8.Métodos_de_analise_de_DNA[1]

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Métodos de analise de DNA
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DNA
Essa ‘molécula da vida’ existe na maioria das células em todos os organismos celulares 
Pode ser extraído das células para analise!
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Analise de DNA
Para analisar DNA, primeiramente temos que separar o DNA dos outros elementos da célula
Utilizamos enzimas (proteases) para eliminar proteínas
Um solvente orgânico tira os aminoácidos, lipídios, carboidratos da amostra
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Extração de DNA
DNA é muito estável – podemos extrair DNA de vários tipos de amostras, mesmo amostras muitas velhas
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Visualização
Depois do PCR, é necessário visualizar os resultados para ter certeza que a reação conseguiu
Usamos electroforese em agarose
Uma química chamada brometo de etidio ajuda-nos em ver o DNA
Usamos eletricidade: DNA tem carga negativa, então migra na direção do eletródio positiva
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Separação e visualização dos fragmentos amplificados pela PCR
Eletroforese
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Eletroforese em Agarose
(separação baseada em tamanho)
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O agarose é um matriz. É mais fácil para moléculas pequenas mover no matriz, então fragmentos menores de DNA migram mais rapidamente do que os maiores
Como DNA é acídico, tem carga negativa
Então migra na direção do eletrodo positivo 
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Eletroforese em Agarose
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Foto de uma eletroforese do AT3
Figura 1. Genotipagem do loco AT3 em agarose 2%. Alelo I (inserção) 245 pb e Alelo D (deleção) 177 pb. Ladder 1kb plus e 10 amostras da população brasileira.
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Como analisar DNA?
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PCR – Reação em cadeia da polimerase
Técnica que permite a amplificação de uma região específica de um determinado genoma
A amplificação da região de interesse gera quantidade de DNA suficiente para que este possa ser detectado
É a técnica básica em qualquer laboratório de Biologia e Genética Molecular
Como funciona a técnica da PCR?
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Simplesmente, PCR é replicação de DNA no laboratório
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Kary Mullis
http://www.karymullis.com/
Vou explicar para vocês a lógica da PCR.
Mistura complexa de DNA
Fragmentos sintéticos de DNA (15-25 pb) específicos para uma determinada seqüência de DNA - Oligonucleotídeos
DNA polimerase termoestável
MgCl2
dNTPs
Tampão
Ciclo de temperaturas (Desnatura ção– Anelamento de oligonucleotídeos – Extensão pela Polimerase)
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Veja a PCR acontecendo
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Produto da PCR
Ao final da reação em cadeia da polimerase o que temos no laboratório é uma grande quantidade de fragmentos da região de interesse
Só lembrando que a região de interesse é delimitada pelos iniciadores
E como escolhemos os iniciadores?
Da literatura quando alguém já os desenhou e testou
Utilizando ferramentas disponíveis na internet
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Por que fazer PCR?
Muitas vezes temos interesse em apenas uma parte o genoma
O PCR permite focar apenas nesta região
Pode ser seguido por mais testes, por exemplo, sequenciamento
Mas as vezes queremos analisar uma parte maior do genoma
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Sequenciamento: Próxima geração
Métodos para produção de quantidades
enormes de sequencias de DNA
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O DNA é fragmentado
Criando milhões
de fragmentos do
genoma
Esses fragmentos são inseridos em um flowcell (um tipo de lamina)
Várias milhões de reações de sequenciamento ocorrem de uma vez
Tudo controlado e 
detectado pelo
computador
No final, o genoma inteiro é sequenciado em pouco tempo
Pelo esse método estamos 
capazes de produzir bilhões
de pares de bases de sequencia
por dia
Aplicações
Sequenciamento de genomas
Primeira vez que o genoma humano foi sequenciado, demorou mais que 10 anos, com centenas de cientistas, custando bilhões de dólares
Agora estamos capazes de sequenciar o genoma humano durante poucos dias, com um cientista trabalhando, e com custo de menos de 10 mil dólares
O genoma humano
As vezes queremos sequenciar um sub-set do genoma: exoma
Neste caso, estamos analisando apenas
os exons de todos os genes, pois é
aqui que existe a maior probabilidade de
encontrar mutações
Estamos ignorando 98% do genoma
As vezes temos interesse apenas em
genes específicas: amplicon choice
Útil quando temos interesse em um grupo
específico de doenças
Por exemplo:
Painel de genes envolvidos em câncer
Painel de genes relacionados ao teste de
pezinho
Muito útil para diagnóstico
É útil também para análise de expressão de genes: transcritoma
Usado quando queremos saber quais genes são diferencialmente expressos entre
dois tecidos, ou entre um paciente e um controle normal
Pode ser feito também com microRNA: miRnoma
Similar ao transcritoma, só que estamos sequenciando miRNA para analisar mecanismos de controle
Projetos na UCB usando essas tecnologias
Sequenciamento de genomas de novas bactérias
Sequenciamento do genoma de eucalipto
Regiões codificantes de pacientes com doenças raras
Genomas de pacientes com diferentes níveis de resposta a quimioterapia 
Moléculas de controle de expressão gênica
Interação entre diferentes organismos
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RNA
RNA é muito menos estável
Temos que usar condições especiais com RNA para proteger
Em particular, temos que adicionar inibidores das Rnases
Enzimas que degradam RNA
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