Genética de microrganismos procariotos e Engenharia Genética

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Genética de microrganismos procariotos e Engenharia Genética
Genética:
- Transferência de hereditariedade para as próximas gerações (transmissão vertical)
- Transferência de hereditariedade entre organismos distintos (transmissão horizontal)
- Características, como morfologia, reações bioquímicas, motilidade são controladas pelo material hereditário. 
 Então para compreender como os microrganismos funcionam deve-se conhecer como os genes codificam a informação.
O DNA apresenta diferentes conformações, são elas denominadas como A-DNA, B-DNA e Z-DNA. 
O DNA do tipo A tem a forma mais curta e mais grossa, e para completar uma volta na hélice são necessários 11 pares de bases;
O DNA do tipo B é necessários 10 pares de bases para completar uma volta na hélice, além disso, a dupla hélice é mais longa e mais fina. 
A forma Z-DNA apresenta seu sentido de rotação para a esquerda
- Dogma central da biologia:
Replicação: 
- O DNA possui duas funções principais: controlar a própria replicação durante a divisão celular e controlar a transcrição de moléculas complementares. 
- Replicação de DNA circular: a replicação é bidirecional, há duas forquilhas de replicação no cromossomo circular.
Transcrição:
- Ocorre no citoplasma de procariotos, enquanto, nos eucariotos a síntese e a maturação ocorrem no núcleo.
- Uma das fitas do DNA é molde para a síntese de RNAm.
- A transcrição nos procariotos (minutos/segundos) é mais rápido que nos eucariotos (horas).
- A RNA polimerase se liga ao DNA quando encontra uma sequência específica, o promotor. 
 RNAs e funções
- RNA (RNA mensageiro): transcrição do DNA: dirigir síntese de polipeptídeos nos ribossomos (tradução) 
- RNA (RNA ribossomal): componente de ribossomos, envolvido em estrutura e função ribossomais.
- RNA (RNA transportador): envolvido na tradução, entregando aminoácidos para o ribossomo.
- RNA associado com proteínas: formam ribonucleoproteínas – envolvido no processamento pós-transcricional de outros RNAs; 
- Pequenos RNAs (sRNA): regulação da expressão gênica; atuam inibindo ou ativando a tradução; 
- RNA de vírus: frequentemente substitui o DNA como transportador de info hereditária; genoma de RNA.
Tradução: 
- O RNA mensageiro é molde para a síntese proteica.
OBS: a melhor forma de classificar organismos é pelas sequências genômicas, no entanto têm-se uma dificuldade já que 99% das spp. De microrganismo não podem ser cultivadas por técnicas padrões.
Genética dos Procariotos:
- O genoma é composto por um ou mais replicóns.
 É DNA que se duplica como uma unidade individual.
- Elementos extra-cromossomais: bacteriófago e plasmídeos. 
- Os cromossomos e os Plasmídeos possuem tamanhos e formas diferentes até mesmo dentro do mesmo gênero.
- Uma bactéria possui de 500 000 a 10 000 000 de pares de base.
- Cromossomos primários: maioria dos genes essenciais 
- Cromossomos secundários: um ou diversos genes essenciais.
Plasmídeo:
- Replicón (replicação automática)
- DNA de fita dupla, circular ou linear.
- 1000 Pb a 100 000 Pb. 
- A função está relacionada à maior variabilidade de genes (maior chance de sobrevivência) 
- Os plasmídeos codificam genes não essenciais, mas que confere vantagens, como:
Resistência a antibiótico
Genes para virulência (isso para bactérias patogênicas)
Genes para proteção da célula (por exemplo, contra metais pesados)
Genes para metabolismo de fontes de carbono alternativas 
OBS: São usados como VEICULOS para transferência de genes.
Plasmídeo autônomo 
Plasmídeo integrativo (epissomos): integram-se ao DNA bacteriano ao longo de numerosas divisões celulares. 
Plasmídeos Conjugativos: Promove a conjugação sexual, presença de genes de transferência.
Plasmídeo não conjugativos: ausência de genes de transferência e possui co-transferência com plasmídeo conjugativo.
- Os plasmídeos também podem ser classificados de acordo com a função desempenhada por eles:
Plasmídeos de Fertilidade (F): Plasmídeos com a função de iniciar a conjugação;
Plasmídeos de Resistência (R): Plasmídeos relacionados com a resistência a antibióticos;
Plasmídeos de degradação: Plasmídeos que garantem à célula a capacidade de produzir enzimas degradativas;
Plasmídeos de virulência: Garantem à célula a capacidade de causar doenças;
Plasmídeos Col: Plasmídeos que possuem genes que determinam a síntese de inibidores (colicinas) de bactérias.
- Mecanismo de replicação: há dois tipos
 Em qualquer tipo a replicação ocorre em um ponto específico (origem de replicação – oriV) a qual determina várias das propriedades dos plasmídeos 
Circulo rolante:
- A proteína de replicação se liga ao sítio da origem e cliva umas das fitas e liga a extremidade 5’.
- A extremidade 3’ livre gerada serve de iniciador para a replicação pela DNA polimerase III.
- A proteína de replicação então cliva novamente a nova oriV gerada, gerando um DNA fita simples circular.
- Unidirecional
Do tipo teta
- Depende de proteínas que reconheçam a região oriV.
- A abertura das fitas na oriV é seguida da montagem de duas forquilhas de replicação, podendo ser unidirecional ou bidirecional.
- Plasmídeo Recombinante: são importantes na Biotecnologia (técnica de DNA recombinante). Nessa, técnica isola genes de interesse para seres humanos e insere-os em plasmídeos. Depois esse novo plasmídeo e inserido em uma bactéria que se reproduz e inicia a produção da proteína desejada.
Exemplo: produção de insulina
- Elementos móveis promovem evolução do genoma: Plasmídeos, bacteriófago e transposons. 
 Esses elementos pode se mover de um organismo para o outro, adicionando genes ao genoma do organismo receptor. Transportadores de genes para resistência aos antibióticos, toxinas, metais pesados, ou qualquer outro gene trazendo novas atividades para a célula. 
 O transposon depende da atividade da enzima transposase que realiza um rearranjo cromossômico, como deleção e inversão.
 O sitio de inserção no genoma pode ser randômico (que depende do acaso ou de variáveis imprevisíveis) ou específico.
- Variabilidade:
Mutações: mudança no material genético que é transferida para a nova geração.
 Selecionáveis e não selecionáveis. 
- Mutante auxotrófico é um organismo que não tem capacidade para sintetizar um composto orgânico específico necessário ao seu crescimento.
- Mutante prototrófico: são capazes de sintetizar todos os compostos necessários ao seu crescimento. 
OBS: Pode-se fazer a seleção dos organismos mutantes.
- As mutações podem ser pontuais (um par de base) ou em grande numero de Pb.
Pontuais: Substituição, micro inserção e micro deleção.
Grande: rearranjo, deleção e inserção.
- As mutações podem ser de dois tipos:
Espontâneas (mecanismos endógenos) 
Induzidas (agentes externos) – agentes químicos, agentes físicos e agentes biológicos.
- Consequências da mutação: resistências às drogas, resistência às fagos, deficiências nutricionais, alteração do metabolismo, alterações morfológicas, alterações na composição química. 
Recombinação: a transferência horizontal de genes antecede a recombinação
- A transferência ocorre quando os genes são transportados de uma célula para outra, de maneira distinta do processo hereditário usual.
 Em procariotos, essa transferência pode ser de três tipos: transformação, transdução e conjugação.
Transformação: Célula capta DNA livre no meio decorrente a lise de outra célula.Transferência vertical de genes VS Transferência horizontal 
A vertical ocorre quando a célula se divide. Já a transferência horizontal ocorre quando a célula doadora transfere seus genes para a célula receptora.
- organismos da mesma espécie capturam DNA livre.
- Membrana celular pode captar o DNA quando estiver mais permeável: no estado de COMPETÊNCIA
OBS: Os métodos mais usados para se induzir artificialmente à competênciasão: Eletroporação, choque térmico, DNA e sais e Biobalística.
Mas em Gram negativas é feita por aumento da concentração de CaCl2 e aumento da temperatura.
- DNA do doador alinha com DNA do receptor e insere os genes no genoma do receptor (recombinação homóloga)
Transdução: A transferência de material genético ocorre por meio de vírus bacteriófago.
- Existem dois mecanismos de transdução: generalizada, em que qualquer gene pode ser transmitido, e restrita, que se limita a alguns genes específicos.
- nem todo organismo é transduzível 
Conjugação: Ocorre a transferência de plasmídeo.
- Necessita de contato célula a célula.
- Nas Gram negativas é mediada pelo pilus F e nas Gram positivas mediadas por moléculas aderentes na superfície 
- Região Tra tem a função de: sintetizar pillus, exclusão de superfície, estabilização de par conjugativo e transferência de DNA e Regulação.