8. Sequenciamento de ácidos nucléicos

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Sequenciamento de ácidos nucléicos
Profa. M.Sc. Letícia Laine
Disciplina: Tópicos Avançados
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SEQUENCIAMENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
 Vem sendo estudado desde a década de 70;
Grande “salto” qualitativo e quantitativo após os anos 90 com o estabelecimento do Projeto Genoma Humano.
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AS PRIMEIRAS TÉCNICAS DE SEQUENCIAMENTO
Maxam e Gilbert
 Degradação química do DNA.
 Tratamento com substância químicas que lisam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos.
Frederick Sanger
 Sequenciamento enzimático, dideoxi ou término de cadeia;
 Síntese enzimática de fita complementar, cujo comprimento é interrompido pela adição de dideoxinucleotídeos com fluorocromo;
 Antes era feito manualmente, a partir dos anos 90 passou a ser automatizado.
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MÉTODO DE SANGER
 Mais amplamente utilizado;
 Consiste na utilização de ddNTPs (dideoxinucleotídeos) marcados com fluorocromos. Estes compostos são adicionados conjuntamente em tubos com os mesmos compostos utilizados em uma reação de PCR normal;
 Entretanto, a amostra de DNA já deve estar em grande quantidade (clonagem ou PCR previamente);
 Pequenas quantidades de ddNTPs são adicionadas e aleatoriamente a síntese será interrompida com o ddNTP de seu respectivo tubo, formando fragmentos de tamanhos diferentes;
 Esses fragmentos podem ser separados e analisados através da eletroforese, com posterior revelação radiográfica.
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Os ddNTPs diferem dos dNTPs pela ausência do grupo 3’ - OH,ou seja,quando incorporados à fita há a interrupção de sua síntese
 H
OH
H
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DNA
Taq polimerase
Primers 
Tampão
Mg²⁺
dATP
dCTP
dGTP
dTTP 
(nucleotídeos)
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
MÉTODO DE SANGER
 Antes de acrescentar os ddNTPs a amostra já deve estar em grande quantidade.
94⁰C
DESNATURAÇÃO
57⁰C
ANELAMENTO
72ºC
EXTENSÃO
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 Quando um dNTP se liga ao seu nucleotídeo complementar a polimerização continua;
 Quando um ddNTP se liga ao seu nucleotídeo complementar a polimerização termina (terminalizador de cadeia). 
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SEQUENCIADORES
Estudo direto da sequencia de um gene.
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Projeto – mapea todos os genes e descreve as sequencias completas de nucleotideos
Remédio biológicos e biocombustíveis.
A Antropologia é a ciência que estuda o homem em sociedade, as culturas humanas, os comportamentos e costumes sociais.
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DESOXINUCLEOTÍDEOS TRIFOSFATADOS (dNTP)
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CADA UM É MARCADO COM UM FLUOROCROMO DIFERENTE
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Em cada ciclo pára num ponto diferente.
De acordo com a cor eu sei qual é o meu ddNTP
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1. Pedaço a ser sequenciado; Ultimo: leitura das sequencias
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As cores diferentes marcadas por um laser especificando cada base. No final sai um gráfico lido pelo computador (determinação da sequencia de DNA).
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