de salud para el hato y estudios epidemiológicos de los brotes de enfermedades. Si bien la detección de anticuerpos es útil en el diagnóstico de enfermedades también, con frecuencia es un proceso tardado que requiere la comparación de los niveles de anticuerpos en sueros de la fase aguda de la enfermedad y de la convalecencia, sueros que se colectan con 10 a 14 días de diferencia unos de otros. Una estrategia más rápida es usar anticuerpos específicos anti-virus para detectar antígenos virales directamente en especímenes clínicos. Estos anticuerpos generalmente se obtienen por hiperinmunización de conejos o cabras con un virus específico. De manera alternativa pueden usarse anticuerpos monoclonales, si hay disponibles. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se preparan en ratones primero exponiendo al ratón al antígeno viral, que sensibiliza a las células B del bazo. Estas células se colectan y se fusionan químicamente con una línea celular de plasmocitoma de ratón que secreta IgG. Posteriormente estas células híbridas son clonadas y los hibridomas resultantes, que son derivados de una sola célula, se analizan para buscar secreción de la IgG antiviral específica. Las células del hibridoma seleccionado son inyectadas de regreso por vía intraperitoneal al ratón, donde las células se multiplican rápidamente y causan la acumulación de un fluido ascítico que contiene una alta concentración de anticuerpos monoclonales. La figura 2.1 muestra los pasos involucrados en la preparación de los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son especialmente útiles en la tipificación y subtipificación de virus. Cuando son acoplados a fluorocromos, los mAbs son muy usados para la detección de virus en tejidos. También son usados para la identificación de virus en muchos estuches diagnósticos comerciales de ELISAs. Las pruebas más comúnmente usadas en virología clínica o diagnóstica serán discutidas en el capítulo 7. Figure 2-3. Pasos asociados al desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos. Para ver oprima la figura Glosario Virus citopáticos: Son aquellos que alteran la apariencia microscópica de células en cultivo. Estos cambios pueden incluir redondeo de las células, fusión celular, desprendimiento celular, producción de cuerpos de inclusión, etc. Gradientes de densidad: Procedimiento para separar células o macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos, generalmente usando centrifugación a través de un gradiente de densidad. Este último consiste en una solución en la que hay un rango de densidades del soluto (generalmente sacarosa o cloruro de cesio), menos concentrado en la superficie y más concentrado en el fondo. Como resultado de la centrifugación las células o macromoléculas se desplazan a través del gradiente y forman una banda que se ubica donde su gravedad específica es igual a la densidad del medio. Palíndromos: Secuencias que se leen igual en ambas direcciones. La mayoría de los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción son palíndromos, por ejemplo la secuencia de reconocimiento de EcoR1 (E.coli) es: 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' Interacciones virus-célula y patogénesis viral D.J. Wise1 and G.R. Carter2 1Department of Biology, Concord University, Athens, West Virginia, USA.2Virginia- Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, Blacksburg, Virginia, USA. Traducido por: A. T. Pérez Méndez, Biotecnología Veterinaria de Puebla, S.A. de C.V., Tehuacan, Puebla, México. (8-Aug-2005). Indice • Interacción entre Virus y Células Hospederas • Patogénesis de las Infecciones Virales • Glosario Para el entendimiento de la interacción entre el virus y la célula hospedera es necesario tener conocimiento de la replicación y la genética viral. La interacción a nivel celular y la progresión de una infección viral particular determinan la patogénesis de la enfermedad y sus manifestaciones clínicas. La respuesta inmune del hospedero a la presencia de los virus será examinada en el capítulo 5. Interacción entre virus y células hospederas La interacción entre los virus y sus células hospederas está íntimamente ligada al ciclo de replicación viral. Más aún: la interacción del virus con los componentes y las estructuras celulares durante el proceso de replicación influye en cómo el virus causa la enfermedad. En total hay cuatro posibles efectos primarios de la infección viral a una célula hospedera. La mayoría de las infecciones no cusan patología celular o alteración morfológica aparente, sin embargo la replicación puede causar citopatología (redondeamiento celular, desprendimiento, formación de sinsicios, etc.), transformación maligna o lisis celular (muerte). Muerte celular La muerte celular durante la replicación viral puede ser causada por diversos factores. El factor más probable es la inhibición de la síntesis celular basal de biomoléculas tales como proteínas. Durante el ciclo de replicación, el virus induce a la maquinaria celular a fabricar principalmente productos virales, más que aquellos que la célula fabricaría normalmente. Como resultado de esto, la célula sintetiza predominantemente productos virales, y los productos celulares necesarios para la supervivencia de la célula no están presentes, o lo están pero en cantidades demasiado bajas como para mantener su viablildad. Además de la carencia de productos celulares esenciales, este evento resulta en la acumulación excesiva de productos virales (ARN, ADN, proteínas), que pueden ser tóxicos para las células. En la fase de liberación del ciclo de replicación de algunos virus se estimula la apoptosis de la célula hospedera. En otras instancias la inhibición de la síntesis de macromoléculas celulares causa daños a las membranas de los lisosomas, y por consecuencia la liberación de enzimas hidrolíticas, provocando la muerte celular. Efectos celulares Los efectos citopáticos (CPE por sus siglas en inglés) son todos aquellos cambios morfológicos en las células provocados por la infección viral. Las células infectadas algunas veces tienen alterada su membrana celular. Como resultado de esto, la membrana de la célula infectada es capaz de fusionarse con su célula vecina. Se piensa que esta alteración es el resultado de la inserción, durante el ciclo de replicación, de proteínas virales. El resultado de la fusión es la generación de una célula multinucleada o sinsicios. La formación de sinsicios es una característica de numerosos virus envueltos, como los herpesvirus y paramyxovirus. La membrana celular alterada también está alterada en lo que se refiere a su permeabilidad, permitiendo la entrada de varios iones, toxinas, antibióticos, etc. Estas células multinucleadas son grandes, por lo que algunas veces son llamadas "células multinucleadasgigantes". Otro aspecto del efecto citopático es la alteración del citoesqueleto, que da lugar al aspecto "redondeado" de las células infectadas. En estos casos la célula va a sufrir lisis o va a formar sinsicios. La presencia de CPE en especímenes clínicos puede indicar infección viral, y el CPE es usado como base para el ensayo de formación de placas usado para cuantificación viral (ver Capítulo 2). La infección de células por algunos virus (por ejemplo virus de viruela y rabia) se caracteriza por la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma. Los cuerpos de inclusión son áreas discretas que contienen proteínas o partículas virales. Frecuentemente tiene una apariencia y localización características en la célula infectada, dependiendo del tipo de virus. Transformación maligna En este proceso la infección viral da como resultado células hospederas que se caracterizan por tener alteraciones en su morfología, en su control de crecimiento, en sus propiedades celulares y/o bioquímicas. La transformación maligna y la neoplasia resultante puede ocurrir cuando el genoma viral (o una porción de éste) se incorpora en el genoma del hospedero, o cuando los productos virales son, por sí mismos, oncogénicos. Los virus que causan transformación maligna se conocen como virus tumorales. Se ha demostrado que virus de diferentes familias poseen la habilidad de transformar células hospederas. Los virus tumorales no tienen propiedades comunes (forma, tamaño, composición química) más que provocar el desarrollo de malignidad en las células que infectan. La transformación maligna frecuentemente se caracteriza por alterar la morfología celular. Esto incluye la pérdida de su forma característica, y la adopción de la apariencia redondeada y refráctil descrita para el CPE. Esto es el resultado de la disgregación de filamentos de actina y la disminución de la adhesión de la superficie. El crecimiento celular alterado, la característica distintiva de la transformación maligna, se muestra en células infectadas que han perdido la inhibición por contacto de su crecimiento o movimiento, que tienen disminuidos sus requerimientos de factores de crecimiento de suero, y/o ya no responden a las señales de ciclo celular asociadas con crecimiento y maduración celular (inmortalidad). Algunas de las alteraciones en las propiedades celulares que exhiben las células con transformación maligna incluyen la inducción continua de la síntesis de ADN, cambios cromosomales, aparición de antígenos de superficie nuevos o embrionarios, e incremento de aglutinación por lectinas. Las características bioquímicas que frecuentemente se ven alteradas en células con transformación maligna incluyen la reducción de los niveles de AMP cíclico. El AMP cíclico es una señal química asociada con el ciclo celular y al mantener los niveles reducidos, la célula se divide continuamente. También está involucrado en el incremento de la secreción del activador plasminógeno (formación de coágulo), fermentación para la producción de ácido láctico (conocido como efecto Warburg), pérdida de fibronectina, y cambios en los azúcares de las glicoproteínas y los glicolípidos. Oncogénesis Aunque ha sido difícil comprobar la causa-efecto, varios virus de ADN y de ARN se han asociado con transformación neoplásica. Los virus implicados en la oncogénesis o llevan consigo una copia del gen asociado con el crecimiento y la proliferación celular, o alteran la expresión de la copia del gen que tiene la célula hospedera. Los genes afectados incluyen aquellos que estimulan y aquellos que inhiben el crecimiento celular. Los genes virales que transforman a las células infectadas se conocen como oncogenes (genes v-onc), los cuáles estimulan el crecimiento y la proliferación descontrolada de la célula. El descubrimiento de los oncogenes llevó a descubrir que todas las células poseen genes análogos, llamados proto-oncogenes (genes c-onc), que normalmente están quiescentes en las células y se activan en algún momento del desarrollo. Los proto-oncogenes incluyen productos celulares como factores de crecimiento, factores de transcripción y receptores de factores de crecimiento. Los virus de ADN asociados con la oncogénesis incluyen virus de la enfermedad de Marek (Herpesviridae) y los papillomavirus bovinos, equinos, y orales caninos (Papillomaviridae). Estos virus son típicamente de ácidos nucleicos episómicos circulares (independientes de los cromosomas del hospedero, más que integrados). Los oncogenes (v-onc) codifican para proteínas asociadas con el ciclo de replicación viral. Los virus ARN asociados con oncogénesis incluyen miembros de la familia Retroviridae (por ejemplo virus de leucosis aviar y de leucemia felina). Estos virus integran sus genomas (o una copia de sus genomas) en el cromosoma del hospedero: se conocen como provirus o ADN proviral. La integración viral es mediada por los extremos terminales del genoma, conocidos como LTRs (repeticiones terminales largas, por sus siglas en inglés). Los LTR’s contienen regiones promotoras/ potenciadoras, además de las secuencias involucradas en la integración del provirus en el genoma del hospedero. Los Retrovirus pueden causar oncogénesis porque codifican oncogenes por sí mismos o por alterar la expresión de los oncogenes celulares o proto-oncogenes a través de la inserción de sus genomas en el cromosoma del hospedero, en un sitio cercano a estos genes. Sin cambios morfológicos o funcionales En algunos casos, la infección con producción viral puede ocurrir sin que puedan detectarse cambios en la célula hospedera. Esto se conoce como infección endosimbiótica. Probablemente depende de las necesidades de replicación del virus. Es muy probable que el virus requiera que los procesos celulares estén activos para que la replicación viral se lleve a cabo, y por lo tanto no altera las características de la célula. Patogénesis de las infecciones virales La patogénesis se define como la generación y desarrollo de una enfermedad. Las infecciones virales pueden ser agudas, crónicas, latentes o persistentes. El primer paso en el proceso de una enfermedad es la exposición. Exposición y transmisión La exposición pude ocurrir por contacto directo con un animal infectado, por contacto indirecto con secreciones / excreciones de un animal infectado, o por vectores mecánicos o biológicos. La transmisión del virus desde la madre a la descendencia (transplacentaria, perinatal o por el calostro) se conoce como transmisión vertical. La transmisión vía cualquier otro mecanismo que no sea de la madre a la descendencia es transmisión horizontal. Puede ocurrir activación de un virus latente no replicante dentro de un individuo, sin que el agente infeccioso se adquiera de una fuente externa. Vía de entrada Los virus penetran al hospedero a través del tracto respiratorio (aerosoles), el tracto digestivo (contaminación oral-fecal), el tracto genitourinario (reproducción, inseminación artificial), la conjuntiva (aerosoles), y a través de aberturas en la piel (abrasiones, agujas, picaduras de insectos, etc.). Si después de la entrada del virus prosigue o no la infección, depende de la habilidad del virus para enfrentarse e iniciar infección en células susceptibles. La susceptibilidad de las células a un virus dado depende principalmente de sus receptores de superficie, que permiten el anclaje y la posterior penetración del virus. Infecciones localizadas y diseminadas Siguiendo la infección, el virus se replica en el sitio o cerca del sitio de entrada (replicación primaria). Algunos virus permanecen confinados a este sitio inicial de replicación, produciendo infecciones localizadas. Un ejemplo de esto es el resfriado común y las infecciones similares de animales domésticos causadas por rhinovirus. Otros virus causan infeccionesdiseminadas (sistémicas) por su difusión a órganos adicionales vía torrente sanguíneo, linfático o quiescente a través de los nervios. La propagación inicial del virus a otros órganos por el torrente sanguíneo se conoce como viremia primaria. La viremia puede darse ya sea por presencia de virus libres en el plasma o por virus asociados con células sanguíneas. Después de la multiplicación viral en esos órganos puede darse una viremia secundaria con propagación a (otros) órganos blanco. Un buen ejemplo de virus que causan infecciones sistémicas es el teschnovirus porcino 1 (género Teschnovirus). El virus se transmite de forma fecal-oral. Se replica inicialmente en las células de las amígdalas, migra a los intestinos y a los nódulos linfáticos mesentéricos. De estos nódulos linfáticos, el virus entra al sistema nervioso central. Una vez en el sistema nervioso central se observan los signos neurológicos de ataxia, temblores, pérdida de coordinación, entumecimiento de los miembros, convulsiones, parálisis y coma. La preferencia de un virus particular por un tejido o tipo celular específico se conoce como tropismo. Mecanismos de infecciones virales La replicación viral ocurre en los órganos blanco causando daño celular. El número de células infectadas y/o la extensión del daño pueden tener como consecuencia la disfunción del órgano o tejido y la manifestación clínica de la enfermedad. El intervalo entre la infección inicial y la aparición de signos clínicos es el periodo de incubación. Los periodos de incubación son cortos en enfermedades en las que el virus crece rápidamente en el sitio de entrada (por ejemplo influenza) y son más largos si las infecciones son generalizadas (por ejemplo moquillo canino). Algunos virus infectan animales pero no producen manifestación de signos de la enfermedad. Estas infecciones se conocen como subclínicas (asintomáticas o inaparentes). Hay numerosos factores que pueden influir en el resultado de las infecciones virales. Estos incluyen: inmunidad preexistente, genética del animal, edad del animal y factores relacionados a estrés como estado nutricional, condiciones ambientales etc. Los mecanismos por los que los virus causan enfermedad son complejos. La enfermedad puede ser resultado de efectos directos de los virus en las células hospederas, como muerte celular, efecto citopático y transformación maligna. De manera alternativa, la enfermedad puede ser resultado de efectos indirectos causados por la respuesta inmunológica y fisiológica del hospedero. Un ejemplo de respuesta fisiológica indirecta es la infección por rotavirus, que causa diarrea en animales jóvenes y humanos. La diarrea puede ser causada por los eritrocitos infectados por el rotavirus, que están estimulados a producir citocinas, excitando las neuronas entéricas e induciendo la secreción de exceso de fluidos y electrolitos en el intestino grueso. Un ejemplo de patogénesis de la enfermedad mediada por la respuesta inmunológica ocurre en la enfermedad de Borna en caballos. El virus se distribuye desde el sistema nervioso central a los nervios periféricos a través de los axones. El hospedero responde a la presencia de neuronas infectadas por el virus induciendo una respuesta inmune mediada por células. Los macrófagos, neutrófilos y linfocitos T citotóxicos específicos son activados para destruir a las neuronas infectadas por el bornavirus. El resultado es una inflamación crónica del SNC que corresponde a los signos neurológicos asociados con la enfermedad. Dos términos muy importantes usados para hablar de enfermedades microbianas son patogenicidad y virulencia. Patogenicidad es la habilidad del virus u otro agente microbiano o parasitario para causar enfermedad. Virulencia es el grado de patogenicidad. Un virus avirulento es aquel que no tiene la capacidad para causar enfermedad. Un virus atenuado es aquel cuya capacidad para causar enfermedad ha sido debilitada, frecuentemente por múltiples pases en cultivo celular, huevos embrionados o animales. Eliminación (diseminación) viral La eliminación viral es el mecanismo de excreción de la progenie viral para su diseminación hacia una nueva población de hospederos. Los virus típicamente son eliminados vía aperturas en el cuerpo o superficies. En infecciones localizadas, el virus es típicamente excretado vía el portal de entrada. En infecciones diseminadas el virus puede ser excretado por diferentes rutas. No todos los virus son excretados de sus hospederos. Estos incluyen virus que se replican en sitios como el sistema nervioso, como en la encefalitis viral, y hospederos finales (nota del editor: último hospedero del virus). Evasión de las defensas del hospedero En un esfuerzo por detener la infección, el hospedero inicia una respuesta inflamatoria. Los componentes principales de esta respuesta incluyen interferón, linfocitos T citotóxicos, linfocitos B productores de anticuerpos, diversas moléculas efectoras y complemento. Estos componentes trabajan en conjunto y se potencian unos a otros en un intento de liberar al hospedero de la infección viral. En este esfuerzo por liberarse del virus infectante, la respuesta inflamatoria causa muchos de los signos clínicos y lesiones asociados con las infecciones virales. La respuesta inmune del hospedero se discute con mayor detalle en el Capítulo 5. Los interferones (α y β) son producidos por las células infectadas por el virus. Actúan para detener replicación viral adicional en la célula infectada y en las células vecinas. Los interferones también fomentan la expresión de antígenos en la célula infectada, haciéndolas más fáciles de reconocer para las células T citotóxicas. Algunos virus como los adenovirus producen ARNs que bloquean la fosforilación de un factor inicial, reduciendo así la habilidad del interferón para bloquear la replicación viral. Las células T citotóxicas destruyen a las células infectadas mediante la liberación de perforinas, que crean poros en las células infectadas por virus. Posteriormente son liberadas granzimas dentro de la célula infectada, las que degradan a los componentes celulares. Finalmente, las células T citotóxicas estimulan la apoptosis de la célula hospedera. Algunos virus reducen la expresión, en la superficie de la célula hospedera, de los antígenos de superficie del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I (por ejemplo citomegalovirus, herpesvirus bovino tipo I y adenovirus). Como las células T citotóxicas no pueden detectar antígenos virales que no estén formando complejos con los antígenos del CMH clase I, las células infectadas con estos virus no pueden ser destruidas de esta manera, permitiendo la "supervivencia" del virus dentro de la célula hospedera. Sin embargo, células con insuficientes o ningún antígeno de CMH clase I en sus superficies son reconocidas por las células asesinas naturales, que destruyen a la célula de manera similar a la descrita para las células T citotóxicas. Los linfocitos B productores de anticuerpos secretan anticuerpos específicos para neutralizar los viriones infectantes cuando son liberados por las células. Los complejos antígeno-anticuerpo a su vez pueden activar el sistema del complemento. El complemento ayuda a estimular la inflamación, la neutralización efectiva de virus, y la destrucción de células infectadas por virus. Las diferentes moléculas efectoras (citocinas) que son producidas por las células del sistema inmune, desempeñan muchos papeles, incluyendo la inducción de fiebre y la atracción de otras células inflamatorias (por ejemplo neutrófilos y macrófagos) al sitio dañado. Algunos virus poseen receptores para una variedad de citocinas (por ejemplo, el virus de la viruela bovina tiene receptores para la interleucina 1, que estimula la producción de fiebre). Cuando las células inmunes liberan la citocina,
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