Resumo - Fatores de virulência

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Resumo: Fatores de Virulência nos fungos e defesa do hospedeiro
Os fungos habitam diferentes nichos e um número deles pode viver como simbiontes, comensais ou em parasitismo. Estima-se a existência de 1.500.000 espécies de fungo no planeta, mas somente 100.000 - 200.00 foram descritas. Mais ou menos 200 espécies podem ser patogênicas para o homem.
O hospedeiro oferece condições diferentes daquelas encontradas no nicho ecológico, assim o fungo tem que lançar mão de fatores que proporcionem a sobrevivência no hospedeiro. As condições encontradas no hospedeiro são: altas temperaturas, influências hormonais, ataque pelos fagócitos, microbiota competidora, pH, barreiras físicas e mecânicas e outras.
Fatores de virulência são atributos do fungo que proporcionam aos mesmos sobreviver em condições adversas e causar doença. Para um organismo causar doença: tem que entrar no hospedeiro (trato respiratório, inoculação no tecido – pele e mucosa); aderir, se multiplicar no tecido, invadir e evadir do sistema imune; causar dano – Todas essas etapas dependem dos fatores de virulênciaque o fungo usa.
MECANISMOS DE EVASÃO DO SISTEMA IMUNE 
Pacientes imuno comprometidos são os principais alvos para infecções fúngicas. Na histoplasmose - H.capsulatum regula o pH do fagolisossoma (aumenta o pH para6.0 – 6.5), diminuindo a ação das enzimas lisossomais, e aumentando a captação de ferro dentro do fagolisossoma.
Os patógenos fúngicos apresentam mecanismos ativos e passivos para frustrar aresposta imune, como: formação de tubo germinativo dentro do macrófago, produção desuperóxido dismutase e catalases na defesa contra radicais oxidativos, cápsula comobarreira fagocitária, bloqueio da acidificação do fagolisossoma por H. capsulatum e também a proteína CBP1 está envolvida na alteração da membrana do fagolisossoma; inibição da maturação do fagolisossoma e da produção de espécies reativas de oxigênio;redução na deposição de complemento na superfície celular; mascarar moléculasimunogênicas (ativam o sistema imune) na superfície da célula.
 
minirevisão(Casadevall e Pirofski – 2007)
Por que somente certos micro-organismos tem a capacidade de serem virulentos e por que certos micro-organismos são virulentos em certos hospedeiros? Existem diferençasfundamentais entre micro-organismos patogênicos e não patogênicos. Essa visão ésuportada pela observação que certos micro-organismos requerem fatores, como toxinas,cápsulas, etc., para virulência animal. Existem claras evidências que virulência pode ser uma função do “status” imune do hospedeiro. Para micro-organismos que causam doençauma vez e outra não, o determinante da doença é normalmente um desafio no hospedeiro que altera a interação parasita-hospedeiro.
Dois tipos de aquisição: Micro-organismos que são adquiridos a partir de outrosorganismos vivos e aqueles que são adquiridos do ambiente. Quando alguns micro-organismos encontrados em mamíferos causam doença, esse fato é devido a uma alteração no relacionamento parasita-hospedeiro (imunossupressão, uso de antibióticos, mudanças no nicho em decorrência de uma grande carga fúngica). As doenças causadas por micro-organismos ambientais normalmente acontecem emsituações nas quais o hospedeiro é exposto a grande quantidade de inóculo e/ouapresenta um comprometimento do sistema imune.
Virulência de fungos associados ao hospedeiro: Ex: Candida
Doença causada por esses fungos normalmente estão associados com mudanças na imunidade do hospedeiro ou do relacionamento fungo-hospedeiro. Ex: Candidíase humana – Alteração na barreira física ou imunidade na mucosa (como ocorre em cirurgias, colocação de cateter, dano induzido por radiação; Candidíase vaginal –  aumento do influxo de neutrófilos dentro da vagina. Uso, por exemplo, de antimicrobiano altera o equilíbrio entre a flora bacteriana- fungo, por reduzir onúmero de comensais bacterianos, resultando na excessiva proliferação dessas leveduras.
Muitos dermatófitos fazem parte da flora normal e ainda podem estar associados adoenças quando ocorre uma alteração com o hospedeiro. (Ex: aumento de umidade e temperatura nos pés). Alguns isolados são mais virulentos, aumento da susceptibilidade do hospedeiro ou ambos. 
Solo como ambiente extremo: Os micro-organismos que habitam o solo devem se adaptar a mudanças bruscas (temperatura, oferta de nutrientes, radiação, umidade e tambémpredadores na forma de amebas e outros protistas). Os micro-organismos utilizam mecanismos para escapar da fagocitose e digestão por esses predadores. As adaptações usadas pelos micro-organismos no ambiente, certamente podem ser utilizadas comofatores de virulência.
Manuscrito Casadevall – 2007
Determinantes de virulência em fungos patogênicos.
O dano no hospedeiro pode ocorrer pela ação direta do micro-organismo no hospedeiro ou como resultado da resposta imune ao mesmo ou ambos. Ex: de dano ocorrido pelo fungo: prolongamento da hifa com destruição do tecido, secreção de toxinas (gliotoxinaem  Aspergillus spp). Doença fúngica causada pela resposta imune: alergia causada pelofungo, sinusite, fibrose tecidual e outros.
Um determinante de patogenicidade é um fator de virulência e esse normalmente é o alvodas respostas imunes e respostas que neutralizem esses fatores são protetoras. 
A temperatura corporal dos mamíferos permite a baixa susceptibilidade às doençasfúngicas, uma vez que os fungos crescem melhor a temperatura ambiente Ao contrário das doenças bacterianas, virais e parasitárias, as doenças fúngicas são esporádicas e observadas primariamente em indivíduos com deficiência imunológica,quando ocorre uma alteração na ecologia ou uma exposição ao inóculo muito grande.
Fatores de Virulência nos fungos
TERMOTOLERÂNCIA
Habilidade de crescer a 37C. Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans,Sporothrix schenckii , Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis.
Proteínas “Heat-Shock” – são importantes para a termo-adaptação mas também para atransição micélio-levedura nos fungos termodimórficos. Ocorre um aumento
PAREDE CELULAR
Proteção mecânica, osmótica, sítios de diferentes antígenos, enzimas, alvo para drogaantifúngica, sítio de alguns fatores de virulência.É composta principalmente por polissacarídeos ( β -glucanas e quintina), glicoproteínas,lipídios.
RECEPTORES HORMONAIS
Receptores para 17 β-estradiol no citoplasma de células fúngicas. 
17 β-estradiol estimula o crescimento de C. immitis, alterando a taxa de maturação de esférulas e liberação de endósporos. O fungo apresenta receptor para o hormônio no citoplasma.
 Testosterona e progesterona pode induzir o crescimento do fungo. 
Ambos os sexos apresentam o mesmo contato com Paracoccidioides. Brasiliensis, porém a frequência da paracoccidioidomicose em homens é muito maior. Somente até apuberdade a incidência da doença é a mesma entre os dois sexos. Receptores para 17 β-estradiol foram encontrados no citosol de micélio e levedura de P. brasiliensis , e que essehormônio afeta a transição de micélio para a forma parasitária de levedura , logo asmulheres após a puberdade são menos afetadas.
 MELANINA
Pigmentos como a melanina são produzidos por uma variedade de organismos, como bactérias,  fungos, plantas e animais. São compostos carregados negativamente,hidrofóbicos, de alto peso molecular, insolúveis em solventes orgânicos e aquosos.
São formados pela polimerização oxidativa de compostos fenólicos/indólicos enormalmente apresentam uma cor que vai do marrom escuro ao preto.
Alguns fungos podem produzir melanina no solo e essa característica pode proporcionar aumento da resistência às condições de estresse no ambiente. C. neoformans melanizado é mais resistente a ingestão por amebas ou parasitas presentes no ambiente. Esse pigmento também pode proteger o fungo de enzimas hidrolíticas, UV, radiação solar ou gama, temperaturas extremas, metais pesados e diversos outros compostos tóxicos. 
Alguns pesquisadores tem demonstrado que melanina afeta a fagocitose pelosmacrófagos e reduz a liberação de citocinas pró-inflamatórias,nas quais são importantesno combate a infecções causadas por fungos.Melanina pode ser encontrada nos espaços intracelulares ou extracelulares dos fungos.Pode ser observada na parede celular em associação com componentes dessa parede;como grânulos que se projetam para a camada externa da parede; ser excretada para omeio ou mesmo no citoplasma da célula.
Evasão das defesas do hospedeiro:
1)Fungos melanizados são mais resistentes a fagocitose por macrófagos –melaninas são polímeros carregados e hidrofóbicos, e sua presença na parede celular altera a carga da superfície do fungo e esse fato pode interferir com a fagocitose.
2) Aumenta a resistência aos processos microbicidas dos fagócitos – Proteção contra a injúria causada pelos radicais livres de oxigênio e nitrogênio. Todos essescompostos são liberados na explosão respiratória dos macrófagos, quando ocorre a fagocitose e consequente formação do fagolisossoma para a destruição demicro-organismos fagocitados. Melaninas são “sequestradores” desses radicaislivres, tóxicos para a célula fúngica.
3)Proteção também contra os peptídeos microbicidas liberados pelos fagócitos, pois o pigmento é capaz de absorver essas moléculas, impedindo que atinjam o alvo.
4) Proteção contra drogas antifúngicas – Anfotericina B – diminuindo apermeabilidade dessa droga, através da parede. 
Alguns fungos que produzem melanina: Cryptococcus neoformans, Paracoccidioidesbrasiliensis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Aspergillus spp.
CÁPSULA
Polissacarídeo capsular, o principal fator de virulência do fungo oportunista Cryptococcus neoformans. Essa característica é encontrada, entre os fungos,somente em C. neoformans.
 Localiza-se e na  porção externa  da  parede  celular, porém  pode  ser liberada,  se acumulando no tecido durante a infecção.
Estrutura: Contém 2 principais polissacarídeos - glucuronoxilomanana (GXM) e galactoxilomanana (GalXM). GXM é um polímero linear de manose com ramificações de ácido glucurônico e xilose e grupos O-acetil e de alto peso molecular. GalXM é um polímero linear de galactose, que contém ramificações de galactose, manose e xilose.
 A composição e a estrutura da cápsula podem variar entre os isolados de C. neoformans, e esta característica agrupa os isolados em sorotipos (A, B, C, D e AD).
C.neoformans modula a espessura da cápsula em resposta as condições ambientais. Ocorre indução do crescimento da cápsula por limitação de ferro, presença de soro, meio com baixa disponibilidade de nutrientes, CO2 e pH básico. Algumas condições associadas à repressão da formação da cápsula são altas concentrações de glucose, aumento da pressão osmótica ou meio rico em nutrientes.
Contribuições importantes da cápsula: proteção contra fagocitose, diminui orecrutamento de leucócitos para o sítio de infecção, diminui a produção de anticorpos, proteção contra dessecação no meio ambiente, importante para formação de biofilme.
 As propriedades anti-fagocíticas de GXM poderia ser, parcialmente, devido à repulsão eletrostática entre a levedura capsulada e as células fagocíticas. A GXM é capaz de ativar a via alternativa do complemento, porém essepolissacarídeo é liberado pelo fungo no hospedeiro causando uma ligação e aconseqüente depleção de opsoninas (moléculas que aumentam a fagocitose pelos macrófagos) produzidas pela ativação dessa via. GXM inibe a migração de neutrófilos para o sítio de infecção – esse polissacarídeo induz a perda de moléculas de superfície dos neutófilos, que são responsáveis pela adesão ao endotélio vascular e consequente migração dos neutrófilos para o sítio de infecção. Esse fato ocorre na criptococose disseminada. 
ADESINAS 
A aderência é o primeiro passo nos processos infecciosos, sendo assim, é necessário que o fungo expresse diferentes moléculas na superfície que serão responsáveis por esse processo. Essas moléculas são conhecidas como adesinas e apresentam umaexpressão diferencial na fase levedura e na fase hifa. O processo de adesão éimportante para a colonização e posterior invasão dos fungos no tecido hospedeiro. 
Ex: Gp43, de P. brasiliensis,promove ligação a laminina (promove a adesão amembrana basal ou a outras moléculas da matriz extracelular), sendo assim, ligação da gp43 a laminina facilita a adesão e disseminação do fungo para outros tecidos.
ENZIMAS HIDROLÍTICAS
Nas últimas décadas, as enzimas dos patógenos microbianos tem merecido atenção para o seu potencial papel na patogênese, e como possível alvo para confecção de inibidores sintéticos que possam tratar as infecções.
Fungos secretam Proteases, Lípases e Fosfolipases no meio. Essas enzimasdesempenham papel importante no metabolismo dos fungos, porém podem estar envolvidas na patogênese da infecção, causando dano ao hospedeiro e suprindo nutrientes necessários para o fungo.
Proteases
Os fungos elaboram uma ampla variedade de enzimas e as proteases são ativas em uma ampla faixa de pH (pH 4 a 11) e exibem uma ampla especificidade de substratos.
As proteases podem ser subdivididas em dois principais grupos: exopeptidases eendopeptidases, dependendo do seu sítio de ação. As exopeptidases clivam ligações peptídicas próximas aos terminais amino e carboxi do substrato e as endopeptidasesclivam ligações peptídicas distantes dos terminais. Baseado também no grupofuncional presente no seu sítio ativo, as proteases são classificadas em serinaproteases, aspártico proteases, cisteína/tiol proteases e metaloproteases (requeremum íon divalente em seu sítio ativo). Alguns inibidores das classes de proteases são ferramentas importantes para uma futura terapia antifúngica.
Funções fisiológicas das proteases: Síntese e degradação de proteínas, participaçãona esporulação, germinação do conídio, nutrição (hidrólise de polipeptídeos empequenos peptídeos e aminoácidos), regulação da expressão gênica;
 As proteases são consideradas também um importante fator de virulência fúngico,uma vez que podem auxiliar o fungo na invasão tecidual e no escape do sistemaimune do hospedeiro.
 As proteases mais bem estudadas e discutidas são as Aspártico proteases secretadas (Saps) de Candida albicans. Essas enzimas facilitam a invasão e a colonização do tecido hospedeiro, rompendo a mucosa e degradando proteínas componentes da defesa estrutural e imunológica: lactoferrina da saliva, imunoglobulinas, enzimas da explosão respiratória no macrófago, proteína C3 do sistema complemento, colágeno,fibronectina, laminina e outras. Apresentam expressão diferencial nos diferentes tiposde infecção por C. albicans.
Fosfolipases
O termo fosfolipase descreve um grupo heterogênio de enzimas com habilidade dehidrolisar 1 ou mais ligações éster nos glicerofosfolipídeos. A diferença das váriasfosfolipases é baseada no modo de ação e alvo dentro dos fosfolipídeos, que são osprincipais componentes das membranas biológicas. As subclasses são Fosfolipases A, B, C e D.
Vários estudos já demonstraram a presença de fosfolipases nos fungos Candida spp, Cryptococcus neoformans e  Aspergillus fumigatus. 
Em Candida albicans, a principal atividade fosfolipase foi detectada nos meios decultura e foi devido a Fosfolipase B (PL B). A expressão dessa enzima pode ser regulada por suplementação nutricional, temperatura, pH e fase de crescimento dascélulas de C. albicans. As funções da PLs durante a infecção não são precisamenteentendidas, mas acredita-se que estejam envolvidas na penetração na célulahospedeira, adesão e invasão à célula epitelial. C.albicansm que não possuem atividadefosfolipase, apresentam uma menor virulência.
Lipases 
As lipases catalisam a hidrólise e síntese de triglicerídeos. Algumas funções daslipases extracelulares, nos micro-organismos, incluem a digestão de lipídios paraaquisição de nutrientes, adesão ao tecido hospedeiro, interações sinergística comoutras enzimas, iniciar processos inflamatórios.
DIMORFISMO E MUDANÇA FENOTÍPICA
Depende da alteração de temperatura ou nutrientes, favorecendo a instalação do fungo. 
Os fungos termodimórficos representam uma família de seis ascomicetosrelacionados filogeneticamente: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasmacapsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii e Penecilliummarnefeii. Esses patógenos são capazes de converterem a forma saprofíticafilamentosa (hifa e conídios), encontrada no meio ambiente, para a forma patogênica de levedura (ou esférula em C. immitis) quando dentro do hospedeiro a 37ºC. Essa conversão morfológica no fungo termodimórfico é requerida para virulência.
 A conversão pode oferecer proteção contra a morte por neutrófilos e macrófagos. Os neutrófilos são mais eficientes em matar conídios do que leveduras.
 A mudança de morfologia nesses fungos também é acompanhada por uma mudança de expressão de moléculas de superfície e esse fato é conhecido como mudança fenotípica. Ex: aumento de α-glucanas na parede celular da forma de levedura com consequente diminuição de β-glucanas. Esse processo é correlacionado com aumento de virulência, pois as α -glucanas se sobrepõem às β-glucanas, diminuindo o efeitoimunoestimulador destas (Os macrófagos apresentam receptores para β-glucanas euma vez ligadas a esses receptores, ocorre uma sinalização para produção decitocinas pró-inflamatórias pelo macrófago)
α-glucanas na parede celular das leveduras de fungos termodimórficos – 
a) mascara componentes da parede celular.
b) Pode também ser responsável por proteger o fungo das enzimas digestivas dosfagócitos (beta-glucanases), impedindo a hidrólise de beta-glucanas da parede.
c) Impede que as β-glucanas da parede dessas leveduras, se liguem aos receptoresno macrófago, diminuindo a produção de citocinas pró-inflamatórias.
B. dermatitidis expressa, quando na fase de levedura, uma molécula conhecida como
BAD1, com função de adesina e importante para virulência. Essa molécula induz adiminuição de citocinas pró-inflamatórias e aumento de citocinas anti-inflamatórias, promovendo a progressão da infecção.
H. capsulatum expressa, na fase de levedura, uma molécula conhecida como
CBP1 (proteína de ligação ao cálcio), que é essencial para crescimento e sobrevivênciadentro do macrófago.
Dimorfismo invertido em Candida albicans
 Entre os fatores de virulência estudados em C. albicans, o dimorfismo está entre eles.Esse fungo é capaz de crescer como levedura ou na forma de hifa e pseudohifa. Essamudança morfológica (levedura →hifa), que não está associada à mudança natemperatura, como descrito anteriormente, também contribui para a expressãodiferencial de adesinas (proteínas da superfície que estão envolvidas noreconhecimento e adesão) e proteases (envolvidas na invasão tecidual). A hifatambém promove uma força mecânica para invasão tecidual ou escape do interior dos macrófagos.
BIOFILME
Na maioria dos ambientes naturais, os micro-organismos existem predominantementecomo biofilme.
Biofilme são comunidades microbianas estruturadas, fixadas a uma superfície. Os microorganismos em um biofilme são embebidos dentro de uma matriz de polímerosextracelulares (carboidratos, proteínas, fósforo e hexosaminas e água). São menossusceptíveis a os agentes anitimicrobianos.
Placa dentária, superfície de cateteres, válvulas cardíacas.
O biofilme nas infecções pode ser composto por uma única espécie microbiana ou por uma mistura de bactéria e fungo.
O biofilme formado por Candida albicans tem sido o mais estudado, uma vez que essegênero pode ser causador de infecções superficiais e também profundas. Podemosencontrar no biofilme formado por Candida albicans, leveduras ovais, hifas e pseudohifas. É um importante agente de infecções nosocomiais. Pode ser encontrado formandobiofilme em cateteres urinários, de infusão parenteral, tubo intratraqueal, dentaduras.Esse agente pode ser introduzido pela própria pele do paciente ou pelas mãos deprofissionais da saúde.
a) Resistência a drogas – antibióticos, antisépticos e biocidas industriais.Possíveis mecanismos: 1) Penetração restrita através da matriz; 2) mudança fenotípicaresultante do aumento no crescimento ou limitação de nutrientes, isto é ocorre umaadaptação pela mudança de moléculas expressas na superfície e assim modificação dasusceptibilidade a droga e 3) expressão de genes de resistência induzida pelo contatocom a superfície.(expressão da bombas de efluxo multidroga resistente).
b)Proteção contra a resposta imune
Formação de biofilme maduro e produção da matriz extracelular é fortemente dependente da espécie, do isolado, e das condições ambientais (pH, composição do meio (glucose elipídio) e oxigênio).