RELATORIO MICROBIOLOGIA

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ALUNA: GEOCI MARI IPARRAGUIRRE MARTINS RODRIGUES, THIAGO ROQUE, NATALIA PORTAL
TÉCNICAS LABORATORIAIS DE BIOLOGIA ESTUDOS DAS BACTERIAS EXISTENTES NA BOCA
 Tramandaí 09/04/2015
TÉCNICAS LABORATORIAIS DE BIOLOGIA ESTUDOS DAS BACTERIAS EXISTENTES NA BOCA
 
 Tramandaí 09/04/2015
 
 INTRODUÇÃO
 
 Hans Christian Gram.
O método de Gram. é uma técnica de coloração diferencial que, com o auxílio da microscopia ótica, permite distinguir os dois principais grupos de bactérias.
 Esta metodologia foi desenvolvida pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram. em 1884. Este cientista obteve, através da coloração realizada, uma melhor visualização das bactérias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método, o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram. morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse  reconhecida a devida importância ao seu método de coloração. A coloração de Gram. é baseada na composição química e integridade da parede celular bacteriana. Dependendo da cor que adquirirem, as bactérias serão classificadas em Gram-positivas (quando ficam roxas) ou Gram-negativas (quando avermelhadas). Geralmente as Gram-positivas são mais patogênicas. 
Os dois grupos de bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas
Ambas estão quase iguais no que se refere a número e importância. A diferença básica entre um tipo e outro de bactéria está na sua parede celular.
As Gram-positivas possuem parede celular com uma única e espessa camada de peptidoglicanos. Quando este tipo bacteriano entra em contato com a coloração de Gram. adquirem a cor púrpura ou azul quando fixada com cristal violeta. Isto se explica porque estas bactérias retêm o corante presente nestas substâncias.
As Gram-negativas possuem parede celular mais delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, deferente da membrana plasmática. Quando em contato com a coloração Gram. o lipídio da membrana mais externa é dissolvido no álcool e libera o primeiro corante, o cristal violeta. Ao fim do processo essas bactérias estão na cor rosa avermelhada do segundo corante, a safranina.
 As bactérias gram-positivas e gram-negativas possuem formas diferentes de ataque virulento. As gram-negativas possuem característica patológica, devido a substancia LPS.
As gram-positivas possuem a característica de aderência, devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico.
No envelope celular das bactérias gram-negativas encontramos quimicamente de 20 a 25% de fosfolipídios e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo. Desde o trabalho original de Hans Gram., vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como:
A existência de um substrato Gram-positivo e específico;
As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam 
 Diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta;
A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos micro-organismos Gram-positivos e Gram-negativos.
Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto às dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parece ser determinante do resultado final da coloração de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.
As bactérias que têm a parede celular composta por peptídeoglicano , durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeo e lipoproteínas) perdem o complexo iodo, assumindo a cor do corante de fundo.
 
 
MATERIAL USADO PARA COLETA DE SWUAB E PARA COLETA DE MATERIAL PARA COLONIA
ESFREGAÇO DA BOCA
HASTE PLASTICA 
LAMINA 
 
 
Procedimento do método de Gram:
	Soluções em ordem de aplicação
	Reação do aspecto das bactérias  Gram-positivas
	Reação do aspecto das bactérias  Gram-negativas
	Cristal violeta
	Coradas em violeta
	Coradas em violeta
	Solução de Iugol
	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
	Álcool-acetona
	Desidratação da parede
celular, diminuição da
porosidade e da
permeabilidade; o
complexo CV-I não pode sair da célula, que   permanece violeta
	Extração dos lipídeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I é removido da célula
	Fucsina ou safranina
	  A célula não é afetada, permanece violeta
	A célula adquire o corante, tornando-se vermelha
Esfregaços
O primeiro passo é o preparo do esfregaço bacteriano que foi coletado 1ª da cavidade bucal meio líquido Foi realizada a coleta de secreção da boca para realização do método de gram. com auxilio de uma haste foi retirado da cavidade bucal o material a ser examinado.
Foram observados diplococos, cocos, bastonetes e um pedaço de célula.
 
COLETA DO MATERIAL
 
FOI OBSERVADO POR MICROSCOPIO E ATRAVES DA COLORAÇÃO DE GRAM
 
O segundo foi coletado do RU da universidade na bancada onde existe os alimentos partir desse procedimento iniciou-se a colônia de bactérias. Os esfregaços devem ser preparados com uma gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características do agrupamento. Utilizar, de preferência, lâminas limpas. Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso.
METODO DE GRAM EM CULTURA 
A partir de Colônias Bacterianas:
Colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;
Tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na gota salina colocada na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo (ESFREGAÇO);
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;
A partir de Culturas em meio líquido:
Colocar uma “alçada” da cultura na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo;
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;
Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. 
Depois disso é feito a coloração do esfregaço através do método de Gram. Esse método deve proceder da seguinte forma:
Cubra o esfregaço com violeta a e deixe por aproximadamente 15 segundos;
Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta e deixe agir por 45 segundos;
Escorra o corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
Adicione álcool etílico sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Deixe secar aoar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo; sempre escorrendo nunca passe o papel na lamina.
Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; Leia em objetiva de imersão (100 X)
Materiais Clínicos
Primeira coleta retirada com swap secreção coletada da boca realizada coloração de gram onde foram observadas cocos e bastonetes 
A segunda coleta com swap foi utilizada uma amostra coletada no ru da universidade para proliferação de colônia de bactérias foi observada uma colônia de vibriões .
.
Observamos que houve a proliferação de colônia de bactérias 
Microscópio
Utilização
Para bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios sólidos ou líquidos.
Na verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços Da boca e observação de colônias coletadas no campus ulbra torres.
Vibrião
Bactéria
Vibrião, ou vibrio é um tipo de bactéria dotada de mobilidade, em forma de bastonetes curvos, como uma vírgula. As células podem se ligar uma à outra, formando a letra "S".
Classificação superior: Vibrionaceae
Classificação: Gênero
Classificações inferiores: Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, mais
O vibrião da cólera é Gram-negativo e tem a forma de uma vírgula com cerca de 1-2 micrómetros. Possui flagelo locomotor terminal. 
Estes vibriões, tal como todos os outros, vivem naturalmente nas águas dos oceanos, mas o seu número é tão pequeno que não causam infecções.
O vibrião é ingerido com água suja e multiplica-se localmente no intestino delgado proximal. Causa diarréia aquosa intensa devido aos efeitos da sua poderosa enterotoxina. Esta toxina tem duas porções A e B (toxina AB). A porção B é especifica para receptores presentes na membrana do enterócito, causando a sua endocitose (englobamento e internalização pela célula).
 A porção A, é a toxina propriamente dita, ela atua causando uma ADP-ribosilação na subunidade catalítica da proteína G, impedindo sua capacidade de hidrolisar o GTP ligado a ela, o que leva a uma superativação da enzima adenilato ciclase e provoca um aumento abrupto dos níveis de AMPc intracelulares. O AMPc é um mediador que se liga à proteocinase A, que, por sua vez, ativa outras proteínas que afetam os canais de cloro, provocando a secreção de cloro,sódio e água associada descontrolada pela célula no lúmen intestinal. O vibrião não é invasivo e permanece no lúmen do intestino durante toda a progressão da doença.
O cólera é uma infecção intestinal aguda causada pelo Vibrio cholerae, que é uma bactéria capaz de produzir uma enterotoxina que causa diarréia. Apenas dois sorogrupos (existem cerca de 190) dessa bactéria são produtores da enterotoxina, o V. cholerae O1 (biotipos "clássico" e "El Tor") e o V. cholerae O139.
O Vibrio cholerae é transmitido principalmente através da ingestão de água ou de alimentos contaminados. Na maioria das vezes, a infecção é assintomática (mais de 90% das pessoas) ou produz diarréia de pequena intensidade. Em algumas pessoas (menos de 10% dos infectados) pode ocorrer diarreia aquosa profusa de instalação súbita, potencialmente fatal, com evolução rápida (horas) para desidratação grave e diminuição acentuada da pressão sanguínea.