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Preparo de Materiais em microbiologia,Meios de cultura usados no laboratório, técnicas de semeadura e Colorações Prof (a) Dr Luciana Debortoli de Carvalho Preparo de materiais Meios de Cultura • O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material • Agar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos Meios de Cultura • Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae. Meios de Cultura • Agar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfa- hemolíticas. À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. Meios de Cultura • ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. • Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: azul claro. • Colônias lactose positiva: cor amarela. • Colônias lactose negativa: cor azul. Meios de Cultura • Agar MacConkey (MC) – meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. • Lactose positiva – coloração avermelhada • Lactose negativa – coloração inalterada • Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus • Ágar Salmonela-Shigella (SS) – meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos. Meios de Cultura Meio de Rugai Este meio é utilizado para identificação presuntiva das principais espécies de Enterobactérias. Sua finalidade principal é a triagem bioquímica de colônias isoladas nos meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidase- negativa. Em um único tubo a leitura é possível verificar 9 reações: motilidade da bactéria indicado pela turvação da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentação da glicose em profundidade e da sacarose na superfície do meio, produção de gás sulfídrico (H2S), gás em glicose, utilização do aminoácido L-triptofano (desaminação), hidrólise da uréia e no tampão do tubo, um desenvolvimento de coloração avermelhada que indica a formação de indol. Meio IAL (Pessoa e Silva) Identificação presuntiva LÖWENSTEIN JENSEN • A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis). INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: verde claro • Positivo: Crescimento de colônias amarelas • Negativo: ausência de crescimento. TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS • Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura (colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material). • Finalidades do isolamento: Identificação de um microrganismo. A simples observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos microrganismos. Para isto, lançamos mão da análise de uma série de características destes, como: características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar. • Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer. • Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro. TÉCNICAS DE SEMEADURA • Métodos de Isolamento e Identificação • A identificação da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrição de suas características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e antigênicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado faz parte de uma população mista, é indispensável o seu isolamento, no sentido de obtenção de cultura pura. Métodos de Inoculação 1. Semeadura em Meio Sólidos • 1.1. Semeadura em Tubos de Ensaio (em meios inclinados) – Esgotamento de alça • 1.1.1. Técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano e/ou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo (pode também ser chamada de estriamento). Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica do esgotamento (Ex. meio de cultura: TSI) Métodos de Inoculação • 1.1.2. A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Esta técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como poderemos utilizá-la para observar funções metabólicas de algumas bactérias. Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons) + - Métodos de Inoculação • 1.1.3. Em Picada: Esta técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos (bactérias) que são submetidas a análise microbiológica. Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a técnica em picada. No tubo à esquerda, observamos o momento da picada que é realizada com o auxílio de uma agulha de semeadura e à direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de cultura: SIM). Métodos de Inoculação • 1.2. Semeadura em Placas de Petri (em superfície): O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada. Métodos de Inoculação Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a técnica de estrias múltiplas, onde a alça deverá ser deslizada sobre a região onde há um inóculo bacteriano e logo depois deve ser passada na superfície da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG, visando o isolamento bacteriano. 1.2.1. Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamentodas bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. Métodos de Inoculação • 1.2.2. Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou colônias isoladas (após diluição) utiliza-se o método de “espalhamento” em placa. Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nesta técnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a placa. Alça de drigalski Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos): • O inóculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluição da cultura em meio sólido é feito da seguinte maneira: • Retiramos o inóculo do tubo com a alça já flambada e fria. • Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa . • Colocamos o inóculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir através de estriamento (que poderá ser contínuo ou descontínuo). O estriamento poderá se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a alça duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na alça. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactérias, o que dificultará o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, após termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a alça, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a alça na última estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando- a a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo. • Flambar a alça utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado. Técnica para semeadura em meios líquidos: • Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador). • Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO. • Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria. • Flambar novamente a boca do tubo e fechar. • Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. • Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. • Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa. Técnica para semeadura em meios semi-sólidos • Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquido com o auxílio de uma alça em agulha já flambada e fria. • Abrir o tubo que contém o meio semi-sólido e semear o microrganismo através de picada até mais ou menos 1/3 ou ½ do tubo. • Fechar o tubo, identificar e levar para incubação. • Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado. Coloração de GRAM Alça Bactérias isolada Esfregaço Fixação do esfregaço pelo calor Passar a lamina c/ esfregaço por 3x sob a chama. Proceder a coloração de GRAM 1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min. 2. Escorrer excesso do corante e lavar. 3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min. 4. Escorrer excesso do corante e lavar. 5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s. 6. Escorrer excesso do corante e lavar. 7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s. 8 . Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar. Técnica de GRAM Fucsina Coloração de Ziehl-Neelsen Meio de cultura para Micobactérias Colônias de Micobactérias Esfregaço Fixação do esfregaço pelo calor Passar a lamina c/ esfregaço por 3x sob a chama. Usar capela de fluxo laminar. Proceder a coloração de Ziehl-Neelsen a) Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer até a emissão de vapores (Não deixar o corante secar). Esperar 5 minutos; b) Lavar com água corrente; c) Descorar com álcool (97%), ácido clorídrico (1%); d) Lavar em água corrente; e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; f) Lavar e secar; g) Observar ao microscópio as lâminas coradas; h) Como se apresentam os BAAR. Resultado
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